丁春曉張 洋張 恒王 健喬菊久李建華*

（（1遼寧省中醫(yī)藥研究院病理科，沈陽 110034；2沈陽市第四人民醫(yī)院病理科，沈陽 110031；3中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，沈陽 110013）

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聯(lián)合抗體免疫組織化學(xué)檢測胸水細(xì)胞對惡性間皮瘤診斷的應(yīng)用價(jià)值分析

丁春曉1張 洋2張 恒3王 健3喬菊久1李建華3*

（（1遼寧省中醫(yī)藥研究院病理科，沈陽 110034；2沈陽市第四人民醫(yī)院病理科，沈陽 110031；3中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，沈陽 110013）

目的 探討在胸水沉渣包埋切片中，應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)診斷惡性間皮瘤時(shí)，聯(lián)合抗體套餐的最佳選擇。方法對523例胸水標(biāo)本進(jìn)行液基學(xué)檢測，并對其中診斷結(jié)果為惡性間皮瘤的63例及肺腺癌的52例胸水標(biāo)本進(jìn)行離心沉渣后包埋、切片，采用免疫組織化學(xué)方法檢測細(xì)胞角蛋白5/6（CK5/6）、細(xì)胞角蛋白7（CK7）、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1（TTF-1）、波形蛋白（Vim）、P53、間皮細(xì)胞（MC）抗體、鈣視網(wǎng)膜蛋白（CR）、表皮生長因子受體（EGFR）、E-鈣粘蛋白（E-cad）、癌胚抗原（CEA）的表達(dá)，比較這些抗體的陽性表達(dá)率，特異性及敏感性，探討診斷惡性間皮瘤聯(lián)合抗體的最佳套餐選擇，同時(shí)對臨床較常見的粘液型及乳頭狀型惡性間皮瘤組化結(jié)果進(jìn)行比較，分析惡性間皮瘤的形態(tài)學(xué)分型對免疫組化結(jié)果有否影響。結(jié)果 在63例惡性間皮瘤患者中，CK5/6、MC、CR、EGFR、Vim的陽性表達(dá)率較高，在52例肺腺癌患者中，TTF-1和CEA的陽性率表達(dá)率最高；CK5/6、MC、CR、EGFR、Vim TTF-1、CEA特異性和（或）敏感性較高。結(jié)論 診斷惡性間皮瘤的最佳聯(lián)合抗體套餐選擇為CK5/6、MC、CR、EGFR、Vim、TTF-1、CEA；粘液型及乳頭狀型惡性間皮瘤抗體陽性表達(dá)率無明顯區(qū)別。

胸水；沉渣包埋；惡性間皮瘤；液基細(xì)胞學(xué)

惡性間皮瘤是一種少見的中胚層來源的惡性腫瘤，具有高度侵襲性，好發(fā)于胸膜，發(fā)生于胸膜者約占惡性間皮瘤的80%［1］，約占腫瘤的5%，近年來其發(fā)病率有逐年增加的趨勢，在美國和加拿大的發(fā)病率為2/100萬人～20/100萬人。美國最常見的引起彌漫性惡性間皮瘤的原因是暴露于石棉之下并且吸入石棉，通常來講，從暴露在石棉之下直至發(fā)生惡性間皮瘤需要幾十年時(shí)間的潛伏期。由于臨床癥狀不典型，給惡性間皮瘤的臨床和病理診斷帶來諸多困難。近年來，由于對間皮瘤的認(rèn)識水平的提高和電鏡、免疫組織化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用使胸膜惡性間皮瘤的診斷水平有了很大提高。然而在諸多抗體中，如何選擇特異性及敏感性高的抗體，從而對惡性間皮瘤做出早期、準(zhǔn)確的診斷，顯得尤為重要，本實(shí)驗(yàn)選擇的10項(xiàng)抗體中，既往研究表明，細(xì)胞角蛋白5/6（cytokeratin 5/6，CK5/6）主要表達(dá)于上皮組織，臨床上主要用于鱗癌及腺癌的鑒別［2］，間皮細(xì)胞（mesothelial cell，MC）抗體、鈣視網(wǎng)膜蛋白（Calretinin，CR）均主要表達(dá)于間皮細(xì)胞及其發(fā)生的腫瘤［3］，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、E -鈣粘蛋白（E-cadherin，E-cad）則表達(dá)于多種上皮，其過度表達(dá)，主要與腫瘤的發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)［4、5］，波形蛋白（Vimentin，Vim）表達(dá)于大多數(shù)的間葉源性細(xì)胞及其發(fā)生的腫瘤，P53作為抑癌基因，則被作為判斷預(yù)后及復(fù)發(fā)［6］，而甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1（thyroid transcription factor 1，TTF-1）和癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）作為常用的肺腺癌及胃腸道惡性腫瘤等疾病的診斷抗體［7、8］，選擇其作為惡性間皮瘤診斷的陰性對照抗體。依據(jù)以上，本實(shí)驗(yàn)通過對63例惡性胸膜間皮瘤患者和52例肺腺癌患者的胸水沉渣包埋切片進(jìn)行免疫組化染色，對比陽性結(jié)果，探討惡性間皮瘤診斷的最佳抗體套餐的選擇，以達(dá)到減少患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及以最少、最準(zhǔn)的抗體選擇確診惡性間皮瘤的目的。

材料和方法

1 病例

收集中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科2014年1月—2016年1月胸水標(biāo)本523例，其中女性187例，年齡53～79歲，中位年齡62歲；男性336例，年齡52～89歲，中位年齡73歲。對胸水診斷結(jié)果為可疑陽性及異性增生細(xì)胞進(jìn)行離心沉渣包埋，HE及免疫組織化學(xué)染色，通過病理診斷得到63例惡性間皮瘤胸水沉渣標(biāo)本，其中男性52例，中位年齡70歲；女性11例，中位年齡67歲；肺腺癌52例，男性32例，女性20例。

2 試劑

鼠抗人CK5/6、MC、CR、EGFR、Vim、CK7、P53、E-cad、TTF-1、CEA抗體均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司銷售的美國Biox公司產(chǎn)品。免疫組織化學(xué)S-P試劑盒和DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

3 液基細(xì)胞薄層檢測技術(shù)（Thinprep Cytologic Test，TCT）

收集新鮮胸水20ml左右，室溫下800r/min離心5min，棄去上清，取沉淀底層細(xì)胞，加入清洗液后再次離心，取沉淀與保存液混合后機(jī)器自動制片，手動中性樹膠封片。

4 胸水沉渣包埋

采用液基細(xì)胞薄層方法（TCT）常規(guī)制片、診斷后，每份對應(yīng)標(biāo)本收集新鮮胸水200ml左右，經(jīng)95%乙醇固定24h后石蠟包埋、切片。

5 免疫組織化學(xué)

采用鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶（streptavidinperoxidase，S-P）法CK5/6、MC、CR、EGFR、Vim、CK7、P53、E-cad、TTF-1、CEA進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色（一抗稀釋度均為1：100），PBS緩沖液代替第一抗體作為空白對照，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片。

6 結(jié)果判定［9］

CK5/6、CEA、Vim細(xì)胞質(zhì)著色為陽性，MC、E-cad細(xì)胞膜著色為陽性，CR細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核著色為陽性，TTF-1細(xì)胞核著色為陽性，陽性程度判斷：細(xì)胞無著色或著色細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)＜10%為（-）；陽性著色細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)10%～25%為（+），26%～50%為（++），≥51%為（+++）；陽性表達(dá)即+～+++。每張切片選取5個(gè)高倍視野（400×），對免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行判讀。

7 敏感度與特異度計(jì)算［10］

以免疫組織化學(xué)結(jié)果病理診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，將間皮細(xì)胞相關(guān)抗原（Vim、MC CR等）在肺腺癌中的陰性表達(dá)定義為真陰性，陽性表達(dá)定義為假陽性；在惡性胸膜間皮瘤中的陽性表達(dá)定義為真陽性，陰性表達(dá)定義為假陰性。將上皮細(xì)胞相關(guān)抗體（TTF-1 CEA）在惡性間皮瘤中的陰性表達(dá)定義為真陰性，陽性表達(dá)定義為假陽性；在肺腺癌中的陽性表達(dá)定義為真陽性，陰性表達(dá)定義為假陰性。依據(jù)敏感性=真陽性/（真陽性+假陰性）×100%，特異性=真陰性/（真陰性+假陽性）×100%進(jìn)行計(jì)算。

8 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 10種抗原在粘液型及乳頭狀型惡性間皮瘤中的表達(dá)

63例惡性間皮瘤患者中，依據(jù)病理鏡下細(xì)胞排列形態(tài)等特點(diǎn)，區(qū)分出粘液型26例，乳頭狀型37例，經(jīng)10種抗體免疫組織化學(xué)染色證實(shí)（圖1），各抗體的陽性表達(dá)率在兩型之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表1）。

圖1　粘液型及乳頭狀型惡性間皮瘤細(xì)胞病理學(xué)與免疫組織化學(xué)特征。A，惡性間皮瘤胸水TCT（巴氏染色）；B，乳頭型惡性間皮瘤胸水沉渣包埋（HE染色）；C，粘液型惡性間皮瘤胸水沉渣包埋（HE染色）；D，CK5/6在乳頭型惡性間皮瘤中的陽性表達(dá)（S-P法）；E，MC在粘液型惡性間皮瘤中的陽性表達(dá)（S-P法）；F，CR在粘液型惡性間皮瘤中的陽性表達(dá)（SP法）；G，EGFR在乳頭型惡性間皮瘤中的陽性表達(dá)（SP法）；H，Vim在乳頭型惡性間皮瘤中的陽性表達(dá)（SP法）；I，E-cad在乳頭型惡性間皮瘤中的陽性表達(dá)（SP法）；比例尺，100μmFig.1 Cellular pathological and immunohistochemical features of papillary and mucous malignant mesothelioma.A，malignant mesothelioma pleural effusion TCT（Pap stain）；B，pleural effusion sediment embedding of the papillary type of malignant mesothelioma（HE stain）；C，pleural effusion sediment embedding of the mucous type of malignant mesothelioma（HE stain）；D，positive expression of CK5/6 in papillary malignant mesothelioma（S-P method）；E，positive expression of MC in mucous malignant mesothelioma（S-P method）；F，positive expression of CR in mucous malignant mesothelioma（S-P method）；G，positive expression of EGFR in papillary malignant mesothelioma（S-P method）；H，positive expression of Vim in papillary malignant mesothelioma（S-P method）；I，positive expression of E-cad in papillary malignant mesothelioma（S-P method）；scale bar，100μm

表1　10種抗原在粘液型和乳頭狀型惡性間皮瘤中表達(dá)比較Table 1 Comparison of expressions of 10 kinds of antigens in mucinous and papillary malignant mesothelioma

2 10種抗體在惡性間皮瘤診斷中的應(yīng)用價(jià)值分析

在胸水細(xì)胞標(biāo)本中，最常見病變?yōu)檗D(zhuǎn)移性肺腺癌，因此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測在惡性間皮瘤及轉(zhuǎn)移性肺腺癌臨床診斷中常用的10種抗體，用以對比抗體的陽性表達(dá)率、特異性及敏感性。由表2可以看出，橫向?qū)Ρ龋诙咧g，該10種抗原陽性表達(dá)率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的是CK5/6、MC、CR、EGFR、 Vim、TTF-1及CEA；縱向?qū)Ρ龋?0種抗原在惡性間皮瘤之間的陽性表達(dá)率比較，最高的是CK5/6、MC、CR、EGFR及Vim，均大于85%，而特異性和（或）敏感性較高的，亦是CK5/6、MC、CR、EGFR、Vim、TTF-1及CEA，均大于85%。綜合以上各結(jié)果可知，診斷惡性間皮瘤的最佳抗體套餐選擇是CK5/6、MC、CR、EGFR、Vim、TTF-1及CEA。

表　2 10種抗原在惡性間皮瘤和肺腺癌中表達(dá)比較Table 2 Comparison of expression of 10 kinds of antigens in malignant mesothelioma and lung adenocarcinoma

討 論

惡性胸膜間皮瘤作為臨床上最常見的惡性間皮瘤，分型主要分為局限型和彌漫型［11］，而病理組織學(xué)則根據(jù)鏡下細(xì)胞形態(tài)及組織結(jié)構(gòu)分為乳頭狀型、粘液性型、未分化型、印戒樣細(xì)胞型、小細(xì)胞型等多種形態(tài)分型。本實(shí)驗(yàn)收集了臨床常見的兩個(gè)形態(tài)學(xué)分型，即乳頭狀型及粘液型，對比兩型各抗體的陽性率，發(fā)現(xiàn)并無明顯區(qū)別，說明形態(tài)學(xué)分型對惡性間皮瘤臨床診斷特異性上并無差異，既不存在某型惡性間皮瘤臨床上易于早期或較易做出診斷的說法。由于惡性間皮瘤的非特異性的癥狀及體征，大多數(shù)患者得到最初的診斷都是在疾病的晚期［12］，因此迫切需要相關(guān)診斷技術(shù)及手段的更新提高，以增強(qiáng)早期對疾病做出明確診斷的能力，通過胸水即細(xì)胞學(xué)診斷是臨床常用的診斷方法，減少活檢率，進(jìn)而降低腫瘤種植的風(fēng)險(xiǎn)。然而，即便是有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)生做出的細(xì)胞學(xué)診斷，相比較于組織活檢，也往往被認(rèn)為是輔助診斷方法，在這種情況下，加做免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫組織化學(xué)染色，對于惡性間皮瘤的診斷，在大多數(shù)情況下是足夠的［13］。因此，抗體的選擇就顯得尤為重要。依據(jù)國外文獻(xiàn)報(bào)道，診斷惡性間皮瘤的免疫組織化學(xué)抗體應(yīng)該包括的陽性（間皮）和陰性（癌相關(guān)）抗體和至少一個(gè)細(xì)胞角蛋白（CK）抗體，至少兩個(gè)間皮標(biāo)記和至少兩個(gè)癌相關(guān)標(biāo)記［14］。

CK5/6陽性表達(dá)于復(fù)層上皮、乳腺及前列腺的肌上皮；鱗癌、上皮樣惡性間皮瘤、肺的淋巴上皮瘤樣癌，而在腺上皮及其來源的腫瘤、非上皮組織中不表達(dá)，臨床上主要用于上皮型間皮瘤與肺腺癌、肺鱗癌與肺腺癌等的鑒別診斷。張繼賢等［15］用免疫組化檢測27例胸膜惡性間皮瘤CK5/6的陽性表達(dá)率為77.8%（25/27）。邢榮格等［16］觀察了56例惡性間皮瘤CK5/6的陽性表達(dá)率為100%（56/56）。本研究CK5/6的陽性表達(dá)率為96.83（61/63），特異性敏感性分別為76.92%、96.83%。

MC主要存在于間皮細(xì)胞表面，近幾年廣泛應(yīng)用于惡性間皮瘤的診斷，臨床上常與Calretinin聯(lián)合應(yīng)用。研究表明，MC可與CK19等抗體聯(lián)合應(yīng)用，提高甲狀腺乳頭狀癌的診斷［17］。陳學(xué)敬等［18］用免疫組織化學(xué)檢測8例惡性間皮瘤患者M(jìn)C的陽性表達(dá)率為82.5%（7/8），本研究發(fā)現(xiàn)MC的陽性表達(dá)率為100%（63/63），特異 性敏 感性 分別 高達(dá) 為90.38%、100%。

Calretinin（CR），主要用于間皮細(xì)胞及其發(fā)生的腫瘤的診斷及鑒別診斷。常與MC聯(lián)合應(yīng)用。邢榮格等［16］檢測56例惡性間皮瘤患者，發(fā)現(xiàn)CR的陽性表達(dá)率為95.3%（53/56），本研究發(fā)現(xiàn)CR的陽性表達(dá)率為100%（56/56），特異性敏感性分別高達(dá)為94.23%、100%。

EGFR是一種跨膜蛋白，表達(dá)于多種正常組織，尤其是復(fù)層上皮和鱗狀上皮，大量研究發(fā)現(xiàn)，EGFR的過度表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其在上皮性腫瘤的發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮著重要作用［4］。Foster等［19］檢測 29例惡性間皮瘤患者，發(fā)現(xiàn)EGFR的陽性表達(dá)率為97%（28/29），本研究發(fā)現(xiàn)EGFR的陽性表達(dá)率為95.24%（60/63），特異性敏感性分別為59.62%和95.24%。

Vimentin是一種中間絲蛋白，絕大多數(shù)間葉源性細(xì)胞及其發(fā)生的腫瘤均可表達(dá)Vim，在惡性間皮瘤中，Vim可表達(dá)，尤其是肉瘤樣間皮瘤及分化差的雙相間皮瘤。陳學(xué)敏等［18］用免疫組織化學(xué)檢測8例惡性間皮瘤患者Vim的陽性表達(dá)率為100%（8/ 8），邢榮格等［16］檢測56例惡性間皮瘤患者，發(fā)現(xiàn)Vim的陽性表達(dá)率為80%（45/56），本研究發(fā)現(xiàn)Vim的陽性表達(dá)率為88.89%（56/63）。

CK7是一種中間絲蛋白，本研究中的陽性表達(dá)率為55.56%（35/63）。P53為抑癌基因，研究發(fā)現(xiàn)，P53可以抑制人肺腺癌細(xì)胞株的生長，促進(jìn)其凋亡，此外，P53還對判斷肺癌病人的預(yù)后及復(fù)發(fā)有非常重要的意義［6］。在腫瘤組織中檢測到的均為突變型P53，而在正常組織中不表達(dá)，其過表達(dá)預(yù)示著預(yù)后不良。本研究發(fā)現(xiàn)P53的陽性表達(dá)率為55.56%（35/63）。E-cad是跨膜糖蛋白，其功能的降低或喪失可導(dǎo)致細(xì)胞連接破壞，促進(jìn)腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移。在對肺腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，E-cad的過度表達(dá)與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)［20］，本研究發(fā)現(xiàn)E-cad的陽性表達(dá)率為44.45%（28/63）。以上3種抗體對惡性間皮瘤的診斷的陽性表達(dá)率不高，特異性敏感性亦明顯低于CK5/6.MC.CR.EGFR等抗體，臨床上作為首選抗體診斷意義不大。

TTF-1主要表達(dá)于胎兒肺組織、成年人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞、甲狀腺濾泡細(xì)胞。其在原發(fā)肺腺癌及轉(zhuǎn)移性肺腺癌的診斷中具有十分重要的作用，現(xiàn)臨床上常用其作為肺腺癌的特異性標(biāo)記物，有研究顯示其診斷的特異度可達(dá)到100%［7］。本研究顯示，TTF-1在惡性間皮瘤中幾乎不表達(dá)，而在肺腺癌中陽性表達(dá)率為92.31%（48/52），特異性敏感性均較高，可作為診斷惡性間皮瘤的陰性對照的首選抗體之一。CEA即癌胚抗原，陽性表達(dá)于胎兒腸道、胃腸道腺癌、肺腺癌、甲狀腺髓樣癌，主要應(yīng)用于上皮源性轉(zhuǎn)移性腫瘤的鑒別診斷。在惡性間皮瘤中幾乎不表達(dá)，而在肺腺癌中陽性表達(dá)率為94.23%（49/52），特異性敏感性均較高，亦可作為診斷惡性間皮瘤的陰性對照的首選抗體之一。

終上所述，依據(jù)各抗體的陽性表達(dá)率、特異性及敏感性，CK5/6、MC、CR、EGFR、Vim、TTF-1、CEA可作為診斷惡性間皮瘤最佳首選套餐選擇，這些抗體的陽性率在惡性間皮瘤的形態(tài)學(xué)分型間（粘液型和乳頭狀型）無明顯差別，可不做影響因素考慮，對于胸水沉渣包埋切片HE診斷懷疑惡性的病例，采用該幾種免疫組化抗體染色診斷，不僅可以準(zhǔn)確診斷惡性間皮瘤，亦可以減少因選擇其它陽性率低的抗體進(jìn)行診斷給患者帶來的多余經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此，該免疫組化套餐的選擇對惡性間皮瘤的早期及準(zhǔn)確診斷有重要的臨床意義。

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Value analysis for application of combined antibodies immunohistochemical detection of pleural effusion cells to diagnose malignant mesothelioma

Ding Chunxiao1，Zhang Yang2，Zhang Heng3，Wang Jian3，Qiao Jujiu1，Li Jianhua3*
（1Department of Pathology，Liaoning Province Chinese Medicine Research Institute，Shenyang 110034；2Department of Pathology，the Fourth People’s Hospital of Shenyang，Shenyang 110031；3Department of Pathology，China Medical University，Shenyang 110013，China）

Objective To Explore the best choice of antibody package in combined immunohistochemical examination of sediment embedded sections of pleural effusion for the diagnosis of malignant mesothelioma.Methods 523 cases of pleural effusion were detected by liquid based cytology，and then pleural effusion specimens of 63 cases of malignant mesothelioma and 52 cases of adenocarcinoma were embedded and sliced after centrifugation sediment.The expression of CK5/6，CK7，TTF-1，Vim，P53，MC，CR，EGFR，E-cad and CEA were detected by immunohistochemistry.We compared the positive expression rate，specificity and sensitivity of these antibodies to explore the best choice for the diagnosis of malignant mesothelioma；at the same time，the results were compared with the clinical results of mucinous type and papillary type malignant mesothelioma，to observe whether the morphological differentiation of malignant mesothelioma influenced the outcome of immunohistochemistry.Results In 63 cases of malignant mesothelioma，the positive expression rates of CK5/6，MC，CR，EGFR，and Vim were higher among the 10 antibodies，while in 52 cases of lung adenocarcinoma TTF-1 and CEA positive rates of expression were the highest；CK5/6，MC，CR，EGFR，Vim，TTF-1，and CEA showed better specificity and（or）sensitivity.Conclusion The best combination of antibodies for the diagnosis of malignant mesothelioma are CK5/6，MC，CR，EGFR，Vim，TTF-1，and CEA.There was no significant difference in the expression rate between mucinous type and papillary type.

Pleural effusion；sediment embedding；malignant mesothelioma；liquid based cytology

R730.26

A

10.16705/j.cnki.1004-1850.

2016-02-16 〔修回日期〕2016-04-23

丁春曉，女（1981年），漢族，主治醫(yī)師

（To whom correspondence should be addressed）：LIJH@mail.cmu.edu.cn