王軍，程萍萍，袁俊英，朱登納，牛國(guó)輝，陳靜，杜江華，張冬秀

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院，鄭州 450052)

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缺氧缺血性腦損傷新生大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況及Tau、p-Tau蛋白表達(dá)變化

王軍，程萍萍，袁俊英，朱登納，牛國(guó)輝，陳靜，杜江華，張冬秀

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院，鄭州 450052)

目的觀察缺氧缺血性腦損傷(HIBD)新生大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況及Tau、p-Tau蛋白表達(dá)變化。方法70只清潔級(jí)7日齡SD大鼠隨機(jī)分為A組(50只)、B組(10只)、C組(10只)，A組大鼠采用經(jīng)典Rice法制備HIBD動(dòng)物模型，B組僅分離而不結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈，也不行缺氧處理，C組不作任何處理。A組于HIBD后3、6、12、24、48 h各處死10只，B、C組術(shù)后全部即刻處死。比較各組凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)及Tau、p-Tau蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果與B、C組比較，A組制模后3～48 h凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)增加，制模后6～48 h Tau蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加，制模后3～24 h p-Tau蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加(P均<0.05)；A組制模后不同時(shí)點(diǎn)(3～48 h)凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)、Tau蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)兩兩比較，制模后不同時(shí)點(diǎn)(3～24 h)p-Tau蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)兩兩比較，P均<0.05。結(jié)論HIBD后新生大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，細(xì)胞中Tau、p-Tau蛋白表達(dá)升高。

缺氧缺血性腦損傷；神經(jīng)細(xì)胞；Tau蛋白；p-Tau蛋白

缺氧缺血性腦損傷(HIBD)可引起新生兒急慢性神經(jīng)系統(tǒng)損傷，主要原因是誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞壞死和凋亡，而細(xì)胞凋亡為腦損傷的主要形式[1,2]。Tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，在神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中起重要作用[3,4]。正常狀態(tài)下，Tau蛋白有一定程度磷酸化，即p-Tau蛋白，但Tau蛋白過(guò)度表達(dá)被異常磷酸化、糖基化時(shí)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)和功能有直接損傷作用。眾多研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧、缺血、外傷等誘導(dǎo)的成年及新生大鼠神經(jīng)損傷過(guò)程中，均有Tau、p-Tau蛋白參與。然而，新生大鼠HIBD后腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況及Tau、p-Tau蛋白表達(dá)變化，以及兩者間的關(guān)系尚不明確。本研究通過(guò)建立HIBD模型，觀察HIBD新生大鼠Tau、p-Tau蛋白及神經(jīng)細(xì)胞凋亡動(dòng)態(tài)變化，并對(duì)其進(jìn)行相關(guān)性分析，旨在探索神經(jīng)細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制，以此為抗凋亡治療開(kāi)辟新途徑。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑7日齡清潔級(jí)新生健康SD大鼠70只，體質(zhì)量12～15 g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。8%O2和92%N2混合氣體(北京普萊克斯公司)；鼠抗Tau單克隆抗體；鼠抗p-Tau單克隆抗體；TUNEL原位細(xì)胞凋亡試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；SP-0023試劑盒(北京Boosen生物技術(shù)有限公司)。

1.2動(dòng)物分組、HIBD模型制備及標(biāo)本采集70只大鼠隨機(jī)分為A組(50只)、B組(10只)、C組(10只)。A組采用經(jīng)典Rice法[5]制作HIBD動(dòng)物模型，即新生大鼠以乙醚麻醉，固定于手術(shù)臺(tái)上，分離并兩端結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈，中間剪斷，術(shù)后放回母鼠身邊恢復(fù)1 h，然后放入常壓缺氧箱，箱內(nèi)有鈉石灰以吸收動(dòng)物排出的CO2，以1.5 L/min的速度向容器內(nèi)輸入氮氧混合氣體，持續(xù)缺氧2.5 h，術(shù)畢放回母鼠身邊飼養(yǎng)。于造模前后觀察每只新生大鼠的意識(shí)狀態(tài)和行為能力，如翻身、爬行平衡性、四肢肌張力等。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：大鼠麻醉清醒后出現(xiàn)肌力下降，隨意運(yùn)動(dòng)靈活性降低，翻身困難或不能，有明顯肢體對(duì)稱運(yùn)動(dòng)障礙，如夾尾左旋。B組僅分離而不結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈，也不行缺氧處理。C組不作任何處理。A組于HIBD后3、6、12、24、48 h各處死10只，B、C組術(shù)后即刻處死，取小鼠大腦備檢。

1.3腦組織凋亡神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)采用TUNEL法。切片常規(guī)脫蠟；梯度乙醇水化；切片浸入新鮮配制的1%Triton X-100通透液中，室溫(15～25 ℃)處理5 min，PBS緩沖液洗3次，5 min/次；切片浸入新鮮配制3%H2O2封閉液中，室溫處理10 min，PBS緩沖液洗3次，5 min/次；新鮮配制蛋白酶K工作液，100 μL/片，37 ℃孵育30 min，PBS緩沖液洗3次，5 min/次；新鮮配制TdT酶反應(yīng)液，置于冰上，濾紙吸干樣本周?chē)后w，滴加TdT酶反應(yīng)液，50 μL/片，37 ℃避光孵育1 h，PBS緩沖液洗3次，5 min/次；新鮮配制streptavidin-FITC工作液，濾紙吸干樣本周?chē)后w，每個(gè)樣本滴加50 μL，37 ℃避光孵育30 min，PBS緩沖液洗3×5 min；新鮮配制POD-conjugated Anti-FITC工作液，濾紙吸干樣本周?chē)后w，每個(gè)樣本滴加50 μL，37 ℃避光孵育30 min，PBS緩沖液洗3×5 min；新鮮配制的DAB溶液(淺棕色)，濾紙吸干樣本周?chē)后w，每個(gè)樣本滴加50 μL，室溫顯色，鏡下觀察控制反應(yīng)時(shí)間(勿使背景顏色過(guò)深)，PBS緩沖液洗3次，5 min/次；蘇木精輕度復(fù)染30 s～1 min，蒸餾水沖洗干凈，1%鹽酸乙醇分化，自來(lái)水沖洗干凈；脫水；二甲苯透明；中性樹(shù)膠封片。染色結(jié)束后每個(gè)樣品隨機(jī)取8張切片，每張切片隨機(jī)取8個(gè)視野(400×)，分別計(jì)數(shù)1.0 mm2內(nèi)TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.4腦組織Tau、p-Tau蛋白陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)采用免疫組化法。4%多聚甲醛固定30 min；0.2%Triton-X 100室溫通透；3%H2O2室溫封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；10%正常山羊血清室溫封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)；加入一抗鼠抗Tau單克隆抗體、鼠抗p-Tau單克隆抗體，設(shè)置陰性對(duì)照，用PBS代替一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌后加入二抗37 ℃孵育1 h；HE染色；0.1%鹽酸分化；梯度乙醇脫水；透明封片，風(fēng)干，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況并攝圖。染色結(jié)束后每個(gè)樣品隨機(jī)取8張切片，每張切片隨機(jī)取8個(gè)視野(×400)，分別計(jì)數(shù)1.0 mm2內(nèi)Tau、p-Tau蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取平均值。

2　結(jié)果

各組凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)及Tau、p-Tau蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較見(jiàn)表1。A組制模24 h Tau蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與凋亡細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)(r=0.872，P<0.01)。

表1　各組凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)及Tau、p-Tau蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(個(gè)

注：與C組比較，△P<0.05；與B組比較，▽P<0.05；A組各指標(biāo)不同時(shí)間點(diǎn)兩兩比較，○P<0.05。

3　討論

HIBD是新生兒常見(jiàn)嚴(yán)重疾患，可引起永久性殘疾，發(fā)病率和病死率較高[6]。研究[7]證實(shí)，HIBD可引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞壞死和凋亡，而細(xì)胞凋亡為繼發(fā)性腦損傷中神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要形式，為影響預(yù)后的主要因素。因此，對(duì)凋亡發(fā)生機(jī)理及抗凋亡研究可能為缺氧缺血性腦病的治療開(kāi)辟新路徑，進(jìn)而減少或減輕腦損傷后遺癥的發(fā)生。凋亡或程序性細(xì)胞死亡是指在一定生理或病理?xiàng)l件下，為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，由基因調(diào)控的細(xì)胞自主性死亡[8]，具有特殊形態(tài)學(xué)及生物化學(xué)特征，包括胞膜皺縮、凹陷及染色質(zhì)致密、斷裂成小片段和包裹了染色質(zhì)片段、膜結(jié)構(gòu)尚完整的凋亡小體形成等。新生動(dòng)物缺氧缺血致腦缺血再灌注，引發(fā)一系列損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)、興奮性氨基酸毒性作用、氧化應(yīng)激損傷、線粒體功能障礙，以及隨后凋亡相關(guān)基因、相關(guān)蛋白的激活，與此同時(shí)，機(jī)體釋放大量細(xì)胞因子，最終導(dǎo)致了細(xì)胞壞死和凋亡。

Tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，主要生物學(xué)功能是促進(jìn)微管組裝和維持先前形成的微管。正常機(jī)體Tau蛋白也有一定程度磷酸化，它在神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中起主要作用。但Tau蛋白過(guò)度表達(dá)被異常磷酸化、糖基化時(shí)，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)和功能有直接損害。有研究[9]表明，Tau蛋白參與HIBD的病理過(guò)程，HIBD后可能通過(guò)鈣調(diào)蛋白激酶、GSK-3β及興奮性氨基酸谷氨酸受體的共同作用，使Tau蛋白過(guò)度磷酸化。過(guò)度磷酸化的Tau蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，失去促進(jìn)微管蛋白聚合能力，導(dǎo)致微管可溶，影響細(xì)胞骨架穩(wěn)定性，軸突延伸作用減弱，營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸受損，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[10,11]。本研究顯示，與B、C組比較，A組制模后3～48 h凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)增加；A組制模后不同時(shí)點(diǎn)(3～48 h)凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)兩兩比較，P均<0.05。此結(jié)果與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本相同。本研究還顯示，與B、C組比較，A組制模后6～48 h Tau蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加，制模后3～24 h p-Tau蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加；A組制模后不同時(shí)點(diǎn)(3～48 h)Tau蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)兩兩比較，制模后不同時(shí)點(diǎn)(3～24 h)p-Tau蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)兩兩比較，P均<0.05。A組制模24 h Tau蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與凋亡細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)。推測(cè)可能與缺氧缺血后Tau蛋白免疫反應(yīng)性增強(qiáng)，引起微管解聚及細(xì)胞骨架遭到破壞，進(jìn)而影響神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定及神經(jīng)細(xì)胞與神經(jīng)纖維之間的物質(zhì)運(yùn)輸，致使神經(jīng)細(xì)胞壞死、凋亡以及神經(jīng)纖維退化。

總之，HIBD后新生大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡及Tau、p-Tau蛋白表達(dá)升高，且Tau蛋白表達(dá)與神經(jīng)細(xì)胞凋亡存在正相關(guān)。

[1] 李德淵,屈藝,李晉輝,等.磷酸酶PTEN在新生大鼠缺氧缺血性腦損傷神經(jīng)元凋亡中的作用[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)醫(yī)學(xué)版,2014,45(5):767-771.

[2] Carloni S, Carnevali A, Cimino M, et al. Extended role of necrotic cell death after hypoxia-ischemia-induced neuro degeration in the neonatal rat[J]. Neurobiol Dis, 2007,27(3):354-361.

[3] Idan-Feldman A, Ostritsky R, Gozes I. Tau and caspase 3 as targets for neuroprotection[J]. Int J Alzheimers Dis, 2012,2012:493670.

[4] Peng Y, Xing C, Lemere CA, et al. l-3-n-Butylphthalide ameliorates beta-amyloid-induced neuronal toxicity in cultured neuronal cells[[J]]. Neurosci Lett, 2008,434(2):224-229.

[5] Rice JE 3rd, Vannucci RC, Brierley JB. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat[J]. Ann Neurol, 1981,9(2):131-141.

[6] Qiu J, Zhou XY, Zhou XG,et al. Neuroprotective effects of microRNA-210 on hypoxic-ischemic encephyalopathy[J]. Biomed Res Int, 2013,2013:350-419.

[7] Puyal J, Ginet V, Clarke PG. Multiple interacting cell death mechanisms in the mediation of excitotoxicity and ischemic brain damage: a challenge for neuroprotection[J]. Prog Neurobiol, 2013,105:24-48.

[8] 王慶九,參附注射液對(duì)新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的干預(yù)作用[J].中國(guó)婦幼保健,2009,24(23):3304-3306.

[9] Liao G, Zhou M, Cheung S, Reduced early hypoxic/ischemic brain damage is associated with increased GLT-1levels in mice expressing mutant(P301L) human tau[J]. Brain Res, 2009(1247):159-170.

[10] Sarnat H, Flores-Sarnat L, Crino P, et al. Hemimegalencephaly:fetal tauopathy with Mtor hyperactivation and neuronal lipidosis[J]. Folia Neuropathol, 2012,50(4):330-345.

[11] Aronica E, Becker AJ, Spreafico R. Malformations of cortical development[J]. Brain Pathol, 2012,22(3):380-401.

河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目計(jì)劃(14A320004)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.15.011

R651.1

A

1002-266X(2016)15-0036-03

2015-11-28)