張海燕姜海嬌祝 迪李建華呂慶杰

（1遼寧省計劃生育科學研究院，2沈陽化工研究院有限公司，3中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科，4中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院病理科，沈陽 110004）

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惡性腹腔積液中卵巢癌腫瘤細胞標志物的免疫細胞化學分析

張海燕1姜海嬌2祝 迪3李建華3呂慶杰4*

（1遼寧省計劃生育科學研究院，2沈陽化工研究院有限公司，3中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科，4中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院病理科，沈陽 110004）

目的 探討在惡性腹腔積液中卵巢癌細胞的多種標志物表達情況及分子生物學意義。方法 選取惡性腹腔積液中卵巢癌患者102例，采用免疫細胞化學方法檢測細胞角蛋白7（Cell Keratin 7，CK7）、卵巢癌相關(guān)抗原（Ovarian Cancer Antigen，CA-125）、癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen，CEA）、鈣網(wǎng)膜蛋白（Calretinin，CR）、C-erbB-2、雌激素受體（estrogen receptor，ER）及孕激素受體（progesteron receptor，PR）表達。結(jié)果 102例發(fā)生惡性腹腔積液的卵巢癌患者中，98例經(jīng)過標準化療1～2個療程，手術(shù)組織病理證實為上皮性卵巢癌，26例發(fā)生大網(wǎng)膜或腹膜轉(zhuǎn)移，其中卵巢癌相關(guān)標記物CK7陽性表達率為95.1%，CA-125的陽性表達率為88.2%，CEA的陽性表達率為7.8%；CR的陽性表達率為25.5%，但在發(fā)生轉(zhuǎn)移的卵巢癌細胞中全部表達；與預(yù)后相關(guān)的C-erbB-2的陽性表達率為30.4%，ER和PR的陽性表達率分別為50.9%和42.1%。結(jié)論 根據(jù)各標志物蛋白表達情況，不僅可以診斷卵巢癌細胞并且也可以初步評估其轉(zhuǎn)移情況和惡性程度，并對臨床治療和預(yù)后判斷提供參考依據(jù)。

惡性腹腔積液；卵巢癌；CK7；CA-125

卵巢癌是最常見的婦科腫瘤之一，也是引起婦科腫瘤死亡的主要原因，上皮性卵巢癌約占卵巢惡性腫瘤的85%，腹水是上皮性卵巢癌常見體征，也是晚期的表現(xiàn)之一［1］。腹水常常是由于盆腔及腹腔轉(zhuǎn)移，組織學分級差，淋巴轉(zhuǎn)移等因素有關(guān)，腹水中常伴有癌細胞的脫落［2-3］，因此當對腹水進行脫落細胞的病理檢測時，就需要對其中的腫瘤細胞進行診斷及鑒別診斷，并對轉(zhuǎn)移特征、惡性程度與預(yù)后等臨床特征進行初步判斷。

細胞角蛋白7（cell keratin 7，CK7）在卵巢和肺等上皮呈陽性表達，而在胃腸道上皮陰性，可作為鑒別診斷指標［4］，與卵巢癌相關(guān)抗原（ovarian cancer antigen，CA-125）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）聯(lián)合可共同診斷卵巢癌細胞［5］。鈣網(wǎng)膜蛋白（calretinin，CR）是診斷間皮瘤的有用的標志［6］，通過檢測其在卵巢癌細胞中的表達可來了解卵巢癌的轉(zhuǎn)移特征。在上皮性卵巢癌中C-erbB-2過表達比例越高，則臨床分期越晚，且其生物學行為和預(yù)后就越差。雌激素受體（estrogen receptor，ER）和孕激素受體（progesteron receptor，PR）的檢測有助于指導臨床治療［7］。本研究對卵巢癌惡性腹腔積液中CK7、CA-125、CEA、calretinin，CR、C-erbB-2等腫瘤細胞相關(guān)標志物及有助于了解其惡性程度和預(yù)后的ER和PR進行免疫細胞化學檢測，從而為卵巢癌的診斷、轉(zhuǎn)移、預(yù)后的判斷及其治療的指導提供參考依據(jù)。

材料和方法

1 臨床樣本

收集2011到2014年中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科、附屬盛京醫(yī)院病房及門診的惡性腹腔積液共1387例，引起腹水的病變包括炎癥，結(jié)核，胃腸道腫瘤轉(zhuǎn)移，間皮瘤等，取其未接受過治療的102例卵巢癌患者惡性腹腔積液作為研究對象，其中98例后經(jīng)過標準化療1～2個療程，經(jīng)臨床檢查及術(shù)后組織病理和免疫化學染色診斷為上皮性卵巢癌，其中26例發(fā)生大網(wǎng)膜或腹膜轉(zhuǎn)移。102例中，年齡從21至78歲，平均年齡為55歲。

2 液基細胞薄層檢測技術(shù)（ThinPrep Cytology Test，TCT）

收集新鮮腹水25ml左右，室溫下2000r/min離心5min，棄去上清液，加入清洗液再次離心后，棄去上清液，取底層沉淀細胞與保存液混合后，機器Thinprep5000自動制片，并進行染色和鏡下診斷。

3 切片制備與HE染色

TCT常規(guī)制片，診斷后，每份標本收集新鮮腹水200ml左右，室溫下，2000r/min離心5min，取細胞沉渣，經(jīng)95%乙醇固定12h后梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，切片，HE染色后，鏡下觀察，篩選切片。

4 免疫細胞化學染色與結(jié)果判定

切片常規(guī)脫蠟、脫水、高溫高壓法抗原修復后進行免疫細胞化學EnVision法染色（具體染色步驟按照試劑說明書進行），用PBS液代替一抗作為陰性對照。

結(jié)果判定：免疫反應(yīng)陽性細胞必須具備細胞結(jié)構(gòu)清晰，陽性顆粒定位好，著色明顯高于背景的特點，顯微鏡下表現(xiàn)為胞膜、胞漿或胞核的棕褐色或褐色顆粒著色。

結(jié) 果

惡性腹腔積液經(jīng)TCT及HE鏡下初步診斷為可疑瘤細胞（圖1A，1B），并進行卵巢癌組織的HE及CA-125的免疫組織化學染色進一步驗證（圖2A，2B）。

表1　惡性腹腔積液中卵巢癌細胞的CK7、CA-125、CEA、CR、C-erbB-2、ER及PR的表達率Table 1 The positive expression rate of CK7、CA-125、CEA、CR、C-erbB-2、ER and PR from the malignant ascites of ovarian cancer patients

圖1　卵巢癌患者惡性腹腔積液中細胞的組織學和免疫細胞化學染色。A，惡性腹腔積液TCT涂片中卵巢癌細胞巴氏染色；B：，同例惡性腹腔積液的石蠟包埋切片HE染色中的卵巢癌細胞；C，同例惡性腹腔積液中卵巢癌細胞的CK7免疫反應(yīng)陽性表達；比例尺，50μmFig.1 The histological and immunocytochemical staining of the cells from malignant ascites fluids of ovarian cancer patient.A，HE staining of TCT sample cells from malignant ascites fluids of ovarian cancer；B，HE staining of ovarian cancer cells from malignant ascites fluids of the same case；C，The positive expression of CK7 immunocytochemical staining in the cells from malignant ascites fluids of the same patient case；scale bar，50μm

免疫細胞化學染色顯示，卵巢癌相關(guān)標志物CK7表達陽性（圖1C），CA-125陽性部位為細胞膜（圖3A），表達率分別為95.1%和88.2%（表1）；癌胚抗原（CEA）陽性表達部位為細胞質(zhì)（圖3C），其表達率相對較低，為7.8%（表1），所以對惡性腹腔積液中的卵巢癌細胞進行診斷時，需要三者聯(lián)合進行檢測，以提高診斷的準確性。發(fā)生腹腔轉(zhuǎn)移的卵巢癌細胞，其間皮細胞特異性標記物（CR）全部陽性表達，陽性部位為細胞質(zhì)（圖3B），我們認為卵巢癌細胞在轉(zhuǎn)移和浸潤的過程中發(fā)生了分子生物學的改變，使其更有利于自身的存活。卵巢癌預(yù)后參考指標C-erbB-2、ER及PR也呈陽性表達，陽性部位定位于細胞質(zhì)、細胞核及細胞核（圖4），其表達率分別為30.4%、50.9%、42.1%（表1），C-erbB-2的表達說明發(fā)生腹腔轉(zhuǎn)移的卵巢癌細胞具備一定的惡性程度。

圖2　卵巢癌組織的HE染色（A）及CA-125的免疫組織化學染色（B）。比例尺，50μmFig.2 HE staining（A）and immunohistochemical staining of CA-125（B）in ovarian cancer tissue.Scale bar，50μm

圖3　同例惡性腹腔積液中卵巢癌細胞的 CA-125（A）、CR（B）、CEA（C）膜漿的陽性表達。比例尺，50μmFig.3 The positive expression of CA125（A），CR（B），CEA（C）from the cells in the malignant ascites fluids of the same patient case.Scale bar，50μm

圖4　同例惡性腹腔積液中卵巢癌細胞的C-erbB-2（A）、ER（B）及PR（C）陽性染色。比例尺，50μmFig.4 The expression of C-erbB-2（A）、ER（B）and PR（C）from the cells in malignant ascites fluids of the same patient case.Scale bar，50μm

討 論

卵巢癌患者易出現(xiàn)惡性腹腔積液，通過對惡性腹腔積液中腫瘤細胞的免疫化學分析，可有助于對腫瘤進行診治和療效觀察。本研究對惡性腹腔積液中卵巢癌細胞進行免疫細胞化學的檢測，發(fā)現(xiàn)其上皮性標志物CK7表達率高達95.1%，有研究表明，與轉(zhuǎn)移性卵巢癌相比，CK7在原發(fā)性卵巢癌中具有更高的表達率［8］。卵巢癌的腫瘤標記物CA-125表達率也高達88.2%，CA-125是1983年由Bast等從上皮性卵巢癌抗原檢測出可被單克隆抗體OC125結(jié)合的一種糖蛋白，來源于胚胎發(fā)育期體腔上皮，在正常卵巢組織中不表達，其診斷的敏感性較高，晚期卵巢癌患者的血清CA-125異常升高率達80%［9］。CK7與CA-125的聯(lián)合檢測，對于惡性腹腔積液中，原發(fā)性卵巢癌的鑒別診斷具有重要參考價值，CEA是一種非特異性腫瘤標志物，廣泛存在于消化系統(tǒng)腫瘤患者的體內(nèi)，CEA在卵巢癌中可以表達，但它不是卵巢癌的特異性腫瘤標志物，在婦科惡性腫瘤的治療中也具有一定的參考價值，但因為陽性率低，最好結(jié)合其它指標來共同判斷腫瘤性質(zhì)［10］，在本研究中也證實CEA陽性率表達在卵巢癌細胞中較低，需要結(jié)合CK7與CA-125來一起判斷腫瘤細胞的性質(zhì)。

在本研究中，26例卵巢癌患者發(fā)生了腹腔轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移癌細胞種植于大網(wǎng)膜或腹膜等處，其間質(zhì)細胞標記物CR全部表達，我們推測腫瘤細胞在新的病灶處生長的過程中與周圍的間質(zhì)細胞發(fā)生了生物分子學特征上的融合，從而更有利于其在新的環(huán)境中生長。此外，腫瘤細胞在侵襲轉(zhuǎn)移的過程中，可能具備了間質(zhì)細胞的某些特性，從而更有利于自身的轉(zhuǎn)移，具體原因還需我們進一步研究。但我們可以利用這一分子標記的表達，來評估卵巢癌細胞的轉(zhuǎn)移情況，進而為治療提供參考。

C-erbB-2為一種原癌基因，在多種人類腫瘤，特別是上皮性腫瘤，存在基因擴增和蛋白的表達異常。有研究表明，在卵巢癌的組織中，從在C-erbB-2基因的過度表達，從而是細胞異常增值，促進腫瘤發(fā)生發(fā)展，且其表達率在低分化癌中高于高分化癌，可見其與惡性程度相關(guān)［11-12］。本研究中C-erbB-2的表達率也有30.4%，這說明腹水中的腫瘤細胞也具備高度惡性的特征，預(yù)示著不良預(yù)后。ER和PR也具有一定比例的表達，在免疫組織化學的研究中發(fā)現(xiàn)，不同的卵巢癌組織學類型，ER和PR的表達具有一定的差異性，但發(fā)現(xiàn)PR的表達是預(yù)后較好的一個重要指標，同時ER和PR的表達是激素依賴性腫瘤對內(nèi)分泌治療敏感性好的依據(jù)［13］。

卵巢癌惡性腹腔積液中的脫落細胞學檢查方法簡單、快速、患者痛苦小，是一項必不可少的重要檢查手段。癌細胞的檢測對鑒別良、惡性、分期、治療和預(yù)后等均有關(guān)，但腹水中癌細胞的檢出率也可能受一些因素的影響，如臨床期別、組織學類型、腹腔轉(zhuǎn)移、腫瘤有無破潰、癌腫是否外生型等有關(guān)［14］，卵巢癌腹水的液基細胞學與免疫細胞化學技術(shù)相結(jié)合在疑難腹水鑒別診斷中可以起到關(guān)鍵作用，在我們的研究中，發(fā)現(xiàn)有部分病例的惡性腹腔積液中的卵巢癌細胞可以同時表達多種因子，這說明腫瘤細胞在轉(zhuǎn)移過程中發(fā)生了多樣性的變化，多種抗體的聯(lián)合應(yīng)用可有助于鑒別診斷腺癌細胞的惡性程度，轉(zhuǎn)移情況及為治療與預(yù)后提供參考價值。

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Immunocytochemical analysis of markers for
tumor cells from malignant ascites of ovarian cancer

Zhang Haiyan1，Jiang Haijiao2，Zhu Di3，Li Jianhua3，Lv Qingjie4*
（1Liaoning Research lnstitute of Family Planning，2Shenyang Research Institute Of Chemical Industry，3Department of Pathology，the First Affiliated Hospital of China Medical University，4Department of Pathology，Shengjing Hospital of China Medical University，Shenyang 110004，China）

Objective To investigate the expression and biological significance of ovarian cancer cell markers from malignant ascites.Methods In 102 cases of malignant ascites of ovarian cancer，the expressions of CK7，CA-125，CEA，CR，C-erbB-2，ER and PR were detected by immunohistochemical staining.Results After 1-2 cycles of standard chemotherapy，surgical pathology confirmed epithelial ovarian cancer in 98 of the 102 cases，26 with omental or peritoneal metastasis.positive rates of CK7，CA-125，CEA，CR，C-erbB-2，ER，and PR were vespectively 95.1%，88.2%，7.8%，25.5%，30.4%，50.9%and 42.1%.Conclusion The protein expression of the markers can give a preliminary assessment of the degree of malignancy and metastasis of tumor cells，thus providing references for clinical treatment and prognosis.

malignant ascites；ovarian cancer；CK7；CA-125

R361+.3

A

10.16705/j.cnki.1004-1850.2015.06.

2015-12-13 〔修回日期〕2016-03-26

張海燕，女（1974年），漢族，副主任醫(yī)師

（To whom correspondence should be addressed）：lvqjie@163.com