胡繼宏　賈佳　路娟等

[摘要]目的 通過比較Nesprin 1在不同癌細(xì)胞中的表達(dá)程度，為Nesprin 1與多種癌細(xì)胞之間的關(guān)系做初步探討。方法 采用Western blotting方法檢測Nesprin 1在人宮頸癌細(xì)胞（Hela）、人肺癌細(xì)胞（H-125）、人乳腺癌細(xì)胞（HCC-1937）、人膀胱癌細(xì)胞（5637）、人肝癌細(xì)胞（HepG2）、人胃癌細(xì)胞（BGC-823）、人結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT 116）、人食管癌細(xì)胞（Eca-109）、小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞（Raw 2647）等癌細(xì)胞當(dāng)中的表達(dá)。結(jié)果 各癌細(xì)胞組GAPDH均有表達(dá)，Nesprin 1各組表達(dá)量不同，從強(qiáng)到弱順序?yàn)镠CC-1937>H-125>HCTll6=Eca-109>RAW2647>BGC-823>HepG2>Hela>5637，其中人膀胱癌細(xì)胞5637的表達(dá)不明顯。結(jié)論 Nesprin 1蛋白可在多種癌細(xì)胞中表達(dá)，膀胱癌細(xì)胞中表達(dá)不明顯。

[關(guān)鍵詞]Nesprin；癌癥；肺癌；肝癌；胃癌；Hela；HCC-1937

[中圖分類號(hào)]R34 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]2095-0616（2016）11-31-03

癌癥是被預(yù)測為21世紀(jì)人類“第一殺手”的疾病?，F(xiàn)常見的癌癥有肺癌、肝癌、胃癌、血癌、腸癌、乳腺癌、食道癌、淋巴癌及腎癌等，其中前三者已成為我國癌癥中致死率最高的三大疾病。在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中，癌細(xì)胞是產(chǎn)生癌癥的源頭，癌細(xì)胞的瘋狂增殖、浸潤及侵襲是由多種因素作用的結(jié)果，人類的干預(yù)手段是否有效可以通過調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的各種蛋白及核酸的表達(dá)來判斷，其表達(dá)并不是單型，而是由多種因子組成。

Nesprin是核膜蛋白的組成部分，是一個(gè)含多個(gè)重復(fù)序列的核骨架和細(xì)胞骨架蛋白家族。目前已發(fā)現(xiàn)此家族由4個(gè)基因編碼組成，即Nesprin 1、Nesprin 2、Nesprin 3、Nesprin 4，其中Nesprin 1是目前研究較多的蛋白之一。最近有關(guān)nesprin家族細(xì)胞功能與腫瘤關(guān)系的研究成為熱點(diǎn)，認(rèn)為其下調(diào)或編碼的基因突變可能參與腫瘤的形成，為此可以作為腫瘤診斷和治療的靶點(diǎn)。不同的腫瘤其發(fā)生、發(fā)展的過程有所不同。本研究預(yù)同時(shí)觀察Nesprin 1在十種常見腫瘤中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步Nesprin 1在腫瘤診斷和治療中作用的研究提供線索。

1材料與方法

1.1細(xì)胞來源及主要試劑

1.1.1細(xì)胞 人宮頸癌細(xì)胞（Hela）、人肺癌細(xì)胞（H-125）、人乳腺癌細(xì)胞（HCC-1937）、人膀胱癌細(xì)胞（5637）、人肝癌細(xì)胞（HepG2）、人胃癌細(xì)胞（BGC-823）、人結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT 116）、人食管癌細(xì)胞（Eea-109）、小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞（Raw2647）均由上海吉?jiǎng)P基因提供。

1.1.2試劑 兔單克隆抗體Nesprin 1購于英國Abeam公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，江蘇碧云天公司；RIPA強(qiáng)裂解液，江蘇碧云天公司；Prestained protein marker，美國Thermo公司；ECL-PLUS/kit，美國Thermo公司。

1.1.3儀器 SDS-PAGE蛋白電泳儀（VE-180），上海天能公司；蛋白轉(zhuǎn)膜儀（VE-186），上海天能公司；冷凍高速離心機(jī)，美國Thermo公司；PVDF膜（IPVH00010），millipore公司。

1.2方法

采用Western blotting方法檢測Nesprin 1的表達(dá)：收集九種癌細(xì)胞，提取蛋白，用BCA法測定蛋白質(zhì)含量，進(jìn)行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉后加入抗Nesprin 1多抗（TBST 1：1000稀釋）4℃過夜；加入rabbit IgG（TBST 1：5000稀釋），室溫下孵育1.5h，TBST洗膜，加入ECL底物反應(yīng)液，放上x線片，關(guān)上暗盒，曝光2min；取出光片，放入顯影液中1min，漂洗后放定影液2min曝光。用目的條帶的灰度值比內(nèi)參GAPDH灰度值代表蛋白相對表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料服從正態(tài)分布用（x±s）表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD法檢驗(yàn)（α=0.05）。

2結(jié)果

Western blotting結(jié)果顯示（見圖1）：各癌細(xì)胞組內(nèi)參（GAPDH）均有表達(dá)。除人膀胱癌細(xì)胞5637的Nesprin 1表達(dá)不明顯外，其余各組均有不同程度表達(dá)，根據(jù)Nesprin 1蛋白相對表達(dá)量比較得出（見圖2），其表達(dá)強(qiáng)弱順序?yàn)镠CC-1937>H-125>HCT116=Eca-109>RAW2647>BGC-823>HepG2>Hela>5637。H-125與HCC-1937兩組的蛋白水平表達(dá)相較于其余組最高（均P<0.05），其中HCC-1937的蛋白表達(dá)相對H125更高（P<0.05）。HCT116與Eca-109之間無差異（P>0.05），其余各組細(xì)胞間均存在明顯差異（均P<0.05）。見表1。

3討論

本實(shí)驗(yàn)中所選癌細(xì)胞有Hela、H-125、HCC-1937、5637、HepG2、BGC-823、HCT 116和Eca-109八種，均為臨床上常見疾病，其種系為我國目前研究種類較多，使用頻率較高的類型。可以看到相對于同一參照，不同癌細(xì)胞的表達(dá)量不一致，其中以人乳腺癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞含量最高，而膀胱癌細(xì)胞最低。目前國內(nèi)有關(guān)癌細(xì)胞與Nesprin 1關(guān)系研究報(bào)道尚未發(fā)現(xiàn)，國外一項(xiàng)研究報(bào)道，在人類很多的癌癥早期（包括卵巢癌、子宮癌、宮頸癌、腎癌、肺癌、甲狀腺癌、胰腺癌等）均發(fā)現(xiàn)Nesprin 1的N端的同形異構(gòu)體表達(dá)下調(diào)，不同癌細(xì)胞其表達(dá)量不同，以肺腺癌細(xì)胞（Calu3）、乳腺癌細(xì)胞（MCF7）、宮頸癌細(xì)胞（Hela）和卵巢癌某些類型（Caov-3、SK-OV-3）表達(dá)量較高；而且同樣是卵巢癌細(xì)胞，其來源不同，Nesprin 1的DNA表達(dá)含量有所不同，與本研究結(jié)果類似，亞細(xì)胞定位的個(gè)體nesprin的變化由細(xì)胞類型決定，提示由于不同細(xì)胞類型Nesprin的功能不同，其Nesprin 1表達(dá)程度也不同。

癌細(xì)胞表現(xiàn)為核異型性，與正常細(xì)胞的核結(jié)構(gòu)存在顯著差異。細(xì)胞核的變形通常用于癌癥的病理診斷及抗癌療效的評(píng)價(jià)指標(biāo)。Nesprin蛋白家族是細(xì)胞核膜蛋白的重要組成部分，核內(nèi)膜的Nesprin蛋白家族和核外膜的SUN蛋白家族在細(xì)胞核周圍相互作用共同構(gòu)成了核一細(xì)胞骨架鏈接。當(dāng)這種鏈接破壞，信號(hào)通路的損害帶來了細(xì)胞核穩(wěn)定性、大小、形態(tài)和位置的改變，并影響細(xì)胞的遷移、分化。因此很多研究學(xué)者認(rèn)為Nesprin蛋白家族做為核一細(xì)胞骨架的重要組成部分，其異常必然與癌癥相關(guān)?，F(xiàn)有研究不僅發(fā)現(xiàn)Nesprin 1可能在人類很多癌癥早期就已發(fā)揮作用，還可能與乳腺癌的惡化進(jìn)展有關(guān)。另有研究報(bào)道，在卵巢癌和結(jié)腸直腸癌中編碼Nesprin 1蛋白的SYNE1存在基因突變，肺癌和結(jié)腸直癌中SYNE1基因存在頻繁的甲基化，并證實(shí)SYNE1參與了膠質(zhì)細(xì)胞瘤的惡化。

本實(shí)驗(yàn)沒有設(shè)立正常組織對照組，無法得出Nesprin 1與這些腫瘤的相關(guān)性，但依然可以看到不同癌細(xì)胞的表達(dá)量不一致。了解Nesprin 1在不同癌細(xì)胞的表達(dá)程度，有助于為進(jìn)一步探討Nesprin 1在腫瘤診斷和防治中的作用。本實(shí)驗(yàn)中，人膀胱癌細(xì)胞的Nesprin 1的表達(dá)量相較于其他癌細(xì)胞較低，是否可以作為鑒別診斷的指標(biāo)？這需要我們的進(jìn)一步驗(yàn)證。