羅天霞，樊紅琨，芮丹丹，孫佳翕，馬小芳，章　茜#

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室 鄭州 450001　2)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 新鄉(xiāng) 453000

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SK2和JPH2雙基因重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)*

羅天霞1)，樊紅琨1)，芮丹丹1)，孫佳翕2)，馬小芳1)，章茜1)#

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室 鄭州 4500012)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 新鄉(xiāng) 453000

SK2通道；JPH2蛋白；真核表達(dá)載體；HEK293

目的：構(gòu)建SK2和JPH2雙基因重組真核表達(dá)載體pIRES-EGFP/SK2+JPH2，并檢測其在轉(zhuǎn)染后HEK293細(xì)胞中的表達(dá)。方法：以pCMV6-entry/SK2為模板,PCR擴增出SK2片段，通過BgⅢ/Hind Ⅲ酶切位點克隆入真核表達(dá)載體pIRES-EGFP，將JPH2序列插入構(gòu)建的SK2表達(dá)載體pIRES-EGFP-SK2，并通過酶切及測序鑒定。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒pIRES-EGFP/SK2+JPH2轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，采用Western blot法檢測SK2通道蛋白和JPH2蛋白的表達(dá)。結(jié)果：構(gòu)建的重組真核表達(dá)載體pIRES-EGFP/SK2+JPH2經(jīng)酶切和測序鑒定，證實插入的序列與GenBank中的SK2和JPH2基因序列完全相同。pIRES-EGFP/SK2+JPH2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48 h后，SK2和JPH2蛋白均能成功表達(dá)。結(jié)論：成功構(gòu)建了重組真核表達(dá)載體pIRES-EGFP/SK2+JPH2。

小電導(dǎo)-鈣激活鉀通道(small conductance calcium activated potassium channel,SK channel)幾乎可表達(dá)于所有可興奮細(xì)胞[1]。SK2通道是心肌細(xì)胞的一種依賴鈣離子激活的鉀通道，在心肌細(xì)胞動作電位形成中起著重要作用[2-3]。Junctophilins(JPHs)存在于哺乳類和非哺乳類動物幾乎所有可興奮細(xì)胞，是與細(xì)胞間偶聯(lián)膜復(fù)合體(junctional membrane complex,JMC)形成有關(guān)的一類蛋白，通過錨定細(xì)胞膜與肌質(zhì)網(wǎng)膜而維持鈣離子的穩(wěn)態(tài)[4-5]。作者所在的實驗室之前的研究[6]顯示腺病毒介導(dǎo)的靶向小鼠JPH2 基因的siRNA可沉默小鼠心肌細(xì)胞JPH2 表達(dá)，同時也抑制細(xì)胞膜SK2 通道的功能。為進一步在體外研究JPH2蛋白與SK2通道的相互作用，該研究構(gòu)建了SK2和JPH2雙基因真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞HEK293，使其能有效表達(dá)SK2通道蛋白和JPH2蛋白。

1　材料與方法

1.1材料含全長SK2 cDNA的重組克隆載體pCMV6-entry/SK2由北京傲銳東源生物科技有限公司構(gòu)建。質(zhì)粒pIRES-EGFP、pJPH2-pcDNA3-EGFP為實驗室?guī)齑?，HEK293細(xì)胞、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自XYGEN公司，Lipofectamine2000購自Invitrogen公司，胎牛血清和DMEM高糖培養(yǎng)基購自Hyclone公司，2.5 g/L胰蛋白酶購自Gibco公司，SK2兔多克隆抗體和JPH2兔多克隆抗體購自Sigma公司，5×SDS、BCA蛋白濃度測定試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自北京康為世紀(jì)公司。

1.2SK2基因全長片段的獲得以pCMV6-entry/SK2為模板，通過PCR擴增出SK2片段，20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠回收試劑盒膠回收。

1.3真核表達(dá)載體pIRES-EGFP/SK2的構(gòu)建及鑒定用BgⅢ和Hind Ⅲ雙酶切質(zhì)粒pIRES-EGFP，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，膠回收質(zhì)粒片段。將SK2片段通過T4 DNA連接酶連入pIRES-EGFP。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，接種于含卡那霉素的LB平板培養(yǎng)基，37 ℃孵育過夜。挑選多個單克隆菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，250 r/min振蕩過夜。次日，提取質(zhì)粒用內(nèi)切酶BgⅢ和Hind Ⅲ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳，測序。

1.4真核表達(dá)載體pIRES-EGFP/SK2+JPH2的構(gòu)建將pJPH2-pcDNA3-EGFP質(zhì)粒采用Hind Ⅲ、XhoⅠ酶切，獲得JPH2，插入pIRES-EGFP/SK2表達(dá)載體。所得質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ單酶切，行瓊脂糖凝膠電泳并測序鑒定。

1.5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞HEK293細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2溫箱中孵育。待細(xì)胞融合至80%～90%時按照Lipofectamine2000操作說明書進行空質(zhì)粒pIRES-EGFP以及pIRES-EGFP/SK2+JPH2轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6 h后換為含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀察。

2　結(jié)果

2.1真核表達(dá)載體pIRES-EGFP/SK2+JPH2的鑒定構(gòu)建的真核表達(dá)載體pIRES-EGFP/SK2經(jīng)BgⅢ、Hind Ⅲ雙酶切后獲得的目的片段為1 700 bp，與小鼠SK2基因大小一致(圖1)；將測序結(jié)果與GenBank收錄序列(NM_080465.2)進行Blast比對，堿基序列一致。構(gòu)建的真核表達(dá)載體pIRES-EGFP/SK2+JPH2經(jīng)BamHⅠ酶切后得到的目的片段為2 020 bp左右，與小鼠JPH2基因大小一致(圖1)；將測序結(jié)果與GenBank收錄序列(NC_000068.7)進行Blast比對，堿基序列完全一致。

M:Marker;1:pIRES-EGFP/SK2的雙酶切產(chǎn)物;2:pIRES-EGFP/SK2+JPH2的酶切產(chǎn)物。圖1　pIRES-EGFP/SK2和pIRES-EGFP/SK2+JPH2的酶切鑒定

2.2真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞的結(jié)果將空質(zhì)粒pIRES-EGFP及重組子pIRES-EGFP/SK2+JPH2轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48 h，熒光顯微鏡下可見綠色熒光，細(xì)胞均生長良好，鋪滿培養(yǎng)皿底部，如圖2所示。

2.33組HEK293細(xì)胞SK2通道蛋白和JPH2蛋白的表達(dá)轉(zhuǎn)染pIRES-EGFP/SK2+JPH2組在60 000和74 000處可見明顯印跡條帶(圖3)，而轉(zhuǎn)染pIRES-EGFP空質(zhì)粒的對照組在相應(yīng)位置未見明顯條帶。

A:pIRES-EGFP;B:pIRES-EGFP/SK2+JPH2；1：明視野；2：熒光視野。圖2　真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48 h(×10)

1:心肌組織裂解液;2:轉(zhuǎn)染pIRES-EGFP/SK2+JPH2質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞;3:轉(zhuǎn)染pIRES-EGFP質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞。圖3　真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后SK2和JPH2的表達(dá)

3　討論

重組載體構(gòu)建成功的標(biāo)志是外源基因成功插入到載體。該研究選用的pIRES-EGFP真核表達(dá)載體有綠色熒光蛋白報告基因，能篩選轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞，且該載體能使外源基因與EGFP同時表達(dá)，非常適合用于細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)定位的研究[7]。作者首先構(gòu)建pIRES-EGFP/SK2表達(dá)載體，然后將JPH2片段插入其中，最后對構(gòu)建的重組質(zhì)粒進行測序和酶切鑒定，測序結(jié)果顯示SK2和JPH2基因與GenBank中的序列一致，酶切結(jié)果也證實重組體內(nèi)整合有目的基因，說明真核表達(dá)載體pIRES-EGFP/SK2+JPH2構(gòu)建成功。該載體是一個雙基因表達(dá)載體，具有兩個MCS多克隆位點，可插入兩個基因；兩個基因之間通過IRES連接，可實現(xiàn)兩個基因翻譯連鎖但又獨立，避免兩個基因之間表達(dá)的融合，使兩個蛋白功能免受相互干擾。

為檢驗重組載體能否轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞并使SK2和JPH2有效表達(dá)，作者選用HEK293細(xì)胞作為宿主細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染，這是因為HEK293細(xì)胞是最常用的細(xì)胞株之一，具有易于培養(yǎng)、外源基因整合到染色體效率高、表達(dá)外源蛋白水平高、活性好等優(yōu)點，利于進行實驗和結(jié)果檢測[8]。通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后的細(xì)胞，可見綠色熒光蛋白的表達(dá)，說明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。Western blot結(jié)果證實轉(zhuǎn)染pIRES-EGFP/SK2+JPH2質(zhì)粒的細(xì)胞中有SK2通道蛋白和JPH2蛋白的表達(dá)，與已有報道[3,6]的結(jié)果一致。

在心臟疾病中，例如，肥厚型心肌病和心力衰竭，JPH2表達(dá)水平的降低能導(dǎo)致心肌細(xì)胞興奮收縮偶聯(lián)的缺陷[9]。然而，目前對JPH與胞漿膜離子通道偶聯(lián)的種類及分子機制所知甚少。尤其在心肌細(xì)胞上，JPH2是否與心肌SK2通道之間有偶聯(lián)作用，目前尚未見報道。

該研究成功構(gòu)建了pIRES-EGFP/SK2+JPH2真核表達(dá)載體，并實現(xiàn)了在HEK293細(xì)胞中的有效表達(dá)，為體外進一步研究SK2通道蛋白與JPH2蛋白的相互作用打下了實驗基礎(chǔ)。

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(2015-11-19收稿責(zé)任編輯徐春燕)

Construction of an eukaryotic expression vector carried SK2 and JPH2 genes and expressions of SK2 and JPH2 proteins in HEK293 cells

LUOTianxia1),FANHongkun1),RUIDandan1),SUNJiaxi2),MAXiaofang1),ZHANGQian1)

1)DepartmentofPhysiology,SchoolofBasicMedicalSciences，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)SchoolofBasicMedicalSciences,XinxiangMedicalCollege,Xinxiang453000

SK2 channel;JPH2 protein; eukaryotic expression vector; HEK293 cell line

Aim: To construct an eukaryotic expression vector carried SK2 and JPH2 genes and detect the expression of them in the transfected HEK293 cells.Methods: The full-length SK2 gene was obtained from a recombinant vector pCMV6-entry/SK2 by PCR amplification, and cloned it into the eukaryotic expression vector pIRES-EGFP. Then JPH2 gene was inserted into pIRES-EGFP-SK2 vector and was detected by endonuclease digestion and sequencing.The recombinant pIRES-EGFP/SK2+JPH2 was transfected into HEK293 cells with a liposome infection protocol. The expressions of SK2 and JPH2 protein were detected by Western blot.Results: Both endonuclease digestion and sequence analysis demonstrated that the inserted sequences of pIRES-EGFP/SK2+JPH2 were identical to those of the full-length of SK2 and JPH2 genes in GenBank. Moreover, both SK2 and JPH2 protein in HEK 293 cells transfected with pIRES-EGFP/SK2+JPH2 for 48 h were expressed successfully.Conclusion: The eukaryotic expression vector pIRES-EGFP/SK2+JPH2 as well as the expressions of SK2 and JPH2 cell lines have been successfully constructed.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.05.006

*國家自然科學(xué)基金資助項目81270248；81570311

，女，1957年10月生，博士，教授，研究方向:心臟生理學(xué)，E-mail:qianzhang@zzu.edu.cn

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