方 潁，黃永祿，蔡加昌，林曉偉，張 嶸，呂火烊

金黃色葡萄球菌臨床株對利奈唑胺耐藥性及耐藥機制

方 潁1，黃永祿2，蔡加昌2，林曉偉3，張 嶸2，呂火烊3

目的 了解金黃色葡萄球菌（金葡菌）臨床株對利奈唑胺耐藥性及耐藥機制。方法 收集2011-2014年浙江省人民醫(yī)院900株金葡菌，采用紙片擴散法測定利奈唑胺藥敏，對篩選到的耐藥菌株采用瓊脂稀釋法測定常用藥物的最低抑菌濃度（MIC），同時對其耐藥基因cfr、optrA、23S rRNA基因第5功能區(qū)進行PCR擴增和序列分析。對cfr或optrA基因陽性的菌株進行基因周圍序列分析和菌株多位點序列分型（MLST）。結果 臨床分離金葡菌對利奈唑胺耐藥率為0.1% （1/900），僅發(fā)現(xiàn)1株耐藥株，該菌株為耐甲氧西林金葡菌（MRSA），對利奈唑胺MIC為8 mg/L、頭孢西丁48 mg/L、青霉素32 mg/L、環(huán)丙沙星128 mg/L、克林霉素32 mg/L、氯霉素128 mg/L、萬古霉素0.75 mg/L、替考拉寧0.5 mg/L。除萬古霉素和替考拉寧，對其他抗菌藥物均耐藥。PCR結果顯示該菌株cfr基因為陽性，optrA陰性，無23S rRNA突變。該菌株攜帶的cfr基因位于“Tn4001-like轉座子-cfr-orf1-ISEnfa4”復合轉座子中，并定位于一個39 504 bp的質粒上。該菌株的MLST分型為ST5。結論 臨床分離金葡菌對利奈唑胺耐藥率低，發(fā)現(xiàn)1株cfr基因介導的利奈唑胺耐藥株，cfr基因位于質粒上一個常見的復合轉座子中。

金黃色葡萄球菌； cfr基因； 利奈唑胺； 耐藥

金黃色葡萄球菌（金葡菌）可引起皮膚和軟組織感染、肺炎、感染性心內(nèi)膜炎、骨關節(jié)感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、血流感染和中毒性休克等。上世紀40年代青霉素問世后有效地控制了葡萄球菌引起的感染，但是很快便出現(xiàn)青霉素耐藥菌株。甲氧西林可用于治療耐青霉素葡萄球菌的感染，然而臨床應用2年之后便分離到甲氧西林耐藥菌株。根據(jù)2013年CHINET細菌耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù)，耐甲氧西林金葡菌（MRSA）的比例為45.2 %，耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌（MRCNS）的比例高達73.5 %［1］。利奈唑胺是首個唑烷酮類抗菌藥物，于2000年在美國被批準用于臨床，2007年進入中國市場，該藥對大多數(shù)革蘭陽性菌具有很強的抗菌作用，是治療MRSA的一個重要選擇。

利奈唑胺耐藥的主要機制有細菌核糖體23S rRNA點突變、核糖體L3或L4蛋白的氨基酸突變以及耐藥基因cfr［2］。最近，WANG等［3］報道在糞腸球菌和屎腸球菌中發(fā)現(xiàn)對利奈唑胺耐藥的新基因optrA。cfr甲基轉移酶可使23S rRNA的A2503位核苷酸發(fā)生甲基化，導致細菌對氯霉素、氟苯尼考、克林霉素和利奈唑胺等多種藥物耐藥［4-5］。近年來隨著利奈唑胺的廣泛應用，利奈唑胺耐藥的葡萄球菌屬在世界范圍內(nèi)流行［6］。2011年浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院檢測出16株凝固酶陰性葡萄球菌攜帶有cfr基因［7］。2013年，YANG等［8］報道杭州2所醫(yī)院分離到9株cfr陽性的凝固酶陰性葡萄球菌。最近，CAI等［9］在國內(nèi)發(fā)現(xiàn)了cfr基因導致的利奈唑胺耐藥的MRSA。

本實驗對浙江省人民醫(yī)院的金葡菌進行篩選，并對其耐藥機制進行了分析。

1　材料與方法

1.1菌株來源

收集2011-2014年浙江省人民醫(yī)院臨床分離的金葡菌900株。其中2011年188株，2012年312株，2013年200株，2014年200株。

1.2儀器與試劑

基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀（matrix-assisted laser desorpt/ionionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）購自德國Bruker Dahonics公司；PCR擴增儀購自德國Biometra公司；DYY-1 1型水平電泳儀購自北京市六一儀器廠；脈沖場凝膠電泳儀及成像系統(tǒng)購自德國Biometra公司；引物合成自上海生工生物工程股份有限公司；Taq酶及PCR相關試劑購自日本TaKaRa公司。

1.3細菌鑒定

采用MALDI-TOF MS進行鑒定，具體操作步驟參見文獻［10］。分別使用flexcontrol 3.3軟件和MALDI Biotyper 3軟件進行數(shù)據(jù)采集和結果分析。

1.4藥敏試驗

采用紙片擴散法對900株金葡菌進行利奈唑胺及頭孢西丁藥敏試驗，藥敏試驗結果按CLSI M100-S24標準判斷。采用肉湯稀釋法測定頭孢西丁、環(huán)丙沙星、克林霉素、氯霉素、利奈唑胺、萬古霉素、青霉素、替考拉寧的最低抑菌濃度（MIC）。具體實驗操作參照CLSI標準［11］。

1.5PCR檢測

PCR擴增利奈唑胺耐藥菌株的cfr、optrA、23S rRNA基因［3-4，12］和7個用于多位點序列分型（MLST）的管家基因。采用根據(jù)cfr陽性質粒設計的26對引物進行PCR擴增和序列分析（GenBank No.KJ922127）。

2　結果

2.1菌種鑒定

采用MALDI-TPF MS鑒定900株菌株，結果均為金葡菌。

2.2利奈唑胺耐藥菌株篩選結果

采用紙片擴散法篩選到1株對利奈唑胺耐藥的金葡菌，該菌株為MRSA。分離自感染科1例女性患者的呼吸道標本。臨床診斷為吸入性肺炎，住院期間曾用過哌拉西林-他唑巴坦、異帕米星和氯康唑等抗菌藥物，未使用過利奈唑胺。

2.3MIC測定

MIC結果顯示，頭孢西丁對該菌株的MIC為48 mg/L，為MRSA，利奈唑胺MIC為8 mg/L，為利奈唑胺耐藥。青霉素為32 mg/L、環(huán)丙沙星為128 mg/L、克林霉素為32 mg/L、氯霉素為128 mg/L、萬古霉素為0.75 mg/L、替考拉寧為0.5 mg/ L。除了萬古霉素和替考拉寧，對其他抗菌藥物均耐藥。

2.4PCR擴增和序列分析

PCR擴增結果顯示該株為cfr陽性，optrA陰性，無23S rRNA突變。MLST分型顯示該菌株為ST5。

就26對引物的PCR產(chǎn)物進行序列拼接及分析，結果顯示cfr基因位于質粒pLRSA417上?；蛑車Y構分析發(fā)現(xiàn)cfr基因位于“Tn4001-like轉座子-cfr-orf 1-ISEnfa4”復合轉座子中，見圖1。

圖1　復合轉座子結構圖Figure 1 The schematic structure of the Tn4001-like composite transposon

3　討論

利奈唑胺耐藥的機制有4種，其中cfr基因介導的利奈唑胺耐藥引起越來越多的關注。本研究檢出1株耐利奈唑胺的MRSA，實驗結果顯示該菌株為cfr陽性。2000年，SCHWARDS等［18］首先從牛體分離到1株松鼠葡萄球菌攜帶cfr基因并定位于16.5 kb的質粒（命名為pSCFS1）上，研究發(fā)現(xiàn)該基因可導致細菌對氯霉素和氟苯尼考同時耐藥，但由于cfr表達出的蛋白與已知的介導氯霉素和氟苯尼考耐藥的蛋白并無同源性，說明cfr是一種由新的耐藥機制介導的耐藥。后續(xù)研究表明，cfr基因是通過編碼rRNA甲基轉移酶使23S rRNA的A2503位核苷酸發(fā)生甲基化，并抑制C2498位的甲基化從而影響藥物與細菌核糖體的結合導致耐藥。2007年，TOH等［12］首次報道1株分離自臨床患者的攜帶cfr基因的菌株—MRSA CM05，利奈唑胺對該菌的MIC值為16 mg/L，因未檢測到其他導致利奈唑胺耐藥的機制，通過研究發(fā)現(xiàn)cfr基因是導致其對利奈唑胺耐藥的原因。在國內(nèi)，2015年CAI等［9］報道了攜帶cfr基因的MRSA對利奈唑胺耐藥，并對cfr基因所在質粒進行全質粒測序和分析，結果顯示cfr基因位于一個39 504 bp的質粒上；TIAN等［19］在上海也分離到了cfr基因陽性耐利奈唑胺的金葡菌，說明cfr介導的利奈唑胺耐藥正在逐漸重視。

目前臨床患者來源的cfr基因，除了來自哥倫比亞的MRSA菌株CM05位于染色體，其他有關cfr基因的報道以質粒攜帶居多。本研究篩選到的菌株cfr基因定位于質粒pLRSA417上，大小為39 504 pb的質粒pLRSA417，該質粒首先報道自浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院檢測到的1株利奈唑胺耐藥的金葡菌中［9］，對cfr周圍序列分析得到cfr周圍包括 Tn4001-like轉座子，cfr、orf 1、ISEnfa4構成一個可移動元件。這個DNA片段跟WANG等［20］報道過的科氏葡萄球菌在結構上除了3個單核苷酸多態(tài)性和2個缺失外均相同，相似的結構在杭州分離的頭狀葡萄球菌、北京和瑞安分離的科氏葡萄球菌、美國分離的表皮葡萄球菌中也有報道［21-23］。說明這個結構可導致cfr基因有跨菌種的轉移。

本次研究表明，目前中國cfr基因在金葡菌中攜帶率低（1/900），與之前報道的低攜帶率一致［24-25］。但cfr基因大多位于質粒上，可在不同種細菌或不同屬細菌之間水平轉移，導致耐藥性在臨床分離細菌之間、甚至動物來源細菌以及環(huán)境細菌之間相互傳播，世界范圍內(nèi)的cfr基因傳播需要引起警惕。

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Antibiotic resistance profile and mechanism of linezolid-resistant Staphylococcus aureus strains

FANG Ying，HUANG Yonglu，CAI Jiachang，LIN Xiaowei，ZHANG Rong，Lü Huoyang. （Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

Objective To investigate the linezolid resistance in clinical isolates of S. aureus and the underlying mechanisms. Methods A total of 900 S. aureus strains were isolated from Zhejiang Provincial People's Hospital during the period from 2011 to 2014. Linezolid-resistant strains were screened using disk diffusion method，and confirmed by minimal inhibitory concentration （MIC）determination. Resistance genes cfr，optrA，and the fifth functional region of 23S rRNA gene were identified by PCR amplification and sequencing analysis. The cfr or optrA positive strains were further characterized by surrounding sequence analysis and multilocus sequence typing （MLST）. Results The prevalence of linezolid-resistant isolates was 0.1% （1/900）. Only one strain was found resistant to linezolid，and also methicillin-resistant （MRSA）. The MIC value of linezolid，cefoxitin，penicillin，ciprofloxacin，clindamycin，chloramphenicol，vancomycin，teicoplanin against this strain was 8，48，32，128，32，128，0.75 and 0.5 mg/L，respectively. This isolate was susceptible to vancomycin and teicoplanin，but resistant to other antibiotics. PCR results indicated that cfr gene was positive，while optrA was negative in this strain. No 23S rRNA mutation was found. The cfr gene located in a composite transposon “Tn4001-like transposon-cfr-orf 1-ISEnfa4”，which was in a 39 504 bp plasmid. MLST showed that this isolate was ST5. Conclusions Linezolid resistance is very low in the clinical isolates of S. aureus in our hospital. Only one strain was positive for cfr gene，which is located in a common composite transposons in a plasmid.

Staphylococcus aureus； cfr gene； linezolid；antibiotic resistance

R378.11

A

1009-7708（2016）04-0477-04

10.16718/j.1009-7708.2016.04.018

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目（2015112173）；浙江省自然科學基金（LQ13H200001）。

1. 浙江工業(yè)大學，杭州 310014；2. 浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院檢驗科；3. 浙江省人民醫(yī)院檢驗科。

方潁 （1992—），女，碩士研究生，主要從事細菌檢驗工作。

張嶸，E-mail：brigitte_zx@163.com。

2015-07-31

2015-08-19