鄭 偉胡志堅(jiān)張春梁林建忠林少敏

（福建醫(yī)科大學(xué)1病理學(xué)系，2公共衛(wèi)生學(xué)院，3藥學(xué)院，福州 350004）

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基底膜染色方法比較及在胃粘膜異型增生與胃腺癌中的應(yīng)用

鄭 偉1*胡志堅(jiān)2張春梁1林建忠3林少敏1

（福建醫(yī)科大學(xué)1病理學(xué)系，2公共衛(wèi)生學(xué)院，3藥學(xué)院，福州 350004）

目的 探討胃粘膜上皮基底膜有效、便捷、直觀的實(shí)驗(yàn)方法，及基底膜、Ki67免疫組織化學(xué)、粘液多重染色在胃腺癌組織染色中的可行性。方法 用過(guò)碘酸希夫（periodic acid Schiff，PAS）反應(yīng)、六胺銀法（methenamine silver method，PASM）、網(wǎng)狀纖維染色、苦味酸-天狼猩紅（Picrosirius red，SR）和IV型膠原免疫組織化學(xué)5種染色方法對(duì)多種胃粘膜異型增生及胃腺癌病理標(biāo)本基底膜進(jìn)行染色，并利用Friedman檢驗(yàn)、Wilcoxon檢驗(yàn)定量分析、比較基底膜陽(yáng)性區(qū)域面積。此外，在同一張胃腺癌組織切片上進(jìn)行顯示基底膜、蛋白質(zhì)、粘液的多重染色。結(jié)果 5種基底膜染色方法中，IV型膠原免疫反應(yīng)陽(yáng)性面積與SR染色陽(yáng)性面積（胃粘膜中-重度異型增生標(biāo)本除外）無(wú)顯著性差異、PAS與PASM染色陽(yáng)性面積無(wú)顯著性差異、網(wǎng)狀纖維染色陽(yáng)性面積最大。多重染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示胃腺癌Ki-67、阿爾新藍(lán)（Alcian blue，AB）-PAS二重染色和Ki-67、AB、SR三重染色，分別顯示對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)，效果良好。結(jié)論 觀察基底膜，胃粘膜中-重度異型增生標(biāo)本中IV型膠原免疫組織化學(xué)與SR染色要分別選用；胃粘膜輕度異型增生及胃腺癌標(biāo)本中IV型與SR染色可相互替代；PAS與PASM染色法可相互替代，我們推薦較為便捷的SR和PAS染色；網(wǎng)狀纖維染色觀察比較直觀，可選用。此外，SR、PAS也可分別應(yīng)用于胃腺癌Ki67免疫組織化學(xué)與AB的多重染色中，效果良好。

異型增生；胃腺癌；基底膜；定量分析；多重染色

在胃粘膜異型增生、胃腺癌的臨床檢驗(yàn)與研究中，基底膜形態(tài)的改變及表達(dá)程度、細(xì)胞增殖指數(shù)（ki-67）、p53蛋白的檢出率、粘液的性質(zhì)等常是關(guān)注點(diǎn)［1-3］。特殊染色和免疫組織化學(xué)法在病理輔助診斷中有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。實(shí)踐中，基底膜可以用多種染色方法顯示，包括過(guò)碘酸希夫（periodic acid Schiff，PAS）反應(yīng)、六胺銀法（methenamine silver method，PASM）、網(wǎng)狀纖維染色、苦味酸-天狼猩紅（Picrosirius red，SR）法和IV型膠原免疫組織化學(xué)法。有的特殊染色一種方法可以顯示多種目的物。本文結(jié)合定量分析對(duì)胃粘膜異型增生—癌演進(jìn)中基底膜的不同染色方法進(jìn)行了比較，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)中通過(guò)多重染色把基底膜與上述關(guān)注點(diǎn)聚焦在同一張切片上，使其形態(tài)學(xué)間相互比較更加直觀，從而為胃粘膜異型增生—癌演進(jìn)中的病理輔助診斷與實(shí)驗(yàn)研究提供有效、便捷、直觀的方法。

材料和方法

1 臨床資料

收集福建醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系及附屬第一醫(yī)院病理科2011年1月～2014年3月的胃粘膜活檢組織40例，臨床病例資料完整的、經(jīng)手術(shù)切除的胃腺癌30例，其中異型增生輕度20例，中-重度20例，中分化腺癌15例，低分化腺癌15例。女27例，男43例，年齡36～82歲。病理診斷經(jīng)2位以上經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師閱HE染色切片證實(shí)。

2 主要試劑和方法

PAS、PASM、網(wǎng)狀纖維染色液和SR液，由福建醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系配制［4-6］。鼠抗人單克隆抗體Ⅳ型膠原（克隆號(hào)：PHM-12）、鼠抗人單克隆抗體Ki-67（克隆號(hào)：SP6）、ElivisionTMplus試劑盒（鼠/兔）（Kit-9902）和DAB Kit（20×）購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

2.1 基底膜特殊染色

每例石蠟組織均取4μm連續(xù)切片5張，4張分別做PAS、PASM、網(wǎng)狀纖維和SR染色［4］，一張備用（做IV型膠原免疫組織化學(xué)檢測(cè)），正常胃組織作對(duì)照。

2.2 IV型膠原免疫組織化學(xué)染色

抗IV型膠原（Collagen IV）抗體為即用型抗體，按ElivisionTMplus/HRP免疫組織化學(xué)操作步驟進(jìn)行。

2.3 不同染色陽(yáng)性區(qū)域面積測(cè)量

PAS、PASM、網(wǎng)狀纖維染色、IV型膠原免疫組織化學(xué)染色切片分別置于20倍普通光學(xué)顯微鏡下、SR染色切片置于20倍數(shù)的偏光顯微鏡下觀察，對(duì)每例切片所測(cè)相同區(qū)域進(jìn)行定位后，提取圖像，輸入“Image Plus”彩色圖像分析系統(tǒng)，準(zhǔn)確分割陽(yáng)性區(qū)域，尺寸定標(biāo)后，測(cè)量該區(qū)域的面積。

2.4 免疫組織化學(xué)、基底膜、粘液、膠原多重染色

在同一張胃粘膜異型增生或胃腺癌4μm切片上進(jìn)行多重染色：第1重染色按ElivisionTMplus試劑盒對(duì)Ki-67（核陽(yáng)性）進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，DAB顯色后，自來(lái)水沖洗10min，蒸餾水洗。第2重染色，行AB-PAS顯示酸性粘液、中性粘液和基底膜［4］，切片水洗后經(jīng)蒸餾水洗。第3重染色，如果第2重染色只染AB，則這一步可用SR顯示膠原纖維和肌組織。切片脫水、透明、中性樹(shù)脂封固。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用中位數(shù)和四分位數(shù)間距進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述（資料不服從正態(tài)分布），應(yīng)用Friedman檢驗(yàn)各組間的差異，并用Wilcoxon進(jìn)行兩兩比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α= 0.05，所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

結(jié) 果

1 異型增生胃粘膜基底膜陽(yáng)性區(qū)域面積5種染色方法比較

對(duì)異型增生胃粘膜中基底膜陽(yáng)性區(qū)域面積中位數(shù)測(cè)量（表1）顯示，網(wǎng)狀纖維染色法最大，PAS、PASM法偏小。對(duì)5種染色方法進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果胃粘膜輕度異型增生組的SR與IV型膠原免疫組織化學(xué)染色之間、PAS與PASM之間無(wú)顯著性差異；胃粘膜中-重度異型增生組中，PAS與PASM染色之間無(wú)顯著性差異；其余各組兩兩比較均有顯著性差異。

表1　異型增生胃粘膜基底膜陽(yáng)性區(qū)域面積百分位數(shù)值5種染色方法比較（單位：μm2）Table 1 Comparisons between percentile values of gastric dysplasia basement membrane positive area generated by 5 staining methods（unit：μm2）

2 胃腺癌基底膜陽(yáng)性區(qū)域面積5種染色方法比較

測(cè)量胃腺癌基底膜陽(yáng)性區(qū)域面積中位數(shù)（表2）顯示，網(wǎng)狀纖維染色法最大，PAS、PASM法偏小。5種染色方法兩兩比較，胃中分化腺癌組與胃低分化腺癌組，SR與IV型、PAS與PASM，均無(wú)顯著性差異；其余各組兩兩比較均有顯著性差異。

表2　胃腺癌基底膜陽(yáng)性區(qū)域面積百分位數(shù)值5種染色方法比較（單位：μm2）Table 2 Comparisons between percentile values of gastric adenocarcinoma basement membrane positive area generated by 5 staining methods（unit：μm2）

3 胃組織基底膜、網(wǎng)狀纖維、Ⅳ型膠原纖維等成分5種不同染色方法比較

圖1　不同染色方法顯示胃組織基底膜、網(wǎng)狀纖維、Ⅳ型膠原纖維等成分。A，PAS染色，中性粘液、基底膜呈紅紫色（箭頭），細(xì)胞核藍(lán)色；B，PASM染色，中性粘液、基底膜呈黑色（箭頭），細(xì)胞核藍(lán)色；C，網(wǎng)纖染色，網(wǎng)狀纖維、基底膜呈黑色（箭頭）；D，SR染色（偏光顯微鏡下），Ⅳ型膠原纖維呈淺黃色（箭頭）；E，Ⅳ型膠原纖維免疫組化染色，Ⅳ型膠原纖維呈棕黃色（箭頭），細(xì)胞核藍(lán)色；比例尺，100μmFig.1 Different staining methods showed that the basement membrane，reticular fiber，type IV collagen fiber in gastric tissue. A，PAS staining，the neutral mucus of gastric mucosa and the basement membrane showed red and purple（arrow），the nucleus showed blue；B，PASM staining，the neutral mucus of gastric mucosa and the basement membrane showed black（arrow），the nucleus showed blue；C，reticular fiber staining，the reticular fiber and the basement membrane showed black（arrow）；D，SR staining（by polarizing microscope），TypeⅣcollagen fiber showed light yellow（arrow）；E，Type IV collagen immunohistochemical staining，TypeⅣcollagen fiber showed brown yellow（arrow），the nucleus showed blue；Scale bar，100μm

胃粘膜上皮基底膜完整、呈線型，中-重度異型增生的部分基底膜可呈片段型，形成細(xì)小分支伸向固有層；胃腺癌的基底膜可出現(xiàn)厚薄不一、不連續(xù)、中斷或者消失等不規(guī)則現(xiàn)象。PAS染色顯示，胃粘膜中性粘液、基底膜呈紅紫色，細(xì)胞核藍(lán)色（圖1A）；PASM染色顯示，胃粘膜中性粘液、基底膜呈黑色，細(xì)胞核藍(lán)色（圖1B）。以上兩種染色基底膜、中性粘液同時(shí)呈色，要注意區(qū)別。網(wǎng)狀纖維染色顯示，網(wǎng)狀纖維、基底膜呈黑色（圖1C）。SR染色（偏光顯微鏡下）顯示，胃組織中I型膠原纖維呈亮紅色，Ⅲ型膠原纖維呈綠色，Ⅳ型膠原纖維呈淺黃色（圖1D）。SR染色在偏光顯微鏡下，可以區(qū)分各型膠原纖維。Ⅳ型膠原纖維免疫組織化學(xué)染色顯示，胃組織中Ⅳ型膠原纖維呈棕黃色，細(xì)胞核藍(lán)色（圖1E）。

4 胃腺癌組織Ki-67、AB-PAS二重染色和Ki-67、 AB、SR三重染色效果比較

Ki-67、AB-PAS染色可見(jiàn)Ki-67陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞核顯棕褐色（DAB顯色），胃粘膜中性粘液、基底膜呈紅色、酸性粘液呈藍(lán)色（圖2A）。Ki-67、AB、SR三重染色可見(jiàn)Ki-67陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞核顯棕褐色，胃粘膜酸性粘液呈綠色，膠原纖維呈紅色（在偏光顯微鏡下，可觀察Ⅳ型膠原纖維），肌纖維呈黃色（圖2B）。以上兩組多重染色，各成分染色表達(dá)清晰，互不干擾且色彩有反差。

圖2　胃腺癌組織免疫組織化學(xué)、粘液、膠原多重染色。A，Ki-67免疫組織化學(xué)與AB-PAS雙重染色，Ki-67陽(yáng)性核顯棕褐色（☆），中性粘液呈紅色（※），酸性粘液呈藍(lán)色（△）；B，Ki-67免疫組織化學(xué)、AB與SR三重染色，Ki-67陽(yáng)性核顯棕褐色（☆），酸性粘液呈綠色（△），膠原纖維呈紅色（◇），肌纖維呈黃色（箭頭）；比例尺，100μmFig.2 Multiple staining of proteins，mucus and fiber in gastric adenocarcinoma.A，double stains of Ki-67-immunohistochemistry and AB-PAS，Ki-67 positive nucleus stained brown（☆），the neutral mucus of gastric mucosa stained red（※），and the acid mucus stained blue（△）；B，triple stains of Ki-67-immunohistochemistry，AB and SR，Ki-67 positive nucleus stained brown（☆），the acid mucus of gastric mucosa stained green（△），collagen fibers stained red（◇），and muscle fibers stained yellow（arrow）；scale bar，100μm

討 論

在胃上皮異型增生-癌演進(jìn)中，HE染色切片上很難甚至不可能觀察出瘤細(xì)胞“突破基底膜”現(xiàn)象。胃上皮異型增生是否直接導(dǎo)致形態(tài)學(xué)意義上的浸潤(rùn)癌，也少有文獻(xiàn)報(bào)道［7］。便捷、直觀地顯示基底膜形態(tài)的改變，以及不同性質(zhì)的粘液和某些蛋白標(biāo)志物的表達(dá)，為上述演進(jìn)過(guò)程中的輔助診斷與實(shí)驗(yàn)研究，提供有效的方法?；啄な歉叨扔行虻奶鼗募?xì)胞外基質(zhì)，呈致密的、薄層狀結(jié)構(gòu)，厚度約40～120nm不等。基底膜位于上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的基底部，將細(xì)胞與結(jié)締組織隔離，是腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的自然屏障。基底膜的成分包括Ⅳ型膠原、層粘連蛋白、內(nèi)聯(lián)蛋白等，它們對(duì)維持基底膜結(jié)構(gòu)的完整性起著重要作用［8］。

5種染色方法對(duì)基底膜陽(yáng)性區(qū)域面積進(jìn)行的定量分析中，經(jīng)Friedman檢驗(yàn)各組間的差異，并兩兩方法比較（Wilcoxon檢驗(yàn)），結(jié)果IV型膠原免疫反應(yīng)陽(yáng)性面積與SR染色陽(yáng)性面積（4組中有3組，胃粘膜中-重度異型增生標(biāo)本除外）、PAS與PASM染色陽(yáng)性面積（4組）無(wú)差異。中位數(shù)值，各組中網(wǎng)狀纖維染色陽(yáng)性面積最大。

Ⅳ型膠原是構(gòu)成基底膜的主要成分之一［8］，分布于腺體周圍、血管壁等部位，在腺體周圍形成完整均勻連續(xù)的線狀結(jié)構(gòu)。經(jīng)SR染色后，在偏光顯微鏡下觀察，各型膠原顯出不同色彩，清楚可辨，Ⅳ型膠原纖維，呈淺黃色。相比而言，免疫組織化學(xué)檢測(cè)Ⅳ型膠原所用抗體、試劑盒等較貴，操作費(fèi)時(shí)；而SR試劑直接染色，操作簡(jiǎn)便。這兩種方法有3組二者結(jié)果無(wú)差異，可選擇使用試劑少、步驟簡(jiǎn)捷、費(fèi)用經(jīng)濟(jì)的SR染色法。SR法在配制苦味酸-天狼猩紅液時(shí)，苦味酸一定要過(guò)飽和，否則著色不良。本實(shí)驗(yàn)胃粘膜中-重度異型增生組，Ⅳ與SR方法有顯著差異，提示高級(jí)別異型增生組實(shí)驗(yàn)，SR與Ⅳ型膠原纖維免疫組化法要同時(shí)選用。

PAS與PASM染色，可以著染粘蛋白，粘蛋白是由多糖與蛋白質(zhì)結(jié)合的復(fù)合物，在基底膜中存在粘蛋白成分。這兩種方法，同時(shí)也使胃腺體中的中性粘多糖著色。本實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)PAS與PASM法，染色陽(yáng)性面積結(jié)果無(wú)差異。PASM法需在六胺銀中加溫染色，因是進(jìn)行性銀浸染，經(jīng)常要取出用蒸餾水洗后在顯微鏡下觀察染色效果，以免著色不夠或過(guò)染。有報(bào)道PASM用于腎小球基底膜的染色，但染色質(zhì)量不易控制［9］。相比較PAS法Schiff試劑在室溫下染色，如果過(guò)染，亞硫酸沖洗液對(duì)避免假陽(yáng)性出現(xiàn)有一定的作用，該技術(shù)較好控制、相對(duì)簡(jiǎn)便。PAS法在配制Schiff試劑時(shí)，偏重亞硫酸鈉的質(zhì)量一定要純，堿性品紅有不同的廠牌和批號(hào)，純度較高的可以少加活性炭，配制中所用的玻璃器皿要求十分干凈［5］。

網(wǎng)狀纖維主要成分是膠原蛋白，它的原纖維上包有一層特殊糖蛋白，據(jù)稱這是導(dǎo)致它有嗜銀性的原因［4］。在胃粘膜上皮，網(wǎng)狀纖維單獨(dú)存在，沒(méi)有網(wǎng)狀細(xì)胞伴隨，胃腺體上皮的基底膜物質(zhì)，可被網(wǎng)狀纖維法銀染。該染色技術(shù)是銀氨液浸染法，本實(shí)驗(yàn)采用酸化高錳酸鉀增強(qiáng)氧化，暴露更多的醛基，使網(wǎng)狀纖維的染色加強(qiáng)，背景更為清晰；使用的氫氧化銀氨液是銀氨液中最易被還原，容易和目的物結(jié)合的一種（網(wǎng)狀纖維染色陽(yáng)性面積最大）。配好后的銀氨液很敏感，宜用棕色玻璃瓶盛裝密塞后置4℃的冰箱保存。

在胃腺癌標(biāo)本中，本系還實(shí)驗(yàn)了同一張切片上進(jìn)行基底膜、蛋白標(biāo)志物、粘液等多重染色，使各種成分形態(tài)學(xué)間相互關(guān)系更加直觀。以上推薦的SR與PAS染色，在Ki-67免疫組織化學(xué)（核陽(yáng)性表達(dá)、DAB顯色）與AB-PAS雙重染色和Ki-67免疫組織化學(xué)、AB和SR三重染色中，均達(dá)到較好的效果。多重染色的基本原則是，陽(yáng)性染色表達(dá)互不干擾且色彩有反差，利于顯微鏡下的觀察。免疫組織化學(xué)和特殊染色組合中，要先進(jìn)行免疫組織化學(xué)顯色，然后行特殊染色，經(jīng)驗(yàn)是染色步驟多的、時(shí)間作用久的先進(jìn)行。同時(shí)，也要考慮到染料的分子大?。ㄒ苑肿恿孔鲄⒖迹肿有〉南热旧?。主要原因是，分子大的染料與組織著染后，一般會(huì)比較緊密，不容易被取代，具體在本實(shí)驗(yàn)中，SR中天狼猩紅（大分子染料）染色宜在最后進(jìn)行。另外，與免疫組織化學(xué)核陽(yáng)性的抗體組合，效果比較好，因?yàn)榛啄?、粘多糖、膠原等成分的特殊染色多定位在細(xì)胞質(zhì)、間質(zhì)，這樣組合對(duì)結(jié)果判定的干擾比較小。

綜上所述，在胃粘膜異型增生、胃腺癌的輔助診斷與實(shí)驗(yàn)研究中，胃粘膜中-重度異型增生組，Ⅳ型膠原免疫組化與SR染色要分別選用。其他各組，如果顯示基底膜中的Ⅳ型纖維，可選便捷的SR直接染色（偏光顯微鏡下觀察）；PAS方法在顯示基底膜中的粘蛋白時(shí)比較實(shí)用；網(wǎng)狀纖維可染色基底膜物質(zhì)，因含量多，顯微鏡下觀察較為直觀。因此觀察基底膜推薦SR、PAS與網(wǎng)狀纖維染色，為首選方法。另外，多重染色的應(yīng)用，蛋白質(zhì)、基底膜、粘液、膠原纖維聚焦在同一張切片上，形態(tài)學(xué)間相互關(guān)系一目了然，有利于直觀判斷與比較。

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Comparison between different staining methods of basement membrane and their application in gastric epithelial dysplasia and gastric adenocarcinoma

Zheng Wei1*，Hu Zhijian2，Zhang Chunliang1，Lin Jianzhong3，Lin Shaomin1
（1Department of pathology，2College of public health，3College of pharmacy，F(xiàn)ujian medical university，F(xiàn)uzhou 350004，China）

Objective To explore effective，convenient and intuitive experimental methods for the study of gastric epithelial basement membrane，and investigate the feasibility of multiple staining-basement membrane，Ki67 immunohistochemistry and mucus -for gastric adenocarcinoma.Methods We stained the basement membrane of gastric epithelial dysplasia and gastric adenocarcinoma specimens with 5 methods:PAS，PASM，Reticular fiber staining，SR，and IV collagen immunohistochemistry.Friedman and Wilcoxon tests were used for quantitative analysis and comparison of the positive area of basement membrane.Besides，we conducted multiple staining for basement membrane，protein and mucus on the same slice of gastric adenocarcinoma.Results Among the 5 staining methods，IV and SR（except for the group of moderate to severe dysplasia in gastric mucosa），PAS and PASM showed no difference.The reticular fiber staining showed the highest content of basement membrane.The double staining of Ki67 and AB-PAS and the triple staining of Ki-67，AB and SR in gastric adenocarcinoma showed good results in reflecting respective structures.Conclusion For the observation of basement membrane in gastric mucosa specimens of moderate to severe dysplasia，IV collagen immunohistochemistry and SR staining should be chosen.For the other groups，either IV or SR，and either PAS or PASM can be used，but SR and PAS are more effective and convenient.The reticular fiber staining is more intuitive，which is also recommended.Besides，in multiple staining experiments of gastric adenocarcinoma，SR and PAS can be used with Ki67 immunohistochemistry and AB respectively，with good results.

dysplasia；gastric adenocarcinoma；basement membrane；quantitative analysis；multiple staining

R329 R322.44

A

10.16705/j.cnki.1004-1850.

2015-08-15 〔修回日期〕2016-03-24

鄭偉，男（1968年），漢族，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師

（To whom correspondence should be addressed）：zhengw2005@126.com