鄭惠娜，周春霞，陳志成，蘇偉明，章超樺，秦小明（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點實驗室，國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心（湛江），廣東湛江524088）

胰酶酶解珍珠貝分離蛋白制備低苯丙氨酸寡肽制品

鄭惠娜，周春霞，陳志成，蘇偉明，章超樺，秦小明
（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點實驗室，國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心（湛江），廣東湛江524088）

苯丙酮酸尿癥（PKU）是一種常見的氨基酸代謝性疾病，低苯丙氨酸飲食對于PKU患者非常重要。本研究以珍珠產(chǎn)業(yè)副產(chǎn)物馬氏珠母貝肉為原料，提取分離蛋白后，采用胰酶酶解、超濾分級及活性炭吸附分離技術(shù)制備低苯丙氨酸寡肽營養(yǎng)功能基料。研究結(jié)果顯示：隨著酶解時間的進行，酶解液中＜5 ku的寡肽含量呈現(xiàn)先增加后減少趨勢（p＜0.05），酶解1 h時，酶解液中所含的寡肽含量最多；經(jīng)過超濾分級后，＞5 ku和＜300 u的酶解液中仍存在一些寡肽殘留，其中＞5 ku組分中寡肽含量為10.43%，＜300 u組分含量為24.52%，而300 u～5 ku組分中寡肽含量達到了68.38%；＜300 u組分的苯丙氨酸含量最高達到9.52%，活性炭對芳香族氨基酸的吸附量均高于其他氨基酸，300 u～5 ku組分經(jīng)過活性炭吸附后得到1.29%的低苯丙氨酸寡肽溶液。可以以此為基料開發(fā)輔助治療苯丙酮尿癥、吸收率高的低苯丙氨酸寡肽營養(yǎng)功能制品。

胰酶，珍珠貝，低苯丙氨酸，寡肽

苯丙酮酸尿癥（PKU）是一種常見的氨基酸代謝性疾病，是由于染色體基因突變導(dǎo)致肝臟中苯丙氨酸羥化酶（PAH）缺陷從而引起苯丙氨酸（PA）代謝障礙，導(dǎo)致苯丙氨酸在人血液中積聚［1］。根據(jù)1983年左

啟華教授報告，我國發(fā)病率約為1/16500，并且出現(xiàn)了逐年遞增的趨勢。如果忽視了此疾病的治療或治療時間較遲均會導(dǎo)致患者智力和神經(jīng)系統(tǒng)的損害。然而，如果在最初就開始控制苯丙氨酸的攝入量，PKU患兒即能夠像正常兒童那樣成長。對于PKU患者，這種飲食上的控制必須是長期的，因此低苯丙氨酸飲食對于PKU患者非常重要［2］。然而，目前市面上的低苯丙氨酸食品非常少，主要以不含有苯丙氨酸的配方奶粉為主。市面上低苯丙氨酸制品非常缺乏，無法滿足苯丙酮尿癥患者的需求。寡肽是氨基酸藥物、保健品發(fā)展的趨勢［3］。而開發(fā)新的蛋白資源用于制備低苯丙氨酸寡肽具有重要的現(xiàn)實意義。馬氏珠母貝肉是珍珠養(yǎng)殖采珠后的副產(chǎn)品，也是一種高蛋白、低脂肪的海產(chǎn)品，并具有清熱解毒、平肝潛陽等功效，其蛋白含量高達74.9%（干基計）［4］，以馬氏珠母貝肉為原料開發(fā)具有輔助治療PKU疾病的寡肽功能制品還未見報道。因此，本研究在前期研究基礎(chǔ)上，提取馬氏珠母貝分離蛋白后，選擇合適的蛋白酶種類進行酶解、進一步利用超濾分級及活性炭吸附分離技術(shù)制備具有輔助治療苯丙酮尿癥、吸收率高的低苯丙氨酸寡肽營養(yǎng)功能基料，以期為進一步開發(fā)利用馬氏珠母貝肉提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬氏珠母貝 購于湛江市東風(fēng)市場，新鮮貝肉去殼取肉清洗干凈，-18℃貯藏備用；胰酶（400 U/g）

南寧龐博生物工程有限公司；Folin-酚試劑盒 北京鼎國生物技術(shù)有限公司；活性炭 江西豐城市榮豐活性炭廠；牛血清白蛋白BSA 廣州市齊云生物科技有限公司；其他試劑 均為分析純。

pH-25數(shù)顯pH酸度計 上海康儀儀器有限公司；DL6M大容量冷凍離心機 湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司；T18 basic高速分散機 德國IKA公司；Sigma 3K3離心機 德國Brawn Biotech International公司；UV-2550紫外可見分光光度計 日本島津公司；LD-50G-D超純水機 重慶利迪實驗儀器設(shè)備有限公司；HL-2電腦恒流泵 上海瀘西分析儀器廠；N1001+S+W旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 浙江托普儀器有限公司；WTM-1812G膜分離設(shè)備 杭州沃騰膜工程有限公司；QJ-100酶解罐 溫州明科機械有限公司；S450三足立式離心機 上海地元離心機有限公司；FPLC制備型蛋白純化系統(tǒng) 美國GE公司；5 ku超濾離心管 美國Millipore公司；Superdex Peptide 10/300 GL凝膠過濾層析柱 美國GE公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分離蛋白的制備 參考資料［5］，準(zhǔn)確稱取5 kg的珍珠貝肉，按1∶3（w/v）比例加入蒸餾水，采用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液至pH12，攪拌3 h，然后4000 r/min離心20 min，取上清液，0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)至最佳酸沉pH4.5～5.0，靜置1 h，4000 r/min離心15 min，取沉淀，然后加入蒸餾水溶解后，0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)分離蛋白溶液pH至7.5。

1.2.2 分離蛋白的酶解及寡肽含量的測定 調(diào)節(jié)分離蛋白濃度為5 mg/mL，分別取250 mL于5個錐形瓶中，按照2000 U/g蛋白加入酶量，在55℃水浴鍋中酶解0、1、2、3、4、5 h，酶解完成后在95℃下水浴鍋滅酶10 min，冷卻至室溫，10000 r/min離心20 min。然后，取上述離心后的上清液6 mL，于5 ku的超濾離心管，4000 r/min離心超濾30 min后，取全部過濾液，采用50 mL容量瓶定容后，雙縮脲法測定濾液中寡肽含量，并確定酶解時間。

以谷胱甘肽為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y=0.1608x+6E-17，R2=0.9946。

1.2.3 樣品分子量分布的確定 樣品分子量分布測定采用凝膠過濾層析法，使用Superdex Peptide 10/ 300 GL分析柱進行樣品分析，流動相為0.05 mol/L pH7.4的Tris-HCl緩沖液（含0.5%NaCl）。進樣量：20 μL；流速：0.7 mL/min；檢測波長：214 nm；柱子溫度：25℃。

1.2.4 超濾系統(tǒng)對酶解液進行分級 根據(jù)1.2.2分析結(jié)果確定最佳酶解時間制備酶解產(chǎn)物。首先，將酶解產(chǎn)物以1 mL/min流速經(jīng)過陶瓷膜，收集過濾液，進一步采用截留分子量為5 ku超濾膜進行超濾，收集5 ku以下的超濾液，再采用截留分子量為300 u的納濾膜進行納濾，酶解上清液超濾后分別得到分子量范圍為＞5 ku、300 u～5 ku和＜300 u的三種不同分子量組成的酶解超濾液。

1.2.5 蛋白及寡肽含量計算 分別采用福林酚法和超濾結(jié)合雙縮脲法對酶解分級液進行蛋白質(zhì)和寡肽含量的測定。然后根據(jù)下列公式計算各級超濾酶解液的寡肽百分含量。

計算公式如下：P（%）=N/M×100

式中：P—酶解液寡肽占蛋白百分含量；N—各級酶解液寡肽含量g/L；M—各級酶解液蛋白含量g/L。

1.2.6 活性炭脫除酶解液中苯丙氨酸 將活性碳填充入色譜柱中，含有300 u～5 ku組分的酶解超濾液以流速8 mL/min流經(jīng)活性炭色譜柱進行脫色及苯丙氨酸脫除。

1.2.7 氨基酸組成分析 氨基酸分析送至廣東分析測試中心進行檢測。具體分析步驟：稱取樣品數(shù)毫升，加入2 mL 5.7 mol/L HCl，置于110℃烘箱內(nèi)水解24 h，然后除去過量的HCl，加緩沖溶液稀釋到50 mL，搖勻。采用氨基酸自動分析儀分析，上機條件：流動相為專用緩沖液PI-1、2、3、4（分別為pH2.2、3.3、4.0、6.4檸檬酸鈉緩沖液），流速：0.225 mL/min，溫度：25℃，上樣量50 μL［6］。

1.2.8 實驗數(shù)據(jù)分析 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0進行方差（ANOVA）顯著性（p＜0.05）分析，Excel 2007軟件進行數(shù)據(jù)處理及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳胰酶酶解時間的確定

低苯丙氨酸寡肽制品應(yīng)同時具備寡肽含量高而苯丙氨酸含量低的特點，因此，如何通過酶解獲得高含量的寡肽是制備的關(guān)鍵。前期研究已經(jīng)確定胰酶為最佳釋放芳香族氨基酸的酶類，其含有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和羧肽酶，是以Phe-、Tyr-、Trp-、Leu-

COOH等基團為酶切位點的復(fù)合酶［7］。因此，以提純的珍珠貝分離蛋白為底物，采用胰酶進行酶解，確定最佳寡肽得率的酶解時間，結(jié)果見圖1。

圖1 不同酶解時間對超濾后酶解液＜5 ku寡肽含量的影響Fig.1 Effect of different enzymatic hydrolysis time on＜5 ku oligopeptide content after ultrafiltration

從圖1可知，隨著酶解時間的進行，酶解液中＜5 ku的寡肽含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢（p＜0.05）。酶解過程是一種復(fù)雜的生化反應(yīng)過程，在酶解開始階段，分子量較大的蛋白被酶解為多肽，隨著酶解反應(yīng)的進行，多肽又被酶解為短肽，同時也有部分水解成氨基酸，所以，短肽在酶解液中的含量隨著蛋白及多肽的降解而增加，但是同時，也隨著其被降解成氨基酸而減少［8-9］。在酶解的開始1～2 h階段，大部分蛋白已經(jīng)被酶解為多肽和寡肽，在隨后的酶解時間段內(nèi)，一部分多肽和寡肽逐漸水解成氨基酸，因此，酶解液中寡肽含量并不是隨著酶解時間的進行呈增加，而是達到一個最大峰值后開始下降，從結(jié)果分析，確定最佳酶解時間為1 h。

2.2 酶解液分子量分布分析

圖2顯示了不同酶解時間制備的酶解液的分子量分布圖譜，選擇接近10000 u和5000 u的兩個標(biāo)準(zhǔn)分子量物質(zhì)紅細(xì)胞色素C（12355 u），抑肽酶（6512 u）為界限分析分子量分布情況。結(jié)果分析顯示，酶解前的蛋白溶液只有一個色譜峰，本實驗采用的分析柱是Superdex Peptide 10/300 GL，只能有效分離分子量在100～7000 u之間的蛋白或多肽，大于7000 u的蛋白或多肽在同一保留時間出峰。因此，酶解前的蛋白溶液大部分的分子量均大于7000 u。而隨著酶解時間的進行，第一個大峰消失，逐漸酶解成多肽和寡肽，從圖中1～5 h酶解液的圖譜分析，隨著酶解時間的進行，大分子的肽峰面積逐漸減小，小分子的肽或氨基酸峰面積逐漸增加，說明酶解過程的進行，然而，這種變化趨勢在開始的1 h內(nèi)變化較為明顯，隨后的水解5 h過程中雖然峰圖譜有所變化，但是變化程度較小，因此，確定酶解時間為1 h。

超濾分級是蛋白酶解液常用的分離方法［10］。圖3比較分析了酶解1 h酶解液和采用5 ku超濾膜超濾后酶解液的分子量分布圖。從圖中結(jié)果可以看出，采用5 ku超濾膜超濾后，大分子的蛋白峰明顯被超濾截留。

2.3 超濾各級酶解液寡肽含量分析

圖2 不同酶解時間對酶解液分子量分布的影響Fig.2 Effect of different enzymatic hydrolysis time on the molecular weight distribution of the hydrolyzate

根據(jù)上述研究結(jié)果，確定最佳酶解時間為1 h，大量制備酶解液進行下一步的超濾分級分離。研究顯示，超濾膜能夠?qū)γ附猱a(chǎn)物進行有效分離分級［10］。本研究采用5 ku、300 u截留分子量的超濾膜對酶解液進行分級分離，獲得三種分級酶解液：＞5 ku酶解液、300 u～5ku酶解液和＜300 u酶解液。＞5 ku酶解液主要是一些蛋白和多肽，＜300 u酶解液主要是氨基酸和鹽類物質(zhì)，300 u～5 ku酶解液主要是＜5 ku的寡肽，這部分為目標(biāo)產(chǎn)物。

圖3 酶解液及5 ku超濾后酶解液分子量分布對比圖Fig..3 Comparison of the molecular weight distribution of hydrolyzate and＜5 ku hydrolyzate

圖4 酶解液各分級組分＜5 ku寡肽含量比較Fig.4 Comparison of＜5 ku oligopeptide content each grade hydrolyzate

本研究分別分析了各分級酶解液中＜5 ku的寡肽占溶液蛋白的百分含量，結(jié)果見圖4。從圖中結(jié)果分析，經(jīng)過超濾分級后，＞5 ku和＜300 u的酶解液中仍存在一些寡肽殘留。其中＞5 ku組分中寡肽含量為10.43%，＜300 u組分中24.52%，而300 u～5 ku組分中寡肽含量達到了68.38%，其余部分可能是一些氨基酸和蛋白。

表1 氨基酸組成及含量（%，n=2）Table1 Amino acid components and contents（%，n=2）

2.4 活性炭吸附前后酶解液氨基酸組成分析

活性炭表面具有特殊的亂層石墨結(jié)構(gòu)微晶區(qū)，碳原子呈六角形排列，這種非極性結(jié)構(gòu)使其對有機物碳?xì)洳糠钟袕娏业姆兜氯A力作用，并能使大多數(shù)含芳環(huán)化合物的芳環(huán)部分以平躺方式吸附［11］。因此，活性炭對氨基酸的吸附既受氨基酸自身性質(zhì)影響也受氨基酸存在體系影響。

表1顯示了酶解前后、三種分級酶解液及活性炭吸附后寡肽溶液的氨基酸組成，從表中結(jié)果分析，酶解前蛋白溶液苯丙氨酸含量為4.23%，酶解后酶解液的苯丙氨酸含量為3.59%，相比于其他兩個超濾組分，＜300 u組分的苯丙氨酸含量最高達到9.52%，由于采用胰酶的酶切位點特點，酶解后產(chǎn)生較多游離苯丙氨酸，＜300 u組分主要含有游離氨基酸，因此，被酶解出的游離苯丙氨酸在這部分中含量較高，通過分級分離可以適當(dāng)分離出一些苯丙氨酸組分，然而，經(jīng)過分級后300 u～5 ku的苯丙氨酸含量仍較高，因此采用活性炭進一步對其進行吸附，前期研究顯示［12-13］，無論是處于結(jié)合狀態(tài)還是游離狀態(tài)，活性炭對芳香族氨基酸的吸附量均高于其他氨基酸，吸附后獲得苯丙氨酸含量約為1.29%的低苯丙氨酸寡肽溶液。

3 結(jié)論

采用胰酶酶解珍珠貝分離蛋白，酶解1 h可以獲得最佳寡肽含量酶解產(chǎn)物，采用超濾分級和活性炭吸附對酶解產(chǎn)物進行分級及吸附分離得到苯丙氨酸含量約為1.29%的低苯丙氨酸寡肽，可以以此為基料通過營養(yǎng)調(diào)配開發(fā)輔助治療苯丙酮尿癥、吸收率高的低苯丙氨酸寡肽營養(yǎng)功能制品。

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Preparation of low-phenylalanine oligopeptide from Pinctada martensii protein isolates by pancreatin

ZHENG Hui-na，ZHOU Chun-xia，CHEN Zhi-cheng，SU Wei-ming，ZHANG Chao-hua，QIN Xiao-ming
（College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety，Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution，National Research and Development Branch Center for Shellfish Processing（Zhanjiang），Zhanjiang 524088，China）

Phenylketonuria（PKU）was a common amino acid metabolic diseases，low-phenylalanine diet was important for PKU patients.In this study，the pearl industry byproducts-pearl oyster meat was as raw meat，and the low-phenylalanine oligopeptides were preparation by separation of proteins，pancreatin digestion，ultrafiltration grade and activated carbon adsorption separation.The results showed that with the advance of hydrolysis time，the content of＜5 ku oligopeptide first increased and then decreased（p＜0.05），the oligopeptide content reached the highest when hydrolysis 1 h.There was still some residual oligopeptide in the＞5 ku and＜300 u hydrolyzate after ultrafiltration，which＞5 ku components oligopeptide content was 10.43%，＜300 u component 24.52%，while 300 u～5 ku component oligopeptide content reached 68.38%.Phenylalanine component of ＜300 u component was up to 9.52%，activated carbon adsorption of aromatic amino acids were higher than other amino acids，the phenylalanine component of 300 u～5 ku was reached 1.29%after the activated carbon adsorption.This could be used as the base material to prepare of low phenylalanine oligopeptide nutritional function products for phenylketonuria.

pancreatin；Pinctada martensii；low phenylalanine；oligopeptide

TS254.1

A

1002-0306（2016）08-0215-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.036

2015-09-10

鄭惠娜（1979-），女，博士，副教授，主要從事水產(chǎn)貝類高值化利用的研究，E-mail：margaretpaper@126.com。

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金資助（CARS-48-07B）；廣東省高校重大科研項目培育計劃（GDOU2013050245）；廣東省高等學(xué)校優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計劃（Yq2014005）；湛江市科技攻關(guān)項目（2010C3112004）。