周海玲，馬麟，許舜軍，楊柳，，黃珍霞（.廣東省中醫(yī)院，廣東廣州500；.廣州萬正藥業(yè)有限公司，廣東廣州50663）

蒼耳子水提取物UPLC和HPLC特征圖譜的比較研究

周海玲1，馬麟1，許舜軍2，楊柳1，2，黃珍霞1
（1.廣東省中醫(yī)院，廣東廣州510120；2.廣州萬正藥業(yè)有限公司，廣東廣州510663）

目的通過建立并比較蒼耳子水提物的超高效液相色譜（UPLC）和常規(guī)高效液相色譜（HPLC）的特征化學(xué)圖譜，篩選蒼耳子藥材品質(zhì)控制的優(yōu)化方案。方法分別建立蒼耳子藥材水提物的UPLC和HPLC特征化學(xué)圖譜分析方法，比較2種方法的分離能力、分離效率以及檢測靈敏度等。UPLC檢測色譜條件如下:色譜柱為Agilent SB-C18柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫為35℃；流動相A為甲醇，B為0.1%（體積分?jǐn)?shù)，下同）H3PO4（pH=2.3），梯度洗脫；流速為0.4 mL/min；檢測波長為220 nm。HPLC檢測采用Waters Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫為35℃；流動相A為甲醇，B為0.1%（體積分?jǐn)?shù)）H3PO4（pH=2.3），梯度洗脫；流速為1.0 mL/min；檢測波長為220 nm。結(jié)果 分別建立了27批不同產(chǎn)地蒼耳子藥材的UPLC和HPLC特征圖譜，共檢測到16個共有色譜峰，指認(rèn)了其中10個色譜峰的化學(xué)歸屬。結(jié)果表明，UPLC法可大大縮短蒼耳子藥材水提取物的分析時間，且檢測靈敏度也有顯著提高，說明UPLC法在分離能力和分離效率方面明顯優(yōu)于HPLC法。結(jié)論與HPLC法相比，UPLC法既達(dá)到了分析的高通量，得到更高的分析靈敏度；又大大提高了分析速度，減少了有機溶劑的消耗。UPLC法測定中藥材蒼耳子水提取物的特征圖譜可為其質(zhì)量控制提供更為高效快速的檢測方法。

UPLC法；HPLC法；蒼耳子水提物；特征化學(xué)圖譜

蒼耳子為菊科植物蒼耳（Xanthium sibiricum Patr.）干燥成熟帶總苞的果實，中醫(yī)臨床上主要用于風(fēng)寒頭痛、鼻淵流涕、風(fēng)疹瘙癢、濕痹拘攣等癥的治療，為歷代治療鼻淵及頭痛的要藥［1-2］。蒼耳子含有大量的有機酸類化合物［3-5］，這類化合物被證實具有良好的抗氧化、抗感染、抗微生物、抑制酶活性、保護肝細(xì)胞、抑制血小板凝集等生物活性［6］，是蒼耳子發(fā)揮臨床療效的重要藥效組分。超高效液相色譜法（UPLC法）是分離科學(xué)中的一個新類別，相對于傳統(tǒng)HPLC法而言，UPLC法在柱效、分析通量、靈敏度及色譜峰容量等方面均有顯著提高［7-8］，彌補了傳統(tǒng)HPLC系統(tǒng)的不足，為中藥等復(fù)雜體系的分離分析提供了良好的技術(shù)平臺［9］。本文以中藥蒼耳子為研究對象，在前期UPLC和HPLC指紋圖譜研究的基礎(chǔ)上［10-11］，建立并比較了蒼耳子水提物的UPLC及HPLC特征圖譜，同時對其主要共有色譜峰的化學(xué)歸屬進(jìn)行了指認(rèn)。

1　儀器、材料及試劑

2695型高效液相色譜儀（配有自動進(jìn)樣器、在線脫氣機、Waters 2998型PDA檢測器、Empower 2色譜工作站，美國Waters公司）。Acquity UPLC超高效液相色譜系統(tǒng)（配有二元超高壓溶劑系統(tǒng)、自動進(jìn)樣恒溫樣本管理器、柱溫箱、紫外檢測器和Empower 2色譜工作站，美國Waters公司）；AB 135-S型十萬分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

蒼耳子藥材購自全國各大藥材集散地，產(chǎn)地主要為江西、廣西、陜西等地［11］，經(jīng)廣東省中醫(yī)院副主任中藥師馮倩茹鑒定為藥典正品蒼耳子X.sibiricum，詳細(xì)信息見表1。

對照品原兒茶酸（批號:809-200102，供質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定用）購自中國藥品生物制品檢定所；對照品新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、1，3-二咖啡?？鼘幩?、3，5-二咖啡酰奎寧酸、1，5-二咖啡?？鼘幩岷?，5-二咖啡酰奎寧酸（批號均為090619，質(zhì)量分?jǐn)?shù)按HPLC面積歸一化法測定均≥98%）購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；噻嗪雙酮苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)按HPLC面積歸一化法測定均≥98%）由本實驗室制備所得。甲醇為色譜純，購自美國Fisher公司；其他化學(xué)試劑均為分析純，購自廣州化學(xué)試劑廠；超純水經(jīng)Milli-Q系統(tǒng)純化制備［10］。

表1　27批蒼耳子藥材的來源信息表Table 1 A summary of 27 batches of Fructus Xanthii samples

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

2.1.1UPLC測定的色譜條件

色譜柱:Agilent SB-C18柱（1.8 μm，50 mm×2.1 mm）；流動相:A為甲醇，B為 0.1%H3PO4（pH= 2.3），梯度洗脫條件:0～2 min，3%A→5%A；2～10 min，5%A→17%A；10～11 min，17%A→20%A；11～14 min，20%A→28%A；14～17 min，28%A→30%A；17～20 min，30%A→35%A；流速:0.4 mL/min；進(jìn)樣量:5 μL；柱溫:35℃；檢測波長220 nm。

2.1.2HPLC測定的色譜條件

色譜柱:Waters Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流動相:A為甲醇，B為0.1%H3PO4（pH=2.3），梯度洗脫條件:0～5 min，0%A；5～15 min，0%A→10%A；15～20 min，10%A→14%A；20～25 min，14%A→15%A；25～30 min，15%A→19%A；30 ～35 min，19%A→25%A；35～45 min，25%A→35%A；45～70 min，35%A→45%A；流速:1.0 mL/min；進(jìn)樣量:10 μL；柱溫:35℃；檢測波長:220 nm。

2.2混合對照品溶液的制備

分別取對照品原兒茶酸、新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、蒼耳子噻嗪雙酮苷、1，3-二咖啡?？鼘幩?、3，5-二咖啡?？鼘幩?、1，5-二咖啡?？鼘幩岷?，5-二咖啡?？鼘幩? mg，精密稱定，置5 mL量瓶中，以20%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得對照品儲備液。分別取上述對照品儲備液適量，置于同一10 mL棕色容量瓶中，加20%乙腈稀釋至刻度，得混合對照品溶液。

2.3蒼耳子供試品溶液的制備

取蒼耳子藥材粉末（過4號篩）約2 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加水回流提取3次（20、20、10 mL），每次45 min，濾過，合并濾液至50 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.4蒼耳子特征圖譜測定的方法學(xué)考察［11］

分別精密吸取混合對照品溶液5份，按照“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄各成分的保留時間和峰面積，其保留時間和峰面積的RSD值介于0.2%～1.1%；取蒼耳子藥材適量，按照“2.3”項下方法平行制備供試品溶液5份，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)測定5次，記錄各特征成分的保留時間和峰面積，其保留時間和峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別低于0.9%和3.6%；同一批供試品溶液在不同時間點（0、2、4、8、24、48 h）的穩(wěn)定性測試結(jié)果顯示，其保留時間和峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不高于0.6%和2.8%，上述結(jié)果表明本特征圖譜測定方法可行。

2.5蒼耳子水提物特征圖譜的測定

2.5.1色譜峰的指認(rèn)

分別精密吸取混合對照品、各供試品溶液10 μL，按“2.1”項下條件測定，記錄流出曲線。根據(jù)已知對照品、化合物的分子離子峰信息，結(jié)合紫外光譜、色譜保留時間等信息共進(jìn)行了10個色譜峰的化學(xué)歸屬［7，11］，峰2、5、7、8、9、10、11、13、14、16分別為原兒茶酸、新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、蒼耳子噻嗪雙酮苷、1，3-二咖啡?？鼘幩?、3，5-二咖啡?？鼘幩帷?，5-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡酰奎寧酸。UPLC法、HPLC法測定所得的對照品溶液、27批蒼耳子水提物特征圖譜的共有模式圖譜見圖1。

圖1　HPLC法與UPLC法測定的混合對照品溶液圖譜及27批蒼耳子水提物特征圖譜的共有模式Figure 1 The chromatograms of mixed reference substances and common patterns of 27 samples of Fructus Xanthii water extract by HPLC and UPLC

2.5.2 蒼耳子水提取物的HPLC和UPLC特征圖譜比較

本試驗首次建立了蒼耳子水提物的UPLC特征圖譜，并與HPLC特征化學(xué)圖譜進(jìn)行比較和分析。研究中UPLC與HPLC法采用的流動相系統(tǒng)相同，均為甲醇-0.1%H3PO4，色譜柱均為ODS C18柱。比較2種方法儀器所記錄的色譜圖，可以非常直觀地看出，其色譜面貌比較一致，峰2、3、4、5、6、9、10、11、13、14、16在2張色譜圖中均可一一對應(yīng)，但在二者前半段的運行時間里，各色譜峰的出峰順序存在差異，這可能是由于UPLC色譜柱的尺寸及填料的改變，特別是硅膠基質(zhì)中鍵合了橋式乙烷基，引起色譜行為發(fā)生改變。

通過2種測定條件分析比較可知:HPLC方法轉(zhuǎn)換并優(yōu)化為UPLC方法后，蒼耳子水提取物的分離時間由原來的70 min縮短至20 min，樣品檢測時間縮短至約原來的1/3；進(jìn)樣量減少了1/2，溶劑用量降低到約原來的1/9，且UPLC法所得響應(yīng)值高于HPLC，在基本保持分離度的同時大大縮短了分析時間，減少了有機溶劑的用量，降低了分析成本。見表2。

3　討論與結(jié)論

中藥的質(zhì)量控制是保證中藥的安全、有效、質(zhì)量穩(wěn)定可靠的必要條件。蒼耳子為常用中藥，是歷代治療鼻淵及頭痛的要藥，其化學(xué)成分及藥理活性的研究已有較多文獻(xiàn)報道，但藥材標(biāo)準(zhǔn)卻還局限于來源、性狀和理化鑒別，無更多的質(zhì)量控制項目［2］，因此，迫切需要建立一種快速、簡便且能準(zhǔn)確反映其真?zhèn)蝺?yōu)劣的質(zhì)量評價方法。

表2　蒼耳子水提物HPLC與UPLC分析條件的比較Table 2 　Comparison of HPLC and UPLC analysis conditions

本研究首次建立了蒼耳子水取物的UPLC和HPLC化學(xué)特征圖譜，通過對二者的分析比較得知，2種方法均有較好的整體分離度，其色譜面貌比較一致，可結(jié)合蒼耳子有效成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定判別蒼耳子藥材的真?zhèn)蝺?yōu)劣。HPLC法需花費70 min的分析時間，而UPLC法可在20 min內(nèi)完成整個分析過程，可改善傳統(tǒng)HPLC法在分析時所遇到的耗時、耗能等技術(shù)問題，且具有更高的分辨率與靈敏度、更少的進(jìn)樣量和溶劑消耗量，應(yīng)用到蒼耳子藥材的鑒定與質(zhì)量評價中具有明顯優(yōu)勢。建立的蒼耳子提取物的2種特征化學(xué)圖譜均共有16個共有峰，對其中10個共有峰進(jìn)行了化學(xué)歸屬的確認(rèn)，可以顯著增強質(zhì)量控制的準(zhǔn)確性和專屬性，為蒼耳子藥材的質(zhì)量評價提供了一定的借鑒作用。

［1］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1997:1071-1072.

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（責(zé)任編輯：劉曉涵）

Comparison on characteristic chromatograms of water extract of Fructus Xanthii with UPLC and HPLC

ZHOU Hailing1，MA Lin1，XU Shunjun2，YANG Liu1，2，HUANG Zhenxia1
（1.Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine，Guangzhou 510120，China；2.Guangzhou ImVin Pharmaceutical Co.，Ltd.，Guangzhou 510663，China）

Objective To establish a more feasible quality control method for Fructus Xanthii water extract by comparing the characteristic chromatograms obtained with ultra performance liquid chromatography （UPLC）and conventional HPLC.Methods UPLC and HPLC characteristic chromatogram of water extract of Fructus Xanthii were established respectively，and then their chromatographic behaviors were compared such as their peak capacity，resolution and sensitivity，and so on.UPLC separation was carried out on an waters symmetry C18column（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）with the mobile phase consisting of methanol and water containing 0.1%phosphoric acid（pH=2.3）at a flow rate of 0.4 mL/min，and the detective wavelength was at 220 nm and the column temperature was at 35℃.HPLC separation was performed on a waters symmetry C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm）.The mobile phase was consisted of methanol and water containing 0.1%phosphoric acid（pH=2.3）with a flow rate of 1.0 mL/min，and the detective wavelength was set at 220 nm and column temperature was at 35℃.Results The established characteristicchromatogram of Fructus Xanthii had 16 characteristic common peaks，of which 10 constituents were identified by comparison with the chromatographic behaviors and UV spectra of reference substances. Compared with HPLC fingerprint，the UPLC fingerprint showed obvious advantages in peak shape，sensitivity，and separation time.Conclusion In consideration of the mentioned advantages along with higher analytical sensitivity，less injection volume and solvent consumption，UPLC characteristic chromatogram might be proposed for the quality evaluation method of Fructus Xanthii.

UPLC；HPLC；Fructus Xanthii water extract；chemical fingerprint

R284.1

A

1006-8783（2016）04-0454-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016050602

2016-05-06

周海玲（1981—），女，中藥師，從事醫(yī)院藥學(xué)研究；通信作者:楊柳（1974—），女，研究員，碩士研究生導(dǎo)師，從事中藥活性成分與質(zhì)量評價研究，Email:yangliu979@hotmail.com。

網(wǎng)絡(luò)出版時間:2016-07-011 10:27 網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160711.1027.002.html