王宗麗　沈艷玲　張元榛　付金濤　孫立元

[摘要]目的 局灶性腦缺血后產(chǎn)生各種類型的嗜酸性神經(jīng)元（ENs）。為了探討大鼠局灶性腦缺血后大腦皮質中心區(qū)和周邊區(qū)ENs的形態(tài)學特征，及細胞死亡相關因子在ENs中的表達。方法 夾閉蒙古沙鼠單側頸總動脈制作前腦缺血模型，于3h至2周在顯微鏡下行ENs形態(tài)學和免疫組織化學分析。結果 光鏡：細胞核輕度異常的ENs缺血3h后出現(xiàn)于中心區(qū)，12h后出現(xiàn)于周邊區(qū)，calcium、μ-calpain、GRP78和ubiquitin在該型ENs中呈陽性。中心區(qū)，核固縮和胞體不規(guī)則萎縮的ENs缺血12h后達峰值，calcium、μ-calpain表達進一步增高；核固縮和胞體極度萎縮的ENs 4d后達峰值，calcium、TUNEL染色呈陽性。周邊區(qū)，ENs的胞體輕度萎縮，于1周后相繼呈現(xiàn)核固縮、核碎裂、核溶解，同時calcium、TUNEL染色呈陽性。活化型caspase 3在中心區(qū)與周邊區(qū)的各型ENs中均呈陰性。電鏡：中心區(qū)，ENs的染色質凝集成不規(guī)則團塊狀，細胞質中出現(xiàn)大量空胞，核膜及胞膜均破裂。周邊區(qū)，ENs的染色質凝集、碎裂呈不規(guī)則團塊，最終均質化，核膜邊界模糊，胞膜仍保持完整。結論局灶性腦缺血后ENs呈現(xiàn)了兩種死亡途徑：缺血中心區(qū)核固縮伴胞體極度萎縮；周邊區(qū)核溶解伴胞體輕度萎縮。ENs不同形態(tài)學的改變與不同細胞死亡相關因子的活化相對應。

[關鍵詞]calpam；嗜酸性神經(jīng)元；前腦缺血；梗死；蒙古沙鼠

[中圖分類號]R364.1 [文獻標識碼]A [文章編號]2095-0616（2016）11-25-06

局灶性腦缺血導致兩種類型的形態(tài)學損傷：選擇性神經(jīng)元死亡和梗死。臨床和實驗數(shù)據(jù)表明選擇性神經(jīng)元死亡位于梗死灶的周邊部。嗜酸性神經(jīng)元（eosinophilic neurons，ENs）是神經(jīng)細胞缺血性損傷的一種形式，呈均勻一致的嗜酸性胞質染色及細胞核固縮、碎裂、溶解，常位于梗死的周邊區(qū)。我們的研究顯示：皮質高密度ENs區(qū)域進展為梗死，而低密度ENs區(qū)域進展為選擇性神經(jīng)元死亡。不僅ENs的細胞核發(fā)生固縮、碎裂、溶解，細胞體也從萎縮進展為腫脹。因此，腦缺血后出現(xiàn)各種形態(tài)的ENs，可能反映了不同的缺血程度、時間經(jīng)過或細胞死亡機制。

谷氨酸的異常大量釋放及其誘發(fā)的鈣內(nèi)流是神經(jīng)元缺血性損傷的上游通路，細胞壞死是缺血后細胞死亡的主要機制，而由caspase家族調控的細胞凋亡也被報道出現(xiàn)在腦缺血模型中。此外，細胞內(nèi)蛋白質異常降解、依賴ATP的泛素一蛋白酶體功能障礙也可能參與了缺血后神經(jīng)元死亡。

我們使用梗死灶呈緩慢進展的沙鼠局灶性腦缺血動物模型，探討局灶性腦缺血后大腦皮質ENs的形態(tài)學特征及細胞死亡相關因子在中心區(qū)與周邊區(qū)ENs中的表達。

1材料與方法

1.1一般材料

異氟醚（安耐吉化學）；二乙醚（上海麥克林生化科技有限公司）；多聚甲醛（北京索萊寶生物科技有限公司）；PBS緩沖液（北京雷根生物技術有限公司）；山羊血清（北京索萊寶生物科技有限公司）；茜素紅（AMR，Solon，Ohio，USA；1%）；細胞凋亡原位檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）；鋨酸磷酸鹽緩沖液（廣州競贏化工科技有限公司）；檸檬酸鉛（安耐吉化學）；乙酸雙氧鈾（成都麥卡?；び邢薰荆粔乃老嚓P蛋白酶抗體—mouseanti-μ-calpain（Chemicon；1：500稀釋）；細胞凋亡因子抗體—rabbit anti-actived caspase 3-p17（R&D Systems，Minneapolis，MN，USA；1：500）；內(nèi)質網(wǎng)應激蛋白抗體—mouse anti-GRP 78（Santa Cruz Bioteehnology；1：800）；蛋白質降解標志抗體—蛋白質降解標志物抗體—rabbit anti-ubiquitin（Dako Cytomation，Glostrup，DK；1：1000）。

1.2實驗動物

雄性蒙古沙鼠87只，16～20周齡，體重（66±6）g，購自三共制藥（Sankyo，東京）實驗動物中心。實驗按照全國衛(wèi)生研究所制定的關愛和使用動物用于研究的指導方針和學校動物實驗委員會的管理條例進行。

1.3實驗方法

1.3.1動物模型的制備 2%異氟醚麻醉，切開左頸皮膚，分離左頸動脈用小動脈夾夾閉10min誘發(fā)腦缺血。在頸動脈夾閉后進行卒中指數(shù)（strokeindex，SI）評分（總分25分），見表1；SI≥10可進展為腦梗死。為減少缺血性損傷的個體差異，我們選擇卒中指數(shù)14～17分（n=28）的動物作為“缺血動物”用于后續(xù)實驗，5h后以相同的處理方式再次使動物缺血10min。兩次缺血處理比單次缺血處理動物死亡率低。假手術組（n=4）以相同手術方式處理，但左側頸動脈不夾閉。

1.3.2取材 在缺血后3、6、12、24h，4d，1、2周，動物（每組4只）用二乙醚深度麻醉，4%緩沖多聚甲醛心內(nèi)灌注固定。腦組織切成3個序列冠狀切面：A面（前囟前0.5mm）、B面（前囟后1.5mm）、C面（前囟后3mm）。常規(guī)石蠟包埋切片（4μm），HE染色光鏡下觀察ENs的形態(tài)和分布。

1.3.3 ENs的定義 ENs是腦缺血后出現(xiàn)的胞質嗜酸性及細胞核固縮、碎裂、溶解的神經(jīng)元。缺血急性期部分ENs的細胞核異常伴胞漿嗜酸性，細胞體由腫脹至萎縮、由圓形至不規(guī)則。ENs根據(jù)形態(tài)學特征分為6種類型見表2：核輕度異常和胞體腫脹（圖1C、G、H，箭頭）；核固縮和胞體不規(guī)則萎縮（圖1D，箭頭）；核固縮和胞體極度萎縮（圖1E，箭頭）；核固縮和胞體輕度萎縮（圖1H、I，楔形箭頭）；核碎裂和胞體輕度萎縮（圖1I，空白箭頭）；核溶解和胞體輕度萎縮（圖1T、J，箭頭）。

1.3.4形態(tài)定量分析 為了探究ENs在皮層的縱向分布，在前囟前0.5ram，旁2.5、5.7mm的冠狀面上定義ROIs區(qū)（regions nf interest，ROIs）一與腦皮質表面垂直，寬0.5ram的條形區(qū)域（圖1B）。與我們的前期研究一致，缺血灶中心的正常組織進展為梗死（圖1F），而周邊的組織進展為選擇性神經(jīng)元死亡（圖1J），且缺血后2周持續(xù)存在。光鏡（×200）下計數(shù)ROIs區(qū)的ENs。

1.3.5免疫組織化學染色 HE染色的切片脫色后進行免疫組織化學染色，分析各型ENs中的細胞死亡相關因子。脫蠟進行HE染色的切片，在顯微照片（×400）中記錄ROIs區(qū)ENs的形態(tài)學特征。然后用1%鹽酸和80%酒精處理脫去HE染色，進行免疫組織化學染色。

1.3.5.1鈣染色 脫去HE染色的切片浸入茜素紅處理10min，使蓄積的鈣顯色。

1.3.5.2 TUNEL染色 用于檢測DNA斷裂。脫去HE染色的切片用細胞凋亡原位檢測試劑盒進行TUNEL染色。切片在蛋白消化酶液中孵育5min，37℃，PBS沖洗，加TdT反應液孵育10min，37℃，PBS沖洗。再滴加3%H₂O₂室溫5min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶。然后加過氧化物酶結合的抗體液，10min，37℃，PBS沖洗，再滴加DAB液室溫5min。

未進行HE染色與脫去HE染色的切片作對照以控制HE染色及脫色對免疫組織化學染色的影響。部分切片不加TdT酶進行溫箱孵育，作為陰性對照。

1.3.6免疫染色細胞陽性率 通過比較相同ROIs區(qū)的HE染色與HE染色脫色后進行免疫組織化學染色的顯微照片得到各型ENs免疫染色陽性的百分數(shù)，將其分為四種級別：76%～100%為（+++）、51%～75%為（++）、26%～50%為（+）、≤25%為（-）。

1.3.7透射電鏡切片制備 假手術組和腦缺血組動物（每組4只）用4%多聚甲醛加5%戊二醛的0.1mol/L的PBS灌注取腦，腦組織浸入灌注液中，作冠狀切，從ROIs區(qū)獲取腦組織樣本。用1%鋨酸磷酸鹽緩沖液固定3h，梯度丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋。制成超薄切片（100nm），檸檬酸鉛和乙酸雙氧鈾染色，透射電子顯微鏡觀察ENs的超微結構特征。

2結果

2.1 ENs的定量分析

假手術組腦組織未見ENs。缺血中心的ROI區(qū)（圖1K），核輕度異常和胞體腫脹的ENs缺血3h后出現(xiàn)，6h達峰值，12、24h后減少。核固縮和胞體不規(guī)則萎縮的ENs缺血6h后出現(xiàn)，12h達峰值，4d后減少。核固縮和胞體極度萎縮的ENs缺血24h后出現(xiàn)，4d達峰值，1周后減少。該型ENs區(qū)域2周后進展為梗死（圖1A、F）。缺血周邊的ROI區(qū)（圖1L），核輕度異常和胞體腫脹的ENs缺血12、24h后出現(xiàn)。之后，核固縮、核碎裂、核溶解的ENs缺血24h、4d后相繼出現(xiàn)。核固縮、核碎裂的ENs缺血1、2周后減少，而核溶解的ENs進一步增多。

2.2細胞死亡相關因子的表達

首先行HE染色，拍照記錄各型ENs，然后脫去HE染色，檢測細胞死亡相關因子在各型ENs的表達（表3，圖2）。

缺血中心區(qū)，核輕度異常和胞體腫脹的ENs表達calcium（64.5±9.4）%、μ-calpain（46.5±8.3）%、GRP 78（78.8±14.4）%、ubiquitin（75.7±11.6）%等細胞死亡相關因子。胞體不規(guī)則萎縮的ENs中calcium（91.4±7.2）%、μ-calpain（88.9±10.7）%的表達增高。胞體極度萎縮的ENs中calcium、TUNEL染色的陽性率分別為（73.8±10.2）%、（85.4±7.5）%，而胞體不規(guī)則萎縮與胞體極度萎縮的ENs中活化型caspase 3均呈陰性。

周邊區(qū)，核輕度異常和胞體腫脹的ENs中也表達calcium（60.5±10.7%、GRP78（75.8±12.6%、ubiquitin（70.7±12.7）%等細胞死亡相關因子，但μ-calpain（8.1±4.4）%呈陰性。核固縮、核碎裂的ENs中鈣染色的陽性率分別為（64.6±13.1）%、（47.9±13.4）%；TUNEL染色在兩種ENs中的陽性率分別為（69.4±8.5）%、（71.6±9.4）%；而caspase 3（2.6±1.8）%、（4.5±3.5）%和μ-calpain（4.5±3.5）%、（3.6±3.3）%在兩種ENs中始終呈陰性。

2.3超微結構特征

假手術組神經(jīng)元的細胞核、線粒體、糙面內(nèi)質網(wǎng)、高爾基復合體及多聚核糖體的結構清晰，形態(tài)均正常（圖3A）。

缺血中心區(qū)，核固縮和胞體極度萎縮的ENs缺血24h后出現(xiàn)，4d達峰值。缺血1d后可見大量不規(guī)則團塊狀的染色質凝集，胞質出現(xiàn)大量難以識別的空胞。缺血4d后核膜（圖3B，箭頭）及胞膜（圖3B，楔形箭頭）均破裂。

周邊區(qū)，核碎裂和胞體輕度萎縮的ENs中可見碎裂、不規(guī)則的染色質團（圖3C，箭頭），胞質密度增高，空胞結構不清，核膜邊界模糊，而細胞質保持完整。核溶解和胞體輕度萎縮的ENs染色質均質化，胞質完整，內(nèi)有大量空胞（圖3D，箭頭），部分細胞器殘存（圖3D，楔形箭頭）。

3討論

研究表明，缺血中心區(qū)及周邊區(qū)神經(jīng)元的死亡機制呈多樣性，這與缺血后神經(jīng)元不同的形態(tài)學改變相關。我們發(fā)現(xiàn)ENs有兩種死亡途徑：缺血中心區(qū)核固縮伴胞體極度萎縮；周邊區(qū)核溶解伴胞體嗜酸性、輕度萎縮。還發(fā)現(xiàn)ENs不同的形態(tài)學改變與不同細胞死亡相關因子的活化相對應。缺血后神經(jīng)元不可逆性損傷在光鏡下的特征為細胞核固縮、碎裂、溶解伴胞漿紅染或失去對蘇木素的親和力。細胞壞死的兩種形態(tài)學改變?yōu)椋汉四ぜ鞍て屏?；核溶解而胞膜完整。缺血急性期ENs胞體萎縮、嗜酸性伴核固縮，晚期細胞核失去對蘇木素的親和力伴胞漿輕度紅染（鬼影細胞）。這些發(fā)現(xiàn)與我們觀察到的ENs核固縮伴胞體萎縮僅見于缺血中心區(qū)相一致。核輕度異常和胞體腫脹的ENs是中心區(qū)或周邊區(qū)最早出現(xiàn)的ENs。“腫脹細胞”具有類似的形態(tài)學改變：胞體腫脹、核正常而染色質呈不規(guī)則團塊狀，過去的研究稱之為“尼氏體溶解”。這些改變多見于急性期，如大鼠腦缺氧缺血后3～4h。

各型ENs出現(xiàn)的時序性顯示細胞從一種形態(tài)進展到另一種形態(tài)。中心區(qū)核固縮和胞體不規(guī)則萎縮的ENs遲于核輕度異常和胞體腫脹的ENs出現(xiàn)，且calcium、μ-calpain表達進一步增高，之后出現(xiàn)的核固縮和胞體極度萎縮的ENs呈TUNEL染色陽性，這可能是損傷組織進展為梗死前的最終變化。周邊區(qū)ENs在GRP78、ubiquitin染色呈陽性，細胞內(nèi)蛋白質異常降解、依賴ATP的泛素-蛋白酶體功能障礙可能參與了缺血后周邊區(qū)ENs死亡。

在周邊區(qū)，許多研究依據(jù)活化型caspase 3、TUNEL染色陽性推測缺血神經(jīng)元死亡的主要機制為細胞凋亡。我們的結果顯示大部分ENs在活化型caspase 3染色呈陰性（表3，圖2E、E），而我們使用的抗體檢測caspase 3的p17亞基，可區(qū)分細胞凋亡與非細胞凋亡。我們的結果表明caspase 3依賴的細胞凋亡途徑可能不是周邊區(qū)ENs死亡的主要機制。近期研究表明活化型caspase 3在成熟缺血腦組織中呈陰性，在未成熟大腦中呈陽性。此外，在缺血中心區(qū)與周邊區(qū)多型ENs呈現(xiàn)TUNEL陽性，由于細胞壞死的最后階段發(fā)生DNA斷裂，TUNEL染色也可能陽性，所以呈TUNEL染色陽性的ENs不能證明一定發(fā)生細胞凋亡。

神經(jīng)元壞死有兩種超微形態(tài)學特征：細胞核腫脹、溶解，細胞膜破裂內(nèi)容物流出；細胞器腫脹，細胞萎縮。我們的研究顯示，在缺血中心區(qū)，神經(jīng)元變性的最后階段是核固縮和胞體極度萎縮的ENs，兼具兩種壞死的特點：染色質凝集、碎裂伴細胞膜破裂。在周邊區(qū)，核固縮、核碎裂伴胞體輕度萎縮的ENs在HE染色凋亡樣改變，且TUNEL染色也呈陽性，電鏡下進一步可見凝集、不規(guī)則的染色質團。但定量分析表明核溶解和胞體輕度萎縮的ENs是周邊區(qū)神經(jīng)元死亡的最后階段。有早期研究提出，細胞死亡可能存在一個從凋亡（早期損傷）到壞死（晚期損傷）的過程。本研究結果提示，缺血周邊區(qū)ENs的死亡途徑是從凋亡到壞死。

總之，本研究表明，局灶性腦缺血后ENs有兩種死亡途徑：缺血中心區(qū)核固縮伴胞體極度萎縮；周邊區(qū)核溶解伴胞體輕度萎縮。ENs不同形態(tài)學的改變與不同細胞死亡相關因子的活化相對應。