瞿葉輝，岑小燕，丁利君,*，黃金，成曉玲（.廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東廣州50006；.廣東工業(yè)大學(xué)材料與能源學(xué)院，廣東廣州50006）

鯪魚加工下腳料的酶解工藝優(yōu)化

瞿葉輝1，岑小燕1，丁利君1,*，黃金2，成曉玲1
（1.廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東廣州510006；2.廣東工業(yè)大學(xué)材料與能源學(xué)院，廣東廣州510006）

以鯪魚糜等加工的下腳料魚頭、魚骨、魚尾等為原料，選用中性蛋白酶對其進(jìn)行水解，通過響應(yīng)面分析優(yōu)化酶解條件。以水解度、多肽含量為指標(biāo)，分別對酶濃度、溫度、pH值、料液比、酶解時(shí)間等因素對水解效果的影響進(jìn)行分析。結(jié)果表明：中性蛋白酶水解鯪魚加工下腳料的最佳條件為：酶濃度5.1 mg/g，料液比1∶5（g/mL）、自然pH、溫度55.16℃、酶解5.22h，在此條件下得到的水解度為13.01%，多肽含量為1.07mg/mL。

鯪魚下腳料；響應(yīng)面；多肽含量；水解度

鯪魚（Cirrhinus molitorella）主要產(chǎn)地在中國，在水溫較高如珠三角、海南等地區(qū)較為常見，養(yǎng)殖成本低、產(chǎn)量大［1］。在營養(yǎng)價(jià)值方面，鯪魚含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素A、鈣、鎂、硒等，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值［2］。魚類下腳料中含有豐富的蛋白質(zhì)、礦質(zhì)元素等，將魚類下腳料深加工，有利于提高魚類資源利用率，提高經(jīng)濟(jì)效益［3］。而目前魚品下腳料可以通過精加工制成可溶性食用魚類蛋白粉、魚皮膠、魚骨糊、魚蛋白鈣糖等，這些產(chǎn)品可以作為氨基酸強(qiáng)化劑，也可以開發(fā)特殊風(fēng)味的魚味調(diào)味劑［4］，或制成具有生物活性如抗氧化性、降血壓的多肽［5］。目前處理魚下腳料用的較多的是生物酶解法，將魚蛋白降解成小分子多肽及氨基酸，有利于人體的吸收利用［6-7］。鄧敏［8］等利用響應(yīng)面對酶解羅非魚制取多肽進(jìn)行了很好的優(yōu)化，錢清華等［9］利用響應(yīng)面優(yōu)化了酶解帶魚蛋白的工藝。本研究為了提高鯪魚加工下腳料的利用率，用中性蛋白酶對其進(jìn)行水解，通過響應(yīng)面優(yōu)化酶解條件，為后續(xù)鯪魚下腳料的研究提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

鯪魚下腳料（頭、骨、尾）：購于廣州市番禺區(qū)清河綜合市場；中性蛋白酶（5×104U/g）：南京奧多福尼生物科技有限公司；還原型谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品：sigma公司；濃硫酸，硼酸，鹽酸，磷酸二氫鈉，甲醛，氫氧化鈉，三氯乙酸，磷酸氫二鈉，中性紅，百里酚酞，乙酸鎂，無水乙醚等：均為分析純。

UV-1200型分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2鯪魚下腳料基本成分分析

粗蛋白含量的測定：凱氏定氮法（GB 5009.5-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》）；脂肪含量的測定：索氏抽提法（GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的測定》）；水分含量的測定：150℃恒重法（GB 5009.3-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定》）；灰分含量的測定：550℃灼燒法（GB 5009.4-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測定》）。

1.3水解度及多肽含量的測定

1.3.1水解度的測定

水解度的測定采用甲醛滴定法［10］。

式中：V1為空白消耗氫氧化鈉溶液的體積，mL；V2為滴定樣品消耗的氫氧化鈉溶液的體積，mL；C氫氧化鈉溶液的濃度，mol/L；M所取水解液的體積，mL。

1.3.2多肽含量的測定

參考魯偉［11］等人的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定多肽含量。由標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程：Y=0.115X+0.002286，R2=0.995。

1.4鯪魚下腳料的酶解工藝

鯪魚下腳料→清洗→高壓蒸煮→粉碎→生物酶解解→滅酶→離心→上清液

1.5酶解條件的確定

選取酶濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度、pH、料液比5個(gè)單因素，以水解度、多肽含量為考察指標(biāo)，確定對酶解效果較顯著的因素及水平。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken-Design響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，以水解度及多肽含量為響應(yīng)值［12］。

2　結(jié)果與分析

2.1鯪魚下腳料基本成分分析

鯪魚下腳料成分分析如表1所示。

由表1可知，新鮮鯪魚加工下腳料含有大量水分，達(dá)67.55%，蛋白質(zhì)的含量高達(dá)19.19%，說明鯪魚下腳料是一種不可忽視的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源，可應(yīng)用于多肽產(chǎn)品的開發(fā)及利用。

表1 鯪魚下腳料成分分析Table 1　Proximate analysis of Cirrhinus molitorella waste

2.2酶解鯪魚下腳料的單因素試驗(yàn)

2.2.1酶濃度對酶解效果的影響

稱取樣品2 g，100℃滅酶后冷卻，分別配制0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL 8個(gè)梯度的酶溶液，在pH 7.0、溫度50℃、料液比1∶5（g/mL）的條件下酶解2 h，以水解度（DH）及多肽含量（PC）為指標(biāo)，探討不同酶濃度對酶解效果的影響。酶濃度對酶解效果的影響如圖1所示。圖1表明，當(dāng)酶濃度從0到0.2 mg/mL時(shí)，水解度與多肽濃度上升速度非?？?，當(dāng)酶濃度升高時(shí)，水解度呈現(xiàn)出一個(gè)先升后降的趨勢，在濃度在1.0 mg/mL時(shí)，水解度達(dá)到最大。因此確定本反應(yīng)中最適酶濃度為1.0 mg/mL。

2.2.2酶解時(shí)間對酶解效果的影響

稱取樣品2 g，100℃滅酶后冷卻，在酶濃度1 mg/ mL、pH 7.0、溫度50℃、料液比1∶5（g/mL）的條件下，分別酶解0、1、2、3、4、6、8、10 h，分析不同酶解時(shí)間對酶解效果的影響。酶解時(shí)間對酶解效果的影響如圖2所示。由圖2可知，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，隨著酶解時(shí)間的增加，水解度和多肽含量均有所上升，當(dāng)超過4 h后，水解度呈現(xiàn)一個(gè)下降的趨勢，而多肽含量在6 h時(shí)達(dá)到最大值并維持在一個(gè)穩(wěn)定的數(shù)值上。

2.2.3酶解溫度對酶解效果的影響

稱取樣品2 g，100℃滅酶后冷卻，以酶濃度1 mg/ mL、pH 7.0、料液比1∶5（g/mL）為固定條件，分別在室溫（22℃）、30、35、40、45、50、55、60℃的條件下酶解2 h，分析不同酶解溫度對酶解效果的影響。酶解溫度對酶解效果的影響如圖3所示。圖3可以看出，隨著溫度的升高，水解度與多肽含量產(chǎn)生一個(gè)先升后降的趨勢，當(dāng)溫度為55℃時(shí)，水解度達(dá)到最大，而多肽含量在溫度為50℃達(dá)到最大。

2.2.4pH對酶解效果的影響

稱取樣品2g，100℃滅酶后冷卻，以酶濃度1mg/mL、溫度50℃、料液比1∶5（g/mL）為固定條件，分別在pH值為自然（7.3）、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的條件下酶解2 h，研究不同pH環(huán)境對酶解效果的影響。pH值對酶解效果的影響如圖4所示。由圖4可以看出，隨著初始pH值的增加，水解度和多肽含量都是先增大后減小，在pH值等于7.0時(shí)達(dá)到最大。當(dāng)溶液初始pH值超過7.0后，水解度與多肽含量都有所下降，因此中性蛋白酶的最適pH值在7.0左右。

2.2.5料液比對酶解效果的影響

稱取樣品2 g，100℃滅酶后冷卻，以酶濃度1 mg/ mL、溫度50℃、pH 7.0為固定條件，分別在料液比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7、1∶10（g/mL）的條件下酶解2 h，探討不同料液比對酶解效果的影響。料液比對酶解效果的影響如圖5所示。圖5表明，隨著料液比的增大，水解度和多肽含量均呈現(xiàn)一個(gè)先升后降的趨勢，但是總的來說，料液比對酶解效果影響不大慮到能源以及經(jīng)濟(jì)等因素，選擇1∶5（g/mL）的料液比作為酶解條件的最優(yōu)料液比。

圖1 酶濃度對酶解效果的影響Fig.1　Influence of enzyme concentration to hydrolysis

圖2 酶解時(shí)間對酶解效果的影響Fig.2　Influence of enzyme time to hydrolysis

圖3 酶解溫度對酶解效果的影響Fig.3　Influence of enzyme temperature to

圖4pH對酶解效果的影響Fig.4　Influence of enzyme pH to hydrolysis

圖5　料液比對酶解效果的影響Fig.5　Influence of solid-liquid ratio to hydrolysis hydrolysis

2.3響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇酶濃度、溫度、時(shí)間對酶解效果有顯著影響的因素，進(jìn)行Box-Behnken-Design響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，結(jié)果如表1。采用Design-Expert對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析（ANOVA），利用Design-Expert軟件對表1的結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，獲得響應(yīng)的回歸方程為：

方差分析結(jié)果（表2）表明，以水解度為指標(biāo)，模型P值等于0.0022，表明該模型高度顯著，而模型的失擬性P值為0.6003＞0.05，而以多肽含量為指標(biāo)，模型P值等于0.0006，表明該模型高度顯著，而模型的失擬性P值為0.3509＞0.05，說明模型與實(shí)際情況擬合情況良好，可以使用該模型對實(shí)際試驗(yàn)進(jìn)行預(yù)測和分析。影響酶解液中水解度的因素順序?yàn)椋簳r(shí)間C＞酶濃度A＞溫度B；影響酶解液中多肽濃度的因素順序?yàn)槊笣舛華＞時(shí)間C＞溫度B。

表2 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2　Scheme of response surface analysis and test results

表3方差分析Table 3　Analysis of variance

各因素對酶解鯪魚下腳料水解度的影響如圖6所示。各因素對酶解鯪魚下腳料多肽含量影響的響應(yīng)面圖如圖7所示。

圖6　各因素對酶解鯪魚下腳料水解度的影響Fig.6　Influence of different factors to the degree of hydrolysis of Cirrhinus molitorella waste

圖7　各因素對酶解鯪魚下腳料多肽含量影響的響應(yīng)面圖Fig.7　Influence of different factors to the peptide content of Cirrhinus molitorella waste

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Optimization of Enzymolysis of Cirrhinus molitorella Waste with Response Surface Methodology

QU Ye-hui1，CEN Xiao-yan1，DING Li-jun1，*，HUANG Jin2，CHENG Xiao-ling1
（1.School of Chemical Engineering and Light Industry，Guangdong University of Technology，Guangzhou 510006，Guangdong，China；2.School of Materials and Energy，Guangdong University of Technology，Guangzhou，510006，Guangdong，China）

The head，bones，other raw waste of Cirrhinus molitorella were hydrolyzed by neutral protease，and response surface analysis method were used to optimize the enzymatic processes.The enzyme concentration，temperature，pH，solid to liquid ratio，time and other factors are discussed to analyze the effect of hydrolysis based on the degree of hydrolysis and peptide content.Three main factors and its three levels were chose recording to single factor test，then the experiment was based on the response surface design principles and Design-Expert software was used to analysis and validation.The results showed that：the optimum conditions of neutral hydrolysis：enzyme concentration5.1 mg/g，temperature55.16℃，time5.22 h，pH natrural，solid-liquid ratio 1∶5 （g/mL），the degree of hydrolysis and the peptide content is 13.01%and 1.07 mg/mL seperately in this condition.

Cirrhinus molitorella waste；response surface methodology；peptide；hydrolysis

2015-09-17

廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研合作重大專項(xiàng)（2013A090100009）

瞿葉輝（1990—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品加工。

丁利君（1965—），女（漢），教授。