馬　杰，范　婤，王國祥*，韓睿明，董　彬,2，冀　峰，彭　云

(1：南京師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院；江蘇省環(huán)境演變與生態(tài)建設(shè)重點實驗室；江蘇省地理信息資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210023)(2：臨沂大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，臨沂 276000)

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洪澤湖3種沉水植物附著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性*

馬杰1，范婤1，王國祥1*，韓睿明1，董彬1,2，冀峰1，彭云1

(1：南京師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院；江蘇省環(huán)境演變與生態(tài)建設(shè)重點實驗室；江蘇省地理信息資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210023)(2：臨沂大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，臨沂 276000)

沉水植物莖葉表面附著的藻、菌及其他物質(zhì)，不僅影響沉水植物自身生長，而且影響水體物質(zhì)循環(huán)過程，附著藻類的研究已經(jīng)有不少報道，但附著細(xì)菌的報道相對較少. 采用末端限制性片段長度多態(tài)性(T-RFLP)技術(shù)，研究洪澤湖典型沉水植物——菹草(Potamogetoncrispus)、篦齒眼子菜(Potamogetonpectinatus)、金魚藻(Ceratophyllumdemersum)在生長旺盛期葉表面附著細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)及多樣性特征，并采用冗余分析法探討環(huán)境因子對附著細(xì)菌豐度的影響. 結(jié)果表明，(1)3種沉水植物附著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有明顯的差異性. 143 bp T-RF在菹草和篦齒眼子菜中的相對豐度平均達(dá)到了20%和11%，而在金魚藻中的相對豐度小于1%；89 bp T-RF在金魚藻中的相對豐度平均約為13%，而在菹草和篦齒眼子菜中相對豐度小于5%. 94 bp T-RF在菹草樣品中相對豐度超過15%，而在其他樣品中未被檢測出.(2)從多樣性角度分析，3種沉水植物附著細(xì)菌多樣性大小依次為篦齒眼子菜>菹草>金魚藻.(3)部分限制性片段的豐度受環(huán)境因子的影響較大，如89、94、143和227 bp T-RFs. 而如167 bp T-RFs在3種沉水植物中的相對豐度分布較為穩(wěn)定，受上述環(huán)境因子的限制較小. 根據(jù)細(xì)菌比對結(jié)果，洪澤湖附著細(xì)菌的優(yōu)勢菌群可能屬于擬桿菌門(Bacteroides)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)3個門類.

附著細(xì)菌；T-RFLP技術(shù)；沉水植物；群落結(jié)構(gòu)；群落多樣性；洪澤湖

附著細(xì)菌是指生長在植物表面并與植物形成復(fù)雜共生關(guān)系的一類細(xì)菌[1]. 在湖泊生態(tài)系統(tǒng)中，附著細(xì)菌不僅數(shù)量眾多，而且種類十分豐富. 附著細(xì)菌作為湖泊生態(tài)系統(tǒng)中重要組成部分，對有機物的降解以及營養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)過程都起著重要作用[2-5]. 沉水植物附著細(xì)菌的數(shù)量通?？梢赃_(dá)到105～107cells/cm2[6]. 相比浮游細(xì)菌，附著細(xì)菌具有更高的初級生產(chǎn)力[7]. 在附著細(xì)菌及其宿主沉水植物的共同作用下，湖泊水體的水質(zhì)情況能夠得到顯著改善. 因此研究附著細(xì)菌對于解決湖泊生態(tài)系統(tǒng)的各種問題有重要意義[8-9].

沉水植物附著細(xì)菌主要包括擬桿菌(Bacteroidetes)、放線菌(Actinobacteria)、變形菌(Proteobacteria)、藍(lán)藻細(xì)菌(Cyanobacteria)和疣微菌(Verrucomicrobia)等門類[1]. 優(yōu)勢菌群在附著細(xì)菌生物膜形成過程中發(fā)揮著重要作用，生境條件和植物本身都會對附著細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)造成影響[10]. 早期對附著藻類宿主專一性的研究較多，而對沉水植物附著細(xì)菌的研究相對比較匱乏[11]. 何聃等[12]對苦草(Vallisnerianatans)和輪葉黑藻(Hydrillaverticillata)附著細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究，認(rèn)為宿主植物對附著細(xì)菌有很大影響. Cai[10]對太湖不同地點馬來眼子菜附著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同取樣點馬來眼子菜附著細(xì)菌組成具有高度的相似性，并推斷其也具有一定的宿主選擇. Hempel等[6]對輪藻(Charaaspera)和狐尾藻(Myriophyllumverticillatum)附著細(xì)菌的研究認(rèn)為，植物體分泌出不同的多酚類物質(zhì)對表面附著細(xì)菌有抑制作用，其中擬桿菌門的細(xì)菌豐度受這類物質(zhì)含量的影響非常明顯. 本研究采集洪澤湖3種典型沉水植物各自生長旺盛期的植株，利用T-RFLP技術(shù)對其葉表面附著細(xì)菌的群落多樣性進(jìn)行研究，目的是為了探討不同植物附著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異及環(huán)境因子對附著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，為深入研究富營養(yǎng)化湖泊植物-微生物結(jié)構(gòu)功能關(guān)系提供支撐.

1 研究區(qū)概況及研究方法

1.1 研究區(qū)概況

洪澤湖(33°6′～33°40′N，118°10′～118°52′E)水域面積約1597 km2，平均水深1.9 m，是我國第4大淡水湖泊，湖區(qū)水生植物比較豐富，水質(zhì)較好[13-14]. 但受人類活動的影響，近年來部分湖區(qū)水生植被出現(xiàn)退化趨勢[15]. 選擇洪澤湖西部溧河洼湖灣為研究區(qū)域，該湖區(qū)水生植物種類豐富、蓋度較高，但受圍網(wǎng)圍墾等因素影響，水生植物分布及水質(zhì)的空間差異較大. 本研究選取洪澤湖3種典型的沉水植物，菹草(Potamogetoncrispus)、篦齒眼子菜(Potamogetonpectinatus)和金魚藻(Ceratophyllumdemersum)作為研究對象.

1.2 樣品采集及水質(zhì)測定

于2014年4、5和7月分別采集菹草、篦齒眼子菜和金魚藻各自生長旺盛期的植物樣品[16]. 為了使取樣更具代表性，每種沉水植物在不超過5 m范圍內(nèi)隨機采集3個樣品，編號分別為1、2、3. 小心剪取長勢比較一致的沉水植物枝葉500 g左右，立即放入無菌的聚乙烯袋中，用冰袋保溫帶回實驗室測定附著細(xì)菌. 使用HACH HQ30D便攜式檢測儀現(xiàn)場測定水體pH值、溶解氧(DO)濃度、水溫(WT)等水質(zhì)指標(biāo)，并且按照規(guī)范采集水樣[17]，運回實驗室測定相關(guān)水質(zhì)指標(biāo). 用AutoAnalyzer 3全自動水質(zhì)連續(xù)流動分析儀(德國SEAL公司)測定水體總氮(TN)、總磷(TP)、氨氮(NH3-N)濃度等.葉綠素a濃度(Chl.a)用90%的丙酮溶液提取，然后由比色法進(jìn)行測定.

1.3 附著細(xì)菌樣品處理

在無菌室取出沉水植物樣品，分別選取形態(tài)一致的莖葉組織鮮重40 g，使用震蕩-超聲波法洗脫表面附著物[1]. 洗脫液通過1.2 μm醋酸纖維混合膜將大顆粒物除去，濾液再通過0.22 μm醋酸纖維混合膜，濾膜保存在-20℃下.

1.4 樣品總DNA提取

按照E.Z.N.A.Water DNA試劑盒步驟提取樣品基因組總DNA. 使用NanoDrop 2000超微量紫外分光光度計檢測DNA濃度和純度. DNA樣本于-20℃凍存.

表1 3種沉水植物樣品周圍水體的主要理化特征

1.5 T-RFLP分析

使用通用引物對27F/1492R擴(kuò)增16S rDNA部分片段[18-20]. 其中上游引物27F的5′末端使用FAM熒光標(biāo)記. PCR擴(kuò)增體系：模板DNA 2 μl，上下游引物各1 μl，2×EasyTaq?PCR Super Mix 25 μl(TransGenic Biotech)，ddH2O補足50 μl. PCR擴(kuò)增條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min. PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后用DNA純化試劑盒純化.

用限制性內(nèi)切酶MspⅠ對上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，反應(yīng)體系為MspⅠ 0.5 μl，10×RE buffer 2 μl，BSA 0.2 μl，PCR產(chǎn)物20 μl，用ddH2O將反應(yīng)體系補足到40 μl. 混勻后在37℃酶切4 h，80℃作用20 min后停止反應(yīng)，酶切產(chǎn)物交由上海生物工程有限公司進(jìn)行限制性片段的基因掃描，由Peak Scanner Software v1.0軟件分析處理獲得附著細(xì)菌的T-RFLP圖譜.

1.6 數(shù)據(jù)處理

T-RFLP圖譜采用Genemarker V2.4軟件進(jìn)行處理. 單個T-RF (Terminal Restriction Fragment)的相對峰面積(Pi)可通過公式Pi=ni/N×100%進(jìn)行計算，其中，ni為單個T-RF的實際峰面積，N為圖譜中所有峰的面積之和. 本實驗中Pi值僅采用片段長度在50～650 bp區(qū)間的T-RF數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計計算作為各T-RF的相對豐度，相對豐度小于1%的T-RF不予考慮. 計算Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和Simpson多樣性指數(shù). 通過Phylogenetic Assignment Tool數(shù)據(jù)庫(https:∥secure.limnology.wisc.edu/trflp/)對主要T-RFs所代表的物種進(jìn)行推測.

根據(jù)不同樣品中T-RF的豐度大小，將物種數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，通過Canoco4.5軟件進(jìn)行主成分分析(PCA). 為了研究群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)系，首先對物種數(shù)據(jù)進(jìn)行去趨勢對應(yīng)分析(DCA)，結(jié)果表明第一排序軸長度為1.603(小于2)，因此選用基于線性模型的冗余分析(RDA). 采用手動選擇，找出對群落結(jié)構(gòu)變化有顯著影響(P<0.05)的環(huán)境因子，利用Monte Carlo permutation test檢驗RDA排序軸特征值的顯著性. 利用PRIMER軟件對3種沉水植物的片段信息做一元ANOSIM統(tǒng)計分析，檢測它們之間的相似性.

2 結(jié)果與討論

2.1 3種沉水植物附著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

不同沉水植物附著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)之間有一定差異(圖1)， 結(jié)果表明，長度為91 bp的T-RF在全部樣品中都被檢測出，并且在其中7個樣品中相對豐度超過了20%，尤其在金魚藻樣品中，該片段的平均相對豐度達(dá)到27%. 長度為167 bp的T-RF也廣泛存在于所有樣品中，且在各樣品中相對豐度均大于10%，并在1個金魚藻樣品中相對豐度達(dá)到30%. 長度為143 bp的T-RF在篦齒眼子菜和菹草樣品中平均相對豐度分別達(dá)到11%和20%，而在金魚藻樣品中相對豐度卻小于1%；89 bp的T-RF在金魚藻樣品中相對豐度平均約為13%，而在菹草和篦齒眼子菜樣品中相對豐度低于5%；94 bp的T-RF在菹草樣品中相對豐度超過15%，而在其他樣品中未被檢測出；91 bp和167 bp所代表的細(xì)菌在3種沉水植物附著細(xì)菌中所占比例較高且含量相對穩(wěn)定. 基于樣品T-RFLP數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(圖2)， 圖中點的距離越近代表樣品相似性程度越高，結(jié)果表明所有樣品大致可以分為2個獨立的群，金魚藻可以單獨聚為一類，而篦齒眼子菜和菹草可以聚為一類，說明菹草和篦齒眼子菜的附著細(xì)菌群落組成具有一定的相似性. 為進(jìn)一步了解不同沉水植物附著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性情況，利用PRIMER軟件對3種植物做一元ANOSIM統(tǒng)計分析，R值越接近1，表明樣本之間的差異越大，越傾向于分類到不同的組群內(nèi). 結(jié)果顯示篦齒眼子菜和金魚藻群落組間差異最大(R=0.815，P=0.1)，其次是菹草和金魚藻群落(R=0.407，P=0.1)，菹草和篦齒眼子菜群落結(jié)構(gòu)差異最小(R=0.185，P=0.3).

圖1 洪澤湖不同沉水植物附著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)(P.c、P.p和C.d分別代表菹草、篦齒眼子菜和金魚藻樣品)Fig.1 Community structure of epiphytic bacteria on different submerged macrophytes in Lake Hongze(P.c, P.p, C.d represent Potamogeton crispus, Potamogeton pectinatus and Ceratophyllum demersum samples， respectively)

圖2 基于T-RFLP的主成分分析(P.c、P.p、C.d分別代表菹草、篦齒眼子菜和金魚藻樣品)Fig.2 PCA for T-RFs of three submerged macrophytes. Ellipses show similar groups(P.c, P.p, C.d represent Potamogeton crispus, Potamogeton pectinatus and Ceratophyllum demersum samples， respectively)

通過細(xì)菌數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，對一些優(yōu)勢T-RFs代表的物種進(jìn)行推測. 分別為Firmicutes(89 bp)、Bacteroidetes(91 bp)、γ-Proteobacteria/Actinobacteria(143 bp)、Actinobacteria/α-Proteobacteria(167 bp)等門類. Bacteroidetes在淡水湖泊生態(tài)系統(tǒng)中起著非常重要的作用，可以協(xié)助部分有機大分子物質(zhì)分解[21]. Vander等[22]的研究表明，在以浮游藻類為主要初級生產(chǎn)者的濁水態(tài)湖泊中以Cyanobacteria為主，而在以高等水生植物為初級生產(chǎn)者的清水態(tài)湖泊中則以Bacteroidetes居多，這與洪澤湖實際情況相符. 而Proteobacteria廣泛分布于全球不同類型的湖泊中，數(shù)量極為豐富，這類細(xì)菌往往有顯著的固氮作用.

對3種沉水植物附著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異的原因進(jìn)行探究. 首先，菹草和篦齒眼子菜均屬于眼子菜科，而金魚藻屬于金魚藻科. 3種沉水植物的葉片形態(tài)差異極大，篦齒眼子菜的葉片為線形；菹草的葉片為線狀披針形，邊緣呈淺波狀，有細(xì)小鋸齒；金魚藻葉片為輪生，邊緣有散生的刺狀細(xì)齒[16]. 不同的葉形為細(xì)菌提供了不同的附著基質(zhì). 水體中的浮游細(xì)菌經(jīng)過一段時間選擇與適應(yīng)，最終在植物體表形成了穩(wěn)定的菌落[23]. 其次，在其生長過程中，植物內(nèi)生細(xì)菌也有可能會通過組織縫隙、表面裂口等物理通道或隨植物的代謝產(chǎn)物一并遷移到植物葉表，并且最終各自形成獨特的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)[1]. 此外，附著細(xì)菌的生長繁殖與周圍水體環(huán)境密切相關(guān)，營養(yǎng)鹽負(fù)荷和特殊的生境條件等都會影響附著細(xì)菌的種類和豐度. 菹草群叢和篦齒眼子菜群叢的營養(yǎng)鹽比較接近(表1)，很可能是引起2種植物附著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更為接近的主要原因.

表2 3種沉水植物附著細(xì)菌多樣性指數(shù)

圖3 樣品T-RFs與環(huán)境因子的RDA分析Fig.3 RDA showing different T-RFs in relation to the main environmental factors

2.2 3種沉水植物附著細(xì)菌多樣性分析

菹草、篦齒眼子菜和金魚藻附著細(xì)菌的T-RFs平均數(shù)目分別約為44、49和35個. 3種沉水植物附著細(xì)菌多樣性指數(shù)變化與T-RFs數(shù)量變化基本一致. 篦齒眼子菜附著細(xì)菌擁有較高的物種多樣性，其次是菹草，金魚藻附著細(xì)菌的多樣性指數(shù)最低. Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)的趨勢呈現(xiàn)一致性,均勻度指數(shù)則基本保持不變(表2).

國外報道過沉水植物與附著細(xì)菌發(fā)生相互作用時會分泌出一些有機化合物，主要是植物次生代謝物(如酚類)，能夠?qū)ζ渌怵B(yǎng)生物或微生物產(chǎn)生影響[24]. 肖溪等[25]也對幾種沉水植物的化感作用進(jìn)行類似的研究，對于化感活性強的植物，大量胞外分泌物可能有針對性地抑制一種或者幾種細(xì)菌的生長，使得部分細(xì)菌的種類和數(shù)量減少. 3種沉水植物中，金魚藻有較強的化感活性，篦齒眼子菜和菹草具有較弱的化感活性[25]，這可能是導(dǎo)致金魚藻附著細(xì)菌多樣性低于另外2種沉水植物的原因.

2.3 沉水植物附著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子相關(guān)性分析

采樣點總體水質(zhì)情況較好(表1)，植物對水體營養(yǎng)鹽的凈化作用非常明顯. 菹草群叢和篦齒眼子菜群叢周圍水體水化指標(biāo)相差不大，均低于金魚藻群叢. 選取相對豐度超過5%的優(yōu)勢T-RFs進(jìn)行RDA分析. 89、227和91 bp T-RFs的豐度與TP、TN和葉綠素a濃度等呈正相關(guān)，與溶解氧濃度呈負(fù)相關(guān)；87、94和143 bp T-RF的豐度與溶解氧濃度呈正相關(guān)，而與TN、TP和葉綠素a濃度呈負(fù)相關(guān)；而167和114 bp T-RFs所代表細(xì)菌的豐度與以上4個環(huán)境因子之間的相關(guān)性比較小. 此外87 bp T-RF與水溫呈負(fù)相關(guān)(圖3).

很多研究表明環(huán)境因子對附著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有一定的影響[26]. RDA分析結(jié)果表明部分附著細(xì)菌受到環(huán)境因子影響比較小，如167 bp T-RFs，它們穩(wěn)定存在并成為優(yōu)勢菌群. 另外一些菌群，如89、91、94、143和227 bp T-RFs，這類細(xì)菌根據(jù)環(huán)境變化而被檢測出. 而通過它們豐度變化可以了解一些湖泊生態(tài)系統(tǒng)健康狀況，如γ-Proteobacteria數(shù)量增加代表水質(zhì)變好，而Bacteroidetes的數(shù)量往往與藻類釋放的有機物質(zhì)降解過程密切聯(lián)系[4].

3 結(jié)論

1)3種沉水植物附著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有一定差異，主要表現(xiàn)在其片段種類及相對豐度不同. 菹草樣品和篦齒眼子菜樣品的水化指標(biāo)比較接近，但仍然存在部分T-RFs的相對豐度有較大差異，因此可以推測沉水植物自身在一定程度上對附著細(xì)菌的種類和豐度產(chǎn)生了影響，使其表現(xiàn)出一定的宿主選擇性.

2)部分限制性片段的豐度變化較大，如89、94、143和227 bp T-RFs，這些差異在一定程度上反映了不同樣品的環(huán)境差異性. 然而究竟是宿主植物還是水體營養(yǎng)鹽等對它們的影響更大，仍然需要做深入研究. 而如167 bp T-RFs在3種沉水植物中的相對豐度較為穩(wěn)定，受上述環(huán)境因子的限制較小. 這部分菌群普遍存在于不同植物葉表，它們能夠適應(yīng)生存環(huán)境并且成為優(yōu)勢種，很有可能對附著細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和功能有著重要的作用.

基于16S rRNA的分子生物學(xué)方法可彌補傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法的不足，從而更全面地了解環(huán)境中微生物的群落結(jié)構(gòu). 但由于T-RFLP技術(shù)定性分析具有不確定性，任意一種T-RF可能會代表一種或者多種細(xì)菌，因此需通過構(gòu)建克隆文庫或高通量測序來獲得更多細(xì)菌物種的信息[23,27]，從而進(jìn)一步解釋附著微生物對于外界環(huán)境變動的響應(yīng)機制. 此外，附著細(xì)菌和宿主沉水植物之間的潛在關(guān)系，附著細(xì)菌是否對宿主沉水植物的衰亡過程起到作用也需要進(jìn)一步調(diào)查研究[12].

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Diversity and community structure of epiphytic bacteria on different submerged macrophytes in Lake Hongze

MA Jie1, FAN Zhou1, WANG Guoxiang1**, HAN Ruiming1, DONG Bin1,2, JI Feng1& PENG Yun1

(1：CollegeofGeographicalScience，NanjingNormalUniversity；JiangsuKeyLaboratoryofEnvironmentalChangeandEcologicalConstructionNanjing；JiangsuCenterforCollaborativeInnovationinGeographicalInformationResourceDevelopmentandApplication，Nanjing210023，P.R.China)(2：CollegeofResourceandEnvironment，LinyiUniversity，Linyi276000，P.R.China)

Algae, epiphytic bacteria and other substances attached to the surface of submerged macrophytes affected not only the growth of submerged macrophytes but also the mass cycling in aquatic ecosystems. Previously, many reports were focus on the influence from algae, far few were related to epiphytic bacteria. Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP) method was used to investigate the epiphytic bacteria communities attached to three common submerged macrophytes (Potamogetonpectinatus,PotamogetoncrispusandCeratophyllumdemersum) in Lake Hongze. The relationship between environmental factors and the abundance of epiphytic bacteria were analyzed by means of redundancy analysis (RDA). The results showed that: (1) Epiphytic bacteria varied greatly in community structure among the three macrophytes. The relative abundance of 143 bp T-RF inP.crispusandP.pectinatusreached 20% and 11% in average respectively, while less than 1% inC.demersum; the relative abundance of 89 bp T-RF inC.demersumhas an average of 13% while less than 5% inP.crispusandP.pectinatus. The relative abundance of 94 bp T-RF inP.crispuswas more than 15%, but it was even not detected in other two macrophytes. (2) The diversity of epiphytic bacteria were in the orderP.pectinatus>P.crispus>C.demersum. (3) Results of RDA illustrated that some T-RFs, such as 89, 94, 143 and 227 bp T-RFs, were under the influence of the environmental factors. The relative abundance of 167 bp T-RFs in three kinds of submerged macrophytes was stably distributed, which indicated limited influence from the above environmental factors. In addition, the dominant epiphytic bacteria in Lake Hongze wereBacteroidetes,FirmicutesandProteobacteria.

Epiphytic bacteria; T-RFLP; submerged macrophytes; community structure; diversity of community; Lake Hongze

*國家自然科學(xué)基金項目(41173078,41403064)、國家水體污染控制與治理科技重大專項(2012ZX07101-008-02)和江蘇省科技廳高校自然科學(xué)研究面上項目(14KJB610007)聯(lián)合資助. 2015-02-15收稿; 2015-10-26收修改稿. 馬杰(1990～), 男, 碩士研究生;E-mail: jsycmj1990@126.com.

**通信作者; E-mail: wangguoxiang@njnu.edu.cn.