杜任生,庾永基,肖偉明

(廣州市花都區(qū)第二人民醫(yī)院檢驗科　510850)

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碳青霉烯類非敏感腸桿菌的耐藥性與基因型研究

杜任生,庾永基,肖偉明

(廣州市花都區(qū)第二人民醫(yī)院檢驗科510850)

目的研究碳青霉烯類非敏感腸桿菌的耐藥性與基因型。方法自2013年6月至2014年6月采集碳青霉烯類非敏感腸桿菌共計110株，選用K-B紙片分析細(xì)菌對藥物有無敏感性，采用改良后的Hodge試驗分析碳青霉烯細(xì)菌在臨床上的使用反應(yīng)。測試菌株耐藥基因?qū)LAST對比(局部序列比對)與PCR、DNA進(jìn)行分析測試。結(jié)果測試出替加環(huán)素中介11株和耐藥4株(黏質(zhì)沙雷菌、產(chǎn)氣腸桿菌2株)。110株碳青霉烯類非敏感腸桿菌對頭孢噻肟和阿莫西林/克拉維酸耐藥率最高，頭孢他啶、四環(huán)素、復(fù)方磺胺甲噁唑、亞胺培南、厄他培南、環(huán)丙沙星、氨曲南等耐藥率均為64.9%～88.4%；而妥布霉素、阿米卡星、呋喃妥因、頭孢吡肟耐藥率較低，為16.6%～40.1%；敏感率增高的為替加環(huán)素、米諾環(huán)素，分別為82．0%和86.6%。研究發(fā)現(xiàn)110株碳青霉烯類非敏感腸桿菌當(dāng)中，檢測出blaSHV-12、blaCTX-M-15、ESBLs、blaCTX-M-33等基因。在110株碳青霉烯細(xì)菌當(dāng)中還檢測出1株黏質(zhì)沙雷菌，基因型號為blaKPC-2;改良后的Hodge試驗77株陽性，檢出率為70%。36株(32.7%)ESBLs呈陽性，5株陰溝腸桿菌(blaIMP-26)與1株產(chǎn)氣腸桿菌(blaVIM-2)基因、31株大腸埃希菌。結(jié)論碳青霉烯腸桿菌的基因型主要有blaKPC-2基因、blaIMP-26基因、blaVIM-2基因。藥敏結(jié)果顯示碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌對米諾環(huán)素和替加環(huán)素敏感率增高，臨床用藥時可根據(jù)患者病情進(jìn)行合理選擇，以達(dá)到控制感染的效果。

碳青霉烯類抗菌藥物；耐藥性；基因型；腸桿菌

近幾年隨著科技不斷發(fā)展，臨床上應(yīng)用廣譜β-內(nèi)酰胺酶與Amp C酶的腸桿菌科細(xì)菌越來越廣泛，對廣譜β-內(nèi)酰胺酶使用率也是不斷增加。由于臨床上經(jīng)常使用碳青霉烯類抗菌藥物進(jìn)行抗菌治療，隨著時間推移，造成臨床使用抗感染藥物的困難逐年上升。目前。碳青霉烯類腸桿菌被國內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注[1-4]。為進(jìn)一步研究碳青霉烯類腸桿菌基因型情況，采集本院感染菌株110株，分析碳青霉烯類腸桿菌抗耐藥性與基因型。

1　材料與方法

1.1菌株自2013年6月至2014年6月收集本院臨床標(biāo)本當(dāng)中分離的碳青霉烯類非敏感腸桿菌共110株，其中黏質(zhì)沙雷菌10株、布氏檸檬酸桿菌1株、陰溝腸桿菌20株、大腸埃希菌62株、氣腸桿菌14株、奇異變形桿菌1株、摩根摩根菌2株，實驗過程中亞胺培南與厄他培南只要出現(xiàn)上述兩種或兩種以上細(xì)菌耐藥即為非敏感菌株。產(chǎn)IMP-4型酶、KPC-2型酶肺炎克雷伯菌、TEM-5型、肺炎克雷伯菌ATCC700603酶肺炎克雷伯菌、IMI-1型酶陰溝腸桿菌、SHV-3型酶。

1.2試劑與儀器血瓊脂平板、M-H肉湯、血液增菌培養(yǎng)基、M-H瓊脂均為杭州天微生物公司生產(chǎn)。PCR檢測試劑盒為北京天根公司生產(chǎn)。阿米卡星、環(huán)丙沙星、頭孢西丁、頭孢噻肟、頭孢他啶/克拉維酸、阿莫西林/克拉維酸、妥布霉素、四環(huán)素、頭孢噻肟/克拉、維酸頭孢他啶、氨曲南、亞胺培南、米諾環(huán)素、藥敏紙片頭孢吡肟、呋喃妥因、替加環(huán)素、復(fù)方磺胺甲噁唑，以上產(chǎn)品均為上海生工公司生產(chǎn)。本次使用的VITEK-33全自動微生物分析儀為SP1000 PCR擴增儀，Tanon1600凝膠成像系統(tǒng)以及DYY-Ⅲ電泳儀。三羥甲基氨基甲烷(Tris) 、溴化乙錠和瓊脂糖、乙二胺四乙酸(EDTA)使用試劑盒均由上海天能公司生產(chǎn)。

1.3方法

1.3.1鑒定細(xì)菌及藥敏試驗本次采用菌株經(jīng)VITEK-32全自動微生物分析儀進(jìn)行鑒定，根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)使用K-B紙片檢測菌株的藥物敏感性[5]。

1.3.2檢測碳青霉烯本次檢測KPC-2型酶肺炎克雷伯菌顯示為陽性對照株，按照GLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行改良的Hodge試驗。

1.3.3擴增產(chǎn)物測序及 DNA 序列分析本文的擴增引物根據(jù)文獻(xiàn)[6-8]設(shè)計,委托上海生工公司合成。本次檢測PCR擴增產(chǎn)物使用ABI-PRISM3730儀器進(jìn)行測試，對檢測出的GenBank與BLAST數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,試劑使用配套試劑，操作過程完全按照儀器和試劑的說明書進(jìn)行。

1.3.4ESBLs檢測使用2013年版CLSI推薦的紙片法表型確證試驗[5]。

2　結(jié)　　果

2.1藥敏試驗結(jié)果實驗數(shù)據(jù)顯示，本次測試出替加環(huán)素中介11株和耐藥4株(黏質(zhì)沙雷菌、產(chǎn)氣腸桿菌2株)。本次試驗?zāi)退幝蕿?3.9%，顯示110株碳青霉烯類非敏感腸桿菌對與頭孢噻肟和阿莫西林/克拉維酸耐藥率最高，頭孢他啶、四環(huán)素、復(fù)方磺胺甲噁唑、亞胺培南、厄他培南、環(huán)丙沙星、氨曲南等耐藥率均為64.9%～88.4%；而妥布霉素、阿米卡星、呋喃妥因、頭孢吡肟耐藥率較低，為16.6%～40.1%；敏感率增高的為替加環(huán)素、米諾環(huán)素，分別為82．0% 和 86.6%。

2.2ESBLs與MHT檢測結(jié)果本次從110株碳青霉烯類非敏感腸桿菌細(xì)菌當(dāng)中測出產(chǎn)碳青霉烯酶細(xì)菌77株(70%)、陰溝腸桿菌15株(19.5%)、黏質(zhì)沙雷菌6株(7.8%)。77株產(chǎn)碳青霉烯酶細(xì)菌中大腸埃希菌49株(63.6%)、產(chǎn)氣腸桿菌5株(6.5%)。36株ESBLs細(xì)菌。數(shù)據(jù)顯示同時產(chǎn)ESBLs和碳青霉烯酶兩種酶的細(xì)菌為18株，占16.6%。見表1。

表1　　數(shù)據(jù)分析110株碳青霉烯類非敏感腸桿菌科細(xì)菌碳青霉烯酶與ESBLs的檢出率[n(%)]

2.3耐藥酶基因檢測及序列測定結(jié)果110株碳青霉烯類非敏感腸桿菌中，分別有33株(30%)、1株(0.9%)、5株(4.5%)檢出blaVIM-2、blaKPC-2、blaIMP-26等碳青霉烯酶基因；分別有9株(8.6%)、5株(4.5%)、1株(0.9%)檢測出blaCTX-M-3、blaSHV-12、blaCTX-M-15等ESBLs基因。62株大腸埃希菌中有31株(50.0%)檢出blaKPC-2基因，檢測出有8株攜帶blaSHV-12基因、1株攜帶blaCTX-M-15基因。20株陰溝腸桿菌中，有5株攜帶blaIMP-26基因、1株攜帶blaVIM-2基因、1株攜帶blaCTX-M-3基因、3株攜帶blaSHV-1基因。14株產(chǎn)氣腸桿菌檢出含blaKPC-2與blaSHV-12基因各1株。未從檸檬酸桿菌中檢測出GIM、SIM、GES、NDM-1、IMI、OXA、SPM等基因。除以上檢出基因還檢出10株黏質(zhì)沙雷菌、1株布氏檸檬酸桿菌、2株摩根摩根菌、1株奇異變形桿菌、1株blaKPC-2陽性、blaCTX-M-15基因，以上檢測未檢出碳青霉烯酶以及ESBLs基因。詳見圖1。

注：M為DNA marker；1～5分別為blaKPC-2、blaIMP-26、blaVIM-2、blaSHV-12、blaCTX-M-15；6為陰性菌株。

3　討　　論

本次研究數(shù)據(jù)顯示110株碳青霉烯類非敏感腸桿菌中含有blaVIM-2、blaIMP-26、blaKPC-2這3種碳青霉烯酶耐藥基因,陰溝腸桿菌基因主要有blaVIM-2、blaIMP-26，實驗發(fā)現(xiàn)碳青霉烯類非敏感腸桿菌可產(chǎn)ESBLs，本次實驗發(fā)現(xiàn)110株菌當(dāng)中有16.6%的菌株同時生產(chǎn)碳青霉烯酶與ESBLs，研究發(fā)現(xiàn)ESBLs，主要以blaCTX-M-15為主，blaSHV-12、blaCTX-M-3兩種基因為輔，主要分布于陰溝腸桿菌與產(chǎn)氣腸桿菌。碳青霉烯類中介或耐藥的腸桿菌科細(xì)菌以肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、黏質(zhì)沙雷菌等為主，這些細(xì)菌應(yīng)作為醫(yī)院感染防控的主要對象[6-7]。碳青霉烯類藥物被認(rèn)為是治療腸桿菌科細(xì)菌感染較為有效的藥物，但近年來，腸桿菌科細(xì)菌對此類藥物的耐藥率在逐年增加。耐藥的主要機制是菌株產(chǎn)生碳青霉烯類水解酶(包括A、B和D類)，其次是 ESBLs 或頭孢菌素酶合并外膜蛋白改變和(或)外排泵作用，導(dǎo)致碳青霉烯類抗菌藥物敏感性下降甚至耐藥[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)碳青霉烯類非敏感腸桿菌敏感率低于厄他培南以及亞胺培南，造成的原因有可能是非碳青霉烯酶引起的，造成其敏感率降低的原因還需進(jìn)一步研究。藥敏結(jié)果顯示碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌對米諾環(huán)素和替加環(huán)素敏感率增高，臨床用藥時可根據(jù)患者病情進(jìn)行合理選擇，以達(dá)到控制感染的目的。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.16.054

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1673-4130(2016)16-2333-02

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