賈　淼， 師阿盟， 史海濤， 王　燕， 董　蕾， 郭曉燕

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西省胃腸動力疾病研究重點實驗室，陜西省胃腸疾病臨床研究中心，西安　710004；*通訊作者，E-mail:shihaitao7@163.com)

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柚皮素對人胃癌SGC-7901細胞株增殖和轉(zhuǎn)移能力的影響

賈淼， 師阿盟， 史海濤*， 王燕， 董蕾， 郭曉燕

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西省胃腸動力疾病研究重點實驗室，陜西省胃腸疾病臨床研究中心，西安710004；*通訊作者，E-mail:shihaitao7@163.com)

目的探討柚皮素對人胃癌SGC-7901細胞增殖、黏附、侵襲及遷移能力的影響。 方法選用不同濃度柚皮素(100,200,400 μmol/L)干預(yù)人胃癌細胞株SGC-7901，并設(shè)立對照組(未經(jīng)柚皮素處理)，采用MTT 法檢測細胞增殖及黏附能力；采用Transwell小室檢測細胞侵襲及遷移能力；采用real-time PCR及Western blot檢測基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)mRNA及蛋白表達變化。結(jié)果① 柚皮素干預(yù)胃癌細胞24 h后，增殖能力無明顯變化；而干預(yù)48 h及72 h后，胃癌細胞增殖能力明顯降低(P<0.05)。② 200及400 μmol/L柚皮素可明顯降低胃癌細胞的黏附、侵襲及遷移能力(P<0.05)，而100 μmol/L柚皮素僅能降低胃癌細胞的遷移能力(P<0.05)，但對黏附及侵襲能力無明顯影響。③ 柚皮素可明顯降低胃癌細胞內(nèi)MMP-2及MMP-9的表達(P<0.05)，但對VEGF的表達無明顯影響。結(jié)論柚皮素可抑制胃癌細胞的增殖、黏附、侵襲及遷移能力，這可能與其下調(diào)MMP-2及MMP-9表達有關(guān)。

柚皮素；胃癌；SGC-7901細胞；細胞增殖；細胞轉(zhuǎn)移

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，在所有惡性腫瘤死亡率中排名第二。胃癌的臨床癥狀缺乏特異性，因此發(fā)現(xiàn)時多已進入中晚期。中晚期胃癌的手術(shù)效果欠佳，而化療因其較大的毒副作用導(dǎo)致患者不能耐受，新近研究的生物治療亦因價格昂貴以及效果不明確等原因限制了其廣泛應(yīng)用[1]。隨著中藥現(xiàn)代化、藥理分析技術(shù)及分子生物技術(shù)的發(fā)展，中藥以及各種植物成分在腫瘤治療中的作用逐漸受到重視[2]。柚皮素(naringenin)是存在于植物中的一種黃酮類化合物，研究表明其具有抗炎、抗氧化、降脂及抗癌活性[3-7]。關(guān)于其抗癌作用，有研究報道其可通過增強免疫系統(tǒng)對癌細胞的殺傷作用來發(fā)揮抗癌能力，但又有研究發(fā)現(xiàn)柚皮素可直接發(fā)揮抗癌作用，這在肝癌[7]、胰腺癌[8]、結(jié)腸癌[9]、肺癌[10]、乳腺癌[11]等腫瘤中已有相關(guān)研究，但其對胃癌細胞的作用尚不十分清楚。研究發(fā)現(xiàn)進展期胃癌治療效果欠佳的原因之一便是腫瘤轉(zhuǎn)移，許多患者并非死于原發(fā)灶而是死于轉(zhuǎn)移灶[1]。因此，本實驗旨在探討柚皮素對人胃癌SGC-7901細胞增殖及轉(zhuǎn)移能力的影響，為其臨床應(yīng)用提供理論及實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1細胞株及主要試劑

人胃癌SGC-7901細胞株(購自中科院上海細胞生物研究所)；柚皮素、MTT、DMSO(Sigma，美國)；RPMI1640(Hyclone，美國)；胎牛血清(浙江杭州天航生物科技有限公司)；Transwell小室、96孔板及24孔板(Costar，美國)；基質(zhì)膠(Matrigel)(BD公司，美國)；RNA提取試劑盒Fastgen200(上海飛捷生物技術(shù)有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas，美國)；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Takara生物工程有限公司)；總蛋白提取試劑盒(陜西先鋒生物有限公司，中國)；兔抗人β-actin、MMP-2、MMP-9及VEGF多克隆抗體(Proteintech，美國)；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(Bioworld，美國)。

1.2柚皮素的制備

柚皮素溶解于DMSO中，再用無血清的RPMI 1640稀釋為100,200,400 μmol/L。

1.3細胞培養(yǎng)及分組

人胃癌細胞SGC-7901于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、含5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2-3 d后0.25%胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。實驗分4組：對照組(未經(jīng)柚皮素處理)、實驗組(柚皮素濃度分別為100，200，400 μmol/L)。

1.4細胞增殖實驗

人胃癌細胞SGC-7901胰酶消化后用含10%胎牛血清的RPMI1640調(diào)整細胞密度至3×104/ml，接種于96孔板，每孔200 μl，每組5個復(fù)孔，經(jīng)各組藥物干預(yù)，分別培養(yǎng)24，48，72 h后每孔加入MTT 20 μl，孵育4 h后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加150 μl DMSO置搖床上振蕩10 min，酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光度值(OD)。細胞增殖抑制率(%)=(陰性對照組OD值-柚皮素組OD值)/陰性對照組OD值×100%。

1.5細胞黏附實驗

將基質(zhì)膠Matrigel用不含血清的冷RPMI1640按1∶5稀釋，96孔板中每孔100 μl，室溫干燥過夜。胃癌細胞經(jīng)柚皮素干預(yù)48 h后，接種于含Matrigel的96孔板中，每孔10 000個細胞，每組5個復(fù)孔，以培養(yǎng)液作為空白對照調(diào)零組，置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。3 h后用PBS溶液沖洗，每孔加入MTT 20 μl，培養(yǎng)4 h后吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μl DMSO，置搖床上振蕩10 min。在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光度值(OD)。

1.6細胞侵襲及遷移實驗

將基質(zhì)膠Matrigel用不含血清的冷RPMI1640按1∶5稀釋，取100 μl加到24孔Transwell上室中，室溫干燥過夜以重建基底膜。胃癌細胞經(jīng)柚皮素干預(yù)48 h后進行實驗，用含5%胎牛血清的RPMI1640調(diào)整細胞密度到1×105/ml。24孔板Transwell小室上室加200 μl細胞懸液，下室加600 μl含20%胎牛血清的RPMI1640作為趨化液，每組設(shè)3個小室。37 ℃培養(yǎng)箱孵育24 h后用棉簽擦去濾膜內(nèi)表面未穿過的細胞，外表面采用結(jié)晶紫染色，取5個視野(上、中、下、左、右)照相并計數(shù)，實驗重復(fù)3次。細胞遷移實驗除不鋪Matrigel外，其余步驟同侵襲實驗。1.7real time-PCR檢測MMP-2、MMP-9 及VEGF mRNA表達

柚皮素干預(yù)胃癌細胞48 h后，采用Fastgen試劑盒提取細胞總RNA。cDNA合成按照Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明提取。引物設(shè)計及合成以NCBI Genebank中提供的人類基因序列行MMP-2、MMP-9、VEGF、β-actin的引物設(shè)計，由Takara生物工程(大連)有限公司合成。MMP-2(NM_001302510.1)：上游5′-TTGGTGGGAACTCAGAAGG-3′，下游5′-CTTGCGGTCATCATCGTA-3′；MMP-9(NM_004994.2)：上游5′-TGACAGCGACAAGAAGTG-3′，下游5′-CAGTGAAGCGGTACATAGG-3′；VEGF(NM_001287044.1)：上游5′-CGGCGAAGAGAAGAGACACATTG-3′，下游5′-CGGGAAGGGAAGGGAAGGAC-3′；β-actin(NM_001101.3)：上游5′-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3′，下游5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG -3′。反應(yīng)體系包括模板cDNA 1 μl， 上游引物(10 μmol/L)1 μl，下游引物(10 μmol/L)1 μl，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μl，ddH2O 7 μl，置于熒光定量PCR儀中進行擴增，反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s；60 ℃ 30 s；共40個循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR反應(yīng)液溫度自60 ℃至95 ℃緩慢升溫，實時監(jiān)測SYBR GreenⅠ的熒光信號強度變化，獲取融解曲線，以確認PCR反應(yīng)的特異性。目的基因相對表達水平參考文獻[11]為2-ΔΔCt= 2-(ΔCta-ΔCtb)，ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，a、b分別代表兩組樣本，其中a代表實驗組，b代表對照組，Ct為根據(jù)擴增曲線確定的擴增循環(huán)數(shù)。

1.8Western blot檢測MMP-2、MMP-9及VEGF蛋白表達

藥物干預(yù)48 h后，按照總蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，加上樣緩沖液，在聚丙稀酰胺凝膠中電泳，將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉后分別與抗β-actin、抗MMP-2、抗MMP-9、抗VEGF多克隆抗體孵育，再與相應(yīng)的二抗反應(yīng)，陽性條帶用化學(xué)發(fā)光法檢測。結(jié)果用Gel-pro分析軟件進行分析，計算目的蛋白與相應(yīng)內(nèi)參的光密度比值。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1柚皮素對胃癌細胞增殖能力的影響

采用MTT法檢測細胞增殖能力，活細胞數(shù)目越少，OD值越小。由表1可以看出，與對照組相比，柚皮素干預(yù)胃癌細胞24 h后，SGC-7901細胞增殖無明顯變化；而柚皮素干預(yù)48 h和72 h后，100，200，400 μmol/L柚皮素均可明顯抑制胃癌細胞的增殖(P<0.05)，且隨著濃度的增加及干預(yù)時間的延長，細胞增殖抑制率亦明顯增加，其中400 μmol/L柚皮素干預(yù)胃癌細胞72 h后細胞增殖抑制率達35.3%。

2.2柚皮素對胃癌細胞黏附的影響

采用MTT法檢測黏附于96孔板內(nèi)Matrigel的細胞數(shù)，細胞數(shù)越少，OD值越小。由表2可以看出，與對照組相比，100 μmol/L柚皮素組OD值無明顯變化，而200，400 μmol/L柚皮素組OD值明顯減小，提示黏附于Matrigel的胃癌細胞數(shù)明顯減少(P<0.05)，表明柚皮素可降低胃癌細胞的黏附能力。

表1柚皮素對胃癌SGC-7901細胞增殖能力的影響

Table 1Effect of naringenin on the proliferation capacities of gastric cancer SGC-7901 cells

時間對照組OD值100μmol/L柚皮素組200μmol/L柚皮素組400μmol/L柚皮素組OD值抑制率(%)OD值抑制率(%)OD值抑制率(%)24h0.486±0.0360.479±0.0310.20.457±0.0464.80.428±0.04010.948h0.681±0.0370.606±0.016*11.10.587±0.032*13.90.503±0.051*25.372h0.879±0.0430.749±0.032*14.80.654±0.039*25.60.569±0.051*35.3

與對照組比較，*P<0.05

2.3柚皮素對胃癌細胞侵襲能力的影響

采用Transwell小室檢測細胞侵襲能力，胃癌細胞需水解Matrigel穿過基膜，穿過的細胞數(shù)越多，表明侵襲能力越強。由表2及圖1可以看出，與對照組比較，100 μmol/L柚皮素組細胞數(shù)無明顯變化，而200，400 μmol/L柚皮素組穿膜細胞數(shù)明顯減少 (P<0.05)，表明柚皮素可降低胃癌細胞的侵襲能力。

2.4柚皮素對胃癌細胞遷移能力的影響

采用不鋪Matrigel的Transwell小室檢測細胞遷移能力，穿過的細胞數(shù)越多，表明遷移能力越強。由表2及圖2可以看出，與對照組比較，100，200，400 μmol/L柚皮素組穿膜細胞數(shù)均明顯減少(P<0.05)，表明柚皮素可降低胃癌細胞的遷移能力。

表2柚皮素對胃癌SGC-7901細胞黏附、侵襲及遷移能力的影響

Table 2Effect of naringenin on the adhesive, invasive and migratory capacities of gastric cancer SGC-7901 cells

組別黏附能力(OD值)侵襲能力(穿膜細胞數(shù),個)遷移能力(穿膜細胞數(shù),個)對照組0.539±0.016283.89±27.28332.78±20.55100μmol/L柚皮素0.503±0.031268.33±33.02282.89±42.31*200μmol/L柚皮素0.435±0.033*207.78±30.00*223.22±28.38*400μmol/L柚皮素0.408±0.042*121.22±24.94*145.56±27.30*

與對照組比較，*P<0.05

2.5柚皮素對胃癌細胞MMP-2、MMP-9 及VEGF表達的影響

采用real-time PCR及Western blot檢測柚皮素對胃癌細胞內(nèi)MMP-2、MMP-9 及VEGF mRNA及蛋白表達的影響，由圖3、4可以看出，與對照組相比，100,200,400 μmol/L柚皮素組胃癌細胞內(nèi)MMP-2的表達均明顯下降(P<0.05)，而MMP-9的表達僅在200及400μmol/L組明顯下降(P<0.05)，100 μmol/L柚皮素對MMP-9的表達無明顯影響。不同濃度的柚皮素對VEGF的表達均無明顯影響。

A.對照組　　　　　B.100 μmol/L柚皮素　　　C.200 μmol/L柚皮素　　D.400 μmol/L柚皮素　　　圖1　柚皮素對胃癌SGC-7901細胞侵襲能力的影響(結(jié)晶紫染色，×200)Figure 1　Effect of naringenin on the invasive capacities of gastric cancer SGC-7901 cells (×200)

A.對照組　　　　　B.100 μmol/L柚皮素　　　C.200 μmol/L柚皮素　　D.400 μmol/L柚皮素　　　圖2　柚皮素對胃癌SGC-7901細胞遷移能力的影響 (結(jié)晶紫染色，×200)Figure 2　Effect of naringenin on the migratory capacities of gastric cancer SGC-7901 cells (×200)

圖3　柚皮素對胃癌SGC-7901細胞內(nèi)MMP-2、MMP-9及VEGF蛋白表達的影響Figure 3　Effect of naringenin on protein expression of MMP-2, MMP-9 and VEGF in gastric cancer SGC-7901 cells

圖4　柚皮素對胃癌SGC-7901細胞內(nèi)MMP-2、MMP-9 及VEGF mRNA表達的影響Figure 4　Effect of naringenin on mRNA expression of MMP-2, MMP-9 and VEGF in gastric cancer SGC-7901 cells

3　討論

隨著中藥現(xiàn)代化研究的發(fā)展，人們逐漸認識到中藥在腫瘤治療中的作用及機制。相比于西藥，中藥具有毒性低、價格便宜的優(yōu)勢，中藥及其具體成分抗癌作用的闡明也提示其在腫瘤預(yù)防中的重要性。中藥除了直接的抗癌作用如抑制細胞增殖、促進細胞凋亡、抑制細胞轉(zhuǎn)移等，還可通過調(diào)節(jié)免疫間接發(fā)揮抗腫瘤作用[2]。柚皮素是柚皮甙的甙元，屬于二氫黃酮類化合物，研究發(fā)現(xiàn)其同時具備直接和間接抗癌作用。關(guān)于其抗癌機制，Arul等[7]發(fā)現(xiàn)柚皮素可通過阻斷細胞周期抑制細胞增殖，并誘導(dǎo)凋亡發(fā)揮抗肝癌作用。Lou等[8]發(fā)現(xiàn)柚皮素可通過抑制TGF-β誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及降低MMP-2、MMP-9表達抑制胰腺癌細胞的轉(zhuǎn)移。Li等[9]發(fā)現(xiàn)柚皮素可通過抑制COX-1的表達抑制結(jié)腸癌細胞生長。Jin等[10]發(fā)現(xiàn)柚皮素可通過上調(diào)死亡受體5從而增加TRAIL誘導(dǎo)的肺癌細胞凋亡。Abaza等[11]發(fā)現(xiàn)柚皮素可通過阻斷細胞周期并調(diào)節(jié)Akt及NF-κB信號通路等抑制乳腺癌細胞的增殖。綜上所述，柚皮素具有抗癌作用已經(jīng)被初步證實，但其對胃癌的作用尤其是胃癌轉(zhuǎn)移的影響及機制尚不十分清楚，本研究初步探討了柚皮素對胃癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移能力的影響及可能的分子機制。

腫瘤細胞的增殖與凋亡決定著癌癥的進展，但其轉(zhuǎn)移能力無疑與疾病的預(yù)后密切相關(guān)，無論早期腫瘤還是進展期腫瘤，控制轉(zhuǎn)移都顯得尤為重要。針對腫瘤轉(zhuǎn)移機制及抗轉(zhuǎn)移藥物的研究倍受關(guān)注。腫瘤轉(zhuǎn)移的基本過程包括原發(fā)腫瘤的增殖、腫瘤細胞的黏附、侵襲、遷移、新生血管、轉(zhuǎn)移癌灶的形成。腫瘤細胞不斷增殖導(dǎo)致組織內(nèi)部壓力增高，癌細胞間黏附降低，而與細胞外基質(zhì)間的黏附增加，并在各種水解酶的作用下降解細胞外基質(zhì)，然后向血管或淋巴管侵入，隨即穿出血管到達靶器官可形成微小轉(zhuǎn)移灶，新生血管的生成將使得轉(zhuǎn)移灶不斷增殖，當(dāng)增殖到一定大小又開始向別處轉(zhuǎn)移[12]。由此可見，腫瘤細胞的增殖、黏附、侵襲、遷移及血管生成能力在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中具有重要的作用，也是許多抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物作用的靶點。本實驗在體外采用基質(zhì)膠Matrigel模擬細胞外基質(zhì)，并結(jié)合Transwell小室模擬胃癌細胞的黏附、侵襲及遷移過程，結(jié)果提示柚皮素可明顯抑制胃癌轉(zhuǎn)移過程中的增殖、黏附、侵襲及遷移能力，表明柚皮素可能具有抗胃癌轉(zhuǎn)移的作用，但其機制如何，尚需進一步研究。既往的研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，基質(zhì)金屬酶(MMPs)起著至關(guān)重要的作用。MMPs是鋅離子依賴的內(nèi)分泌蛋白酶，主要參與細胞間黏附調(diào)節(jié)、細胞外基質(zhì)的降解和新血管的形成[13]。目前發(fā)現(xiàn)MMPs家族成員達20多種，其中MMP-2和MMP-9主要降解Ⅳ型膠原蛋白，在多種腫瘤組織包括胃癌中高表達，對腫瘤細胞的黏附、侵襲和遷移過程發(fā)揮著重要的作用[14,15]。VEGF是一種血管生成因子，可以通過促進腫瘤血管生成和重建為腫瘤的生長提供營養(yǎng)，同時可以使血管通透性增加，為腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移提供有利的條件[16]。因此，本實驗為明確柚皮素抑制胃癌細胞轉(zhuǎn)移的機制，進一步研究了其對胃癌細胞內(nèi)MMP-2、MMP-9及VEGF的影響，結(jié)果提示柚皮素可明顯抑制胃癌細胞內(nèi)MMP-2及MMP-9的表達，但對VEGF的表達無明顯影響，提示柚皮素可能通過抑制MMP-2及MMP-9抑制胃癌細胞的黏附、侵襲及遷移，但卻對血管生成中最重要的因子VEGF表達無明顯影響，因此，柚皮素是否可影響胃癌的血管生成尚需進一步更深入的研究。

綜上所述，本研究從胃癌轉(zhuǎn)移的過程入手，探討了柚皮素對胃癌細胞轉(zhuǎn)移能力的影響及機制，結(jié)果表明柚皮素在體外可明顯抑制胃癌細胞的增殖、黏附、侵襲及遷移能力，并可降低胃癌細胞內(nèi)MMP-2及MMP-9的表達，但對VEGF的表達無明顯影響。本研究結(jié)果進一步揭示了柚皮素的抗癌作用，尤其是其對胃癌細胞轉(zhuǎn)移能力的抑制作用，從而為胃癌的綜合治療提供了新的方向。

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Effect of naringenin on the proliferative and metastatic capacities of human gastric cancer SGC-7901 cells

JIA Miao, SHI Ameng, SHI Haitao*, WANG Yan, DONG Lei, GUO Xiaoyan

(DepartmentofGastroenterology,SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,ShaanxiKeyLaboratoryofGastrointestinalMotilityDisorders,ShaanxiClinicalResearchCenterofGastrointestinalDisease,Xi’an710004,China;*Correspondingauthor,E-mail:shihaitao7@163.com)

ObjectiveTo investigate the effect of naringenin on the proliferative, adhesive, invasive and migratory capacities of human gastric cancer SGC-7901 cells.MethodsSGC-7901 cells were treated with different concentrations of naringenin(0,100,200,400 μmol/L). Then the cell proliferative and adhesive capacities were measured by MTT assay, and the cell invasive and migratory capacities were determined by Transwell assay. The mRNA and protein expression levels of metalloproteinase-2(MMP-2), MMP-9 and vascular endothelial growth factor(VEGF) in gastric cancer cells were detected by real-time PCR and Western blot.Results①Naringenin had no effect on cell proliferation after 24 h treatment. However, the proliferative capacity of SGC-7901 cells was inhibited significantly when treated with naringenin for 48 h and 72 h(P<0.05). ②The 200 and 400 μmol/L naringenin significantly inhibited adhesive, invasive and migratory capacities of SGC-7901 cells(P<0.05). The 100 μmol/L naringenin only inhibited cell migratory capacity(P<0.05), but had no effect on adhesive and invasive capacities. ③Naringenin effectively down-regulated the mRNA and protein expression of MMP-2 and MMP-9(P<0.05), but had no effect on VEGF expression.ConclusionThese findings suggest that naringenin could inhibit the proliferative, adhesive, invasive and migratory capacities of SGC-7901 cellsinvitro, which may be related to the inhibition of the expression of MMP-2 and MMP-9.

naringenin;gastric cancer;SGC-7901 cell;cell proliferation;cell metastasis

國家星火計劃資助項目(2011GAB50001)

賈淼，女，1979-05生，本科，住院醫(yī)師，E-mail：xiaomao7954@sohu.com

2015-12-21

R735.2

A

1007-6611(2016)03-0218-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.03.006