楊秀偉，謝　靖，鐘　鳳，韓彥弢（青島大學(xué)1.藥學(xué)院、2.附屬醫(yī)院、.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、.口腔醫(yī)學(xué)院，山東青島　266000）

左卡尼汀抑制NF-κB
敏化TRAIL誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞凋亡

楊秀偉1，2，謝靖3，鐘鳳4，韓彥弢3
（青島大學(xué)1.藥學(xué)院、2.附屬醫(yī)院、3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、4.口腔醫(yī)學(xué)院，山東青島266000）

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-4-26 11：06網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160426.1106.028.html

目的探討左卡尼汀作為TRAIL（tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand）敏化劑，增強TRAIL對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞誘導(dǎo)凋亡的效果，并對其敏化作用的機制進行研究。方法以U87為神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞模型，通過CCK-8檢測細胞活性，Annexin V-FITC/PI染色、caspase-3表達及活性等指標(biāo)檢測細胞凋亡，通過RT-PCR、Western blot對NF-κB（nuclear factor kappa B）和c-FLIP（FLICE抑制蛋白）的轉(zhuǎn)錄與表達進行分析，沉默NF-κB，分析其與c-FLIP的關(guān)系。

結(jié)果TRAIL與左卡尼汀聯(lián)用，癌細胞存活率明顯下降，凋亡明顯上升；聯(lián)用組與對照組相比，c-FLIP的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達以及NF-κB的轉(zhuǎn)錄均有明顯降低；沉默NF-κB證明其為c-FLIP上游因子。結(jié)論左卡尼汀與TRAIL可以產(chǎn)生協(xié)同作用，誘導(dǎo)U87細胞凋亡，其敏化機制與抑制NF-κB信號通路以及其下游c-FLIP表達有關(guān)。

左卡尼??；TRAIL；NF-κB；c-FLIP；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；凋亡

左卡尼汀是一種廣泛存在于機體組織內(nèi)的氨基酸衍生物，是哺乳動物能量代謝必需的體內(nèi)天然物質(zhì)，主要分布在哺乳動物的骨骼肌以及心肌中。人體可以通過膳食補充左卡尼汀，肉類、禽類、魚類以及乳制品都富含左卡尼汀，而蔬菜和谷物中左卡尼汀的含量較少［1］。左卡尼汀主要功能是促進機體脂類代謝，在能量生成的過程中起著至關(guān)重要的作用，它可以協(xié)助活化的脂肪酸進入線粒體基質(zhì)進行β氧化產(chǎn)生能量，并進一步輔助中間產(chǎn)物輸出線粒體，以防止中間產(chǎn)物的聚集［2］。近期研究表明，左卡尼汀除了參與能量代謝，還可以調(diào)控細胞的程序性死亡。Fan等［3］報道：左卡尼汀可以選擇性誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡而對正常肝細胞沒有任何不良影響。截止目前，對左卡尼汀誘導(dǎo)癌細胞凋亡的機制，尚無深入研究。

多形性成膠質(zhì)細胞瘤（GBM）被世界衛(wèi)生組織分類為四級星形細胞瘤，占所有星形細胞瘤的50%，是一種極為普遍且極具侵襲性的惡性膠質(zhì)瘤［4］。其治療措施包括手術(shù)、放療、化療等，但由于GBM的基因多樣性以及其復(fù)雜的分子病理，GBM患者會不同程度的對治療產(chǎn)生抵抗［5-7］。因此，目前治療惡性膠質(zhì)瘤成為腫瘤領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)之一。近期已有研究發(fā)現(xiàn)：針對特異性分子信號通路的靶向藥物對惡性膠質(zhì)瘤特別有效，可能成為膠質(zhì)瘤治療的新熱點。目前，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand，TRAIL）已經(jīng)被認為是最具有潛力的治療GBM藥物靶點［8］。本研究中，探討了左卡尼汀作為TRAIL的敏化劑，增強TRAIL對GBM細胞誘導(dǎo)凋亡的效果，并對其敏化作用的機制進行了研究，旨在為臨床GBM的治療提供新的有效手段。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器人惡性膠質(zhì)瘤細胞株U87購自American Type Culture Collection公司。左卡尼汀、胎牛血清、青霉素、鏈霉素購自Sigma公司，DMEM培養(yǎng)基購自 Invitrogen公司，所有抗體均購于 Santa Cruz Biotechnology，流式凋亡試劑盒購于BD Pharmingen公司，caspase-3活性測定試劑盒購于Keygen公司，Nuclear Extraction試劑盒購于 Active Motif。酶標(biāo)儀為Tecan公司產(chǎn)品（型號Infinite M1000），流式細胞儀為BD Biosciences公司產(chǎn)品（型號FACSCanto），PCR儀為Thermofisher公司產(chǎn)品（型號GeneAmp 9700）。

1.2細胞培養(yǎng)U87培養(yǎng)于含有10% 胎牛血清、1 ×105U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素雙抗的高糖DMEM完全培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細胞培養(yǎng)情況，3～4 d傳代1次，取對數(shù)生長期、健康的細胞進行實驗。

1.3CCK-8法測定細胞存活率將細胞接種于96

孔板中，相應(yīng)藥物處理后，向每孔加入10 μL CCK-8溶液后將96孔板放入細胞培養(yǎng)箱孵育3 h。用酶標(biāo)儀檢測450 nm處各孔的吸光度，計算各組細胞存活率。

1.4Annexin V-FITC/PI檢測細胞凋亡將細胞接種至6孔板中，相應(yīng)藥物處理后，用胰酶消化、離心、收集細胞沉淀，PBS重懸細胞并計數(shù)。取3×105個細胞，加入100 μL結(jié)合液，重懸細胞，再加入5 μL Annexin V-FITC，混勻后加入5 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI），置于室溫避光孵育15 min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.5Western blot檢測蛋白表達收集細胞，預(yù)冷的裂解液（含1%NP 40、0.5%脫氧膽酸鈉、0.1% SDS、蛋白酶抑制劑cocktail，pH 6.8）每組100 μL冰上裂解10 min，12 000 r·min-14℃離心20 min收集上清液，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白含量。上樣10 μL，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，4℃低溫條件下轉(zhuǎn)膜，NC膜以5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉2h。將對應(yīng)的特異性一抗按1∶200、β-actin按1∶1 000稀釋后，4℃孵育過夜。洗膜3次，加入辣根過氧化酶結(jié)合的二抗，37℃孵育1 h，洗膜3次，加入DAB顯色。圖像經(jīng)Quantity One凝膠成像分析系統(tǒng)進行分析。

1.6NF-κB活性測試以Nuclear Extraction試劑盒（Active Motif）進行細胞核內(nèi)成分提取。細胞用PBS清洗，離心收集細胞，取細胞沉淀備用。每20 μL細胞沉淀加入200 μL核蛋白抽提試劑A（含PMSF），混勻冰浴10～15 min，然后加入核蛋白抽提試劑B 10 μL，混勻后冰浴1 min，離心吸取上清即為核蛋白。NF-κB活性利用ELISA試劑盒按步驟進行檢測，用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測量OD值。

1.7Caspase-3活性檢測Caspase-3活性利用試劑盒測定（Keygen Biotech，Nanjing，China）。細胞以PBS緩沖液重懸，冰上孵育60 min，10 000×g離心1 min。收集上清與特異性酶底物在37℃下溫育4 h，利用分光光度計檢測450 nm處吸光度。

1.8細胞轉(zhuǎn)染將3條靶向p65/NF-κB基因的特異性siRNA轉(zhuǎn)入細胞，篩選出對p65/NF-κB表達抑制最有效的一條。轉(zhuǎn)染前取對數(shù)生長期細胞，用含10%胎牛血清的DMEM/High Glucose培養(yǎng)液懸浮后，以2×105個/孔的密度接種于6孔板中。Lipofectamine 2000用Opti-MEM預(yù)混后，靜置5 min，加入Opti-MEM稀釋后的p65/NF-κB siRNA和controlsiRNA并混勻，室溫靜置20 min。p65/NF-κB siRNA序列為 5'-GATGAAGACTTCTCCTCCATTGCGGACAT-3'（shRNA），control-siRNA序列為5'-TGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGC-3'，將混合物按分組加入含膠質(zhì)瘤細胞的6孔板中，置于37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后收集細胞進行試驗。

1.9定量PCR測試于轉(zhuǎn)染后48 h收獲細胞，每孔加0.5 mL TRIzol，按照TRIzol試劑說明書進行操作。測定紫外分光光度計260 nm/280 nm波長處的吸光度值，計算濃度，2%瓊脂糖電泳檢測總RNA的完整性。逆轉(zhuǎn)錄條件參照AMV酶說明書進行，PCR擴增應(yīng)用ABI PRISM 7000 Sequence Detection系統(tǒng)（Applied Biosystems）進行檢測。引物序列如下（sense）5'-CGGACTATAGAGTGCTGATGG-3'以及（antisense） 5'-GATTATCAGGCAGATTCCTAG-3'。GADPH用作內(nèi)參來定量PCR產(chǎn)物。

2　結(jié)果

2.1左卡尼汀增強U87細胞中TRAIL誘導(dǎo)的細胞凋亡首先檢測TRAIL以及左卡尼汀對細胞存活率的影響。如Fig 1A所示，當(dāng)TRAIL濃度為100 μg·L-1處理細胞48 h，可以明顯降低細胞存活率（P＜0.05）。左卡尼汀對細胞存活率的影響如Fig 1B所示，左卡尼汀對細胞存活率的抑制呈現(xiàn)濃度依賴，與對照組相比較，20 mmol·L-1左卡尼汀處理48 h可以將細胞的存活率降低至（62.1±5.2）%?；谝陨系慕Y(jié)果，以50 μg·L-1TRAIL與10 mmol ·L-1左卡尼汀組合進行后續(xù)實驗。如Fig 1C所示，50 μg·L-1TRAIL與10 mmol·L-1左卡尼汀聯(lián)合處理細胞 48 h，細胞的存活率降至（49.2± 4.9）%。

利用流式細胞儀，對左卡尼汀與TRAIL聯(lián)合誘導(dǎo)凋亡的效果進行檢測。如Fig 2A所示，當(dāng)TRAIL濃度為50 μg·L-1，不能夠在細胞中引起明顯的凋亡（P＞0.05）。但是當(dāng)50 μg·L-1TRAIL與10 mmol·L-1左卡尼汀聯(lián)合給藥時，左卡尼汀可以明顯增強細胞對TRAIL誘導(dǎo)凋亡作用的敏感度，兩者聯(lián)用可以在細胞中引起明顯的凋亡（P＜0.05）。細胞的凋亡與caspase-3和PARP的活化緊密相關(guān)，因此，檢測了兩者聯(lián)用對caspase-3以及PARP活化狀態(tài)的影響。如Fig 2B所示，TRAIL與左卡尼汀聯(lián)用導(dǎo)致活化 caspase-3和 PARP的表達明顯升高。caspase-3的活化也進一步的被酶活性檢測結(jié)果所證實，如Fig 2C所示。

Fig 1　Effect of L-carnitine or/and TRAIL on cell viability

2.2左卡尼汀通過調(diào)節(jié)c-FLIP水平提高U87細胞對TRAIL的敏感度U87細胞的凋亡與c-FLIP的水平密切相關(guān)［10，16］，本研究檢測了左卡尼汀是否通過調(diào)節(jié)c-FLIP水平提高U87細胞對TRAIL的敏感度。如Fig 3A所示，50 μg·L-1TRAIL并未引起細胞內(nèi)c-FLIP水平的明顯變化（P＞0.05），而10 mmol·L-1左卡尼汀也只是將細胞內(nèi)的c-FLIP水平稍微下調(diào)（P＞0.05）。但是當(dāng)兩者聯(lián)用，細胞中的c-FLIP水平呈現(xiàn)出明顯的下降（P＜0.05）。為了進一步證實以上結(jié)果，利用RT-PCR檢測了c-FLIP的mRNA表達水平。如Fig 3B所示，TRAIL與左卡尼汀聯(lián)合，明顯抑制c-FLIP的mRNA表達，表明左卡尼汀增強TRAIL誘導(dǎo)凋亡效果伴隨c-FLIP水平的下調(diào)。

Fig 2　Combinatory treatment with L-carnitine plus TRAIL induced apoptosis mediated via caspase-dependent pathway

Fig 3　Effects of TRAIL and L-carnitine on c-FLIP expression in U87 cells

2.3左卡尼汀抑制 U87細胞中 TRAIL誘導(dǎo)的NF-κB活化NF-κB對于細胞內(nèi)c-FLIP水平起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用［10］，本研究檢測了TRAIL、左卡尼汀以及兩者聯(lián)用對NF-κB信號通路的影響。如Fig 4A所示，ELISA的檢測結(jié)果表明，100 μg·L-1TRAIL可以將NF-κB的核內(nèi)轉(zhuǎn)運比例稍稍上調(diào)，而左卡尼汀可以稍微下調(diào)p65亞基的核內(nèi)轉(zhuǎn)運。但是當(dāng)二者聯(lián)用時，與對照組相比，NF-κB的活化顯示出明顯抑制（P＜0.05），提示左卡尼汀對于TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏化作用與NF-κB通路活化受阻有密切關(guān)系。

2.4沉默p65/NF-κB基因誘導(dǎo)U87細胞的神經(jīng)毒性為了更直觀的顯示NF-κB信號通路抑制對于TRAIL誘導(dǎo)細胞凋亡的敏化作用，以shRNA沉默了p65/NF-κB基因。轉(zhuǎn)染48 h以后，對p65/NF-κB基因沉默的效果利用免疫印跡進行驗證，如Fig 4B所示，siRNA轉(zhuǎn)染可以明顯抑制p65/NF-κB的表達。MTT實驗結(jié)果表明，沉默p65/NF-κB基因可以明顯增強TRAIL對于U87細胞存活率的抑制（Fig 4C）。同時，RT-PCR和Western blot結(jié)果也表明，p65/NF-κB基因沉默明顯降低了 U87細胞內(nèi) c-FLIP mRNA以及蛋白的表達（Fig 4D）。以上結(jié)果顯示，抑制NF-κB信號通路的活化可以在U87細胞中增強TRAIL誘導(dǎo)的凋亡，這種敏化效果與c-FLIP蛋白的下調(diào)有關(guān)。

3　討論

多形性成膠質(zhì)細胞瘤（GBM）是成人患者中最常見的腦部腫瘤，具有高侵襲性、高死亡率的特點，中位存活期只有14.6月［9］。由于分子病理異相性，GBM的治療相較于其他腫瘤尤其困難。為了改善預(yù)后，提高生存率，針對凋亡以及存活通路的一系列藥物已經(jīng)被用于治療GBM，包括針對表皮生長因子的erlotinib與gefitinib，針對Akt通路的perifosine，針對mTOR靶點的temsirolimus，以及針對Bcl-2的gossypol。已有臨床前研究表明，人類TRAIL能在活體動物模型中抑制膠質(zhì)瘤生長［10］，提示TRAIL具有應(yīng)用于臨床治療的巨大潛力。但是，大部分膠質(zhì)瘤細胞對TRAIL呈現(xiàn)出耐受，極大的限制了TRAIL的臨床應(yīng)用。近10年來，一系列研究結(jié)果顯示，將TRAIL與其他抗癌藥物相結(jié)合，可以有效克服TRAIL耐受，提高治療效果。Saito等［11］發(fā)現(xiàn)將Temozolomide與TRAIL相結(jié)合可以明顯延長荷瘤小鼠的存活期。Lee等［12］也證實了一些天然產(chǎn)物可以與TRAIL聯(lián)用，提高膠質(zhì)瘤細胞對TRAIL的敏感度。本項研究中，我們對左卡尼汀與TRAIL的協(xié)同作用進行了研究，并對其相關(guān)機制進行了探討。

Fig 4　L-carnitine-potentiated TRAIL-induced apoptosis partially dependent on activation of NF-κB

TRAIL通過與死亡受體DR4/TRAIL-R1以及DR5/TRAIL-R2相結(jié)合，引致DISC形成，從而激活caspase-8，誘導(dǎo)細胞凋亡。從DISC發(fā)出的凋亡信號可以被細胞內(nèi)FLICE抑制蛋白（c-FLIP）所抑制。c-FLIP屬于death effector domain（DED）家族，是具有催化活性的沒有caspase-8/-10的同系物，并且已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達，被認為是凋亡的抑制因子之一［13］。3種c-FLIP片段變體已經(jīng)被鑒定為細胞內(nèi)蛋白，包括55 ku的長型c-FLIP（L）、26 ku的短型c-FLIP（S）以及24 ku的c-FLIP（R）。當(dāng)處于高表達狀態(tài)，所有3種c-FLIP都被認為可以作為抗凋亡蛋白，并且與 caspase-8/-10競爭，參與DISC的富集［9］。相反的，在生理條件下，c-FLIP呈現(xiàn)低表達，c-FLIP可以促進caspase-8的活化以及死亡受體介導(dǎo)的凋亡［9］。Kang等的研究表明，利用siRNA敲除c-FLIP可以增強TRAIL誘導(dǎo)的凋亡。以上研究都提示：對于TRAIL誘導(dǎo)的凋亡，c-FLIP起到至關(guān)重要的作用。與此前研究結(jié)果相吻合，我們的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，左卡尼汀對于TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏化效果與c-FLIP下調(diào)有密切關(guān)系。

已有研究顯示［14］：NF-κB信號通路參與調(diào)節(jié)不依賴生長因子的細胞增殖，抑制凋亡、無限復(fù)制、組織的侵襲以及轉(zhuǎn)移，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)。NF-κB信號通路在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)展中也起著重要作用，其活性增加與不良預(yù)后呈正性相關(guān)。另外，NF-κB信號通路活化與轉(zhuǎn)錄水平上的c-FLIP上調(diào)也呈正性相關(guān)。因此，抑制NF-κB信號通路已成為治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的方案之一。Jane等［15］發(fā)現(xiàn)Bortezomib與TRAIL聯(lián)用，可以對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長產(chǎn)生協(xié)同抑制，其機制與抑制NF-κB信號通路活化有關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)左卡尼汀可以有效地抑制U87細胞中NF-κB信號通路活化，且NF-κB信號通路抑制是左卡尼汀敏化TRAIL誘導(dǎo)凋亡的主要機制。

綜上所述，本研究表明左卡尼汀可以在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中增強TRAIL誘導(dǎo)的凋亡，其機制與抑制NF-κB信號通路及其下游c-FLIP表達有關(guān)。此結(jié)果為將左卡尼汀應(yīng)用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床治療提供了理論依據(jù)。

（致謝：感謝青島大學(xué)國家實驗教學(xué)中心人體機能實驗室全體人員的幫助。）

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L-carnitine sensitizes human glioblastoma cells to TRAIL-induced apoptosis

YANG Xiu-wei1，2，XIE Jing3，ZHONG Feng4，HAN Yan-tao3
（（1.School of Pharmacy，2.the Affiliated Hospital，3.Basic Medical College，4.School of Stomatology，Qingdao University，Qingdao Shandong266000，China）

AimTo investigate the enhancing effect of L-carnitine as a sensitizer on tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand（TRAIL）-induced apoptosis in glioma cells.MethodsGlioma cell U87 was used as model cell line.Cell viability was determined by CCK-8，and apoptosis was assessed by AnnexinV-FITC/PI staining，caspase-3 activity and expression.The expression and transcription of nuclear factor kappa B（NF-κB）and FLICE inhibiting protein（c-FLIP）were measured by RT-PCR and Western blot. In addition，NF-κB was knockdown to analyze its regulating effect on c-FLIP expression.ResultsThe combination treatment with TRAIL and L-carnitine significantly inhibited cell proliferation and induced apoptosis.Compared with control，combinational treatment significantly suppressed the transcription and expression of c-FLIP as well as translocation of NF-κB. Through silencing NF-κB，NF-κB was found to act as upstream signaling to regulate c-FLIP.ConclusionL-carnitine sensitizes TRAIL-induced tumor cell apoptosis via suppression of NF-κB-dependent c-FLIP expression.

L-carnitine；TRAIL；NF-κB；c-FLIP；GBM；apoptosis

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.05.014

A

1001-1978（2016）05-0664-07

R329.25；R730.264；R739.41；R977.4

2016-01-25，

2016-02-20

國家自然科學(xué)基金資助項目（No 81473384）

楊秀偉（1978-），女，碩士，藥師，研究方向：腫瘤防治，E-mail：qdzhfeng01@163.com；韓彥弢（1964-），男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：天然藥物抗腫瘤，通訊作者，E-mail：hanyt19@126.com