周　寧，王智偉，曹平華，2，王　磊，3，陳玉林，楊雨鑫*（.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌7200；2.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南洛陽47003；3.青海大學(xué)青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海西寧80003）

產(chǎn)酸性木聚糖酶鏈霉菌的鑒定、酶學(xué)特性及發(fā)酵工藝研究

周寧1，王智偉1，曹平華1，2，王磊1，3，陳玉林1，楊雨鑫1*
（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌712100；2.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南洛陽471003；3.青海大學(xué)青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海西寧810003）

木聚糖是谷物類飼料中的主要抗?fàn)I養(yǎng)因子。為篩選高效降解半纖維素的菌株，提高粗飼料利用率，本試驗(yàn)采用水解圈法從土壤中篩選出1株產(chǎn)木聚糖酶的細(xì)菌，經(jīng)鑒定為灰略紅鏈霉菌，命名為Streptomyces griseorubens W L003。該菌所產(chǎn)木聚糖酶的最適酶促反應(yīng)溫度和pH分別為65℃、4.5，于30～55℃處理10m in后，殘余酶活不低于80％；于pH 3.5～11.0處理1.5 h，殘余酶活仍保持在88％以上；Tween-80可提高木聚糖酶活力，而Cu2+、SDS 及β-巰基乙醇則會(huì)較強(qiáng)地抑制酶活。該菌株以9％接種量接種至最適發(fā)酵培養(yǎng)基，碳源為10％麥秸，氮源為1.41％牛肉膏，0.1％吐溫-80，初始pH為6.0，經(jīng)32℃、180 r/m in下培養(yǎng)7 d時(shí)，所產(chǎn)木聚糖酶活性最高，可達(dá)50.82 U/m L，為優(yōu)化前2.5倍。菌株W L003對麥秸的粗纖維降解效果最好，對苜蓿草粉的粗纖維降解效果最差。證明從土樣分離到的酸性木聚糖酶菌株W L003，在降解飼料粗纖維方面具有較好的應(yīng)用潛力。

鏈霉菌；木聚糖酶；酶學(xué)性質(zhì)；產(chǎn)酶條件優(yōu)化

［Abstract］The cereal diet enriches in xylan，which is an non-starch polysaccharides as anti-nutrients for animals. The aim of this research was to isolate hemicellulose-decomposing strains with high enzyme activity.A new xylanase producing strain was selected，which was identified as Streptomyces griseorubens，named Streptomyces griseorubens WL003. The xylanase produced by Streptomyces griseorubens WL003 showed optimal activitywas at 65℃and pH 4.5.The residual xylanase activity was over 80％after treatmentat30～55℃for 10min.The residual xylanase activity was over 88％after treatment at pH 3.5～11.0 for 1.5 h，which showed the xylanase had good pH stability.Tween-80 could promote the enzyme activity，while Cu2+，SDS andβ-mercaptoethanol significantly inhibited the activity.The best liquid fermentation conditions for xylanase production showed as follow：fermentation time 7 d，inoculum dose 9％，initial pH 6.0，fermentation temperature 32℃，tween-80 0.1％，wheat straw 10％，nitrogen source 1.41％，shaking speed 180 r/min，the average activity of xylanase reached to 50.82 U/mL，and it was 2.5-fold of that before the optimization.The best effect of the crude fiber degradation was observed in wheat straw，however，the lowest effect of the degradation of crude fiber was found in alfalfa meal.Xylan-decomposing strain WL003 separated from soil sample could produce acid-stable xylanase and behave better development potential on crude fiber degradation.

［Key words］Streptomyces；xylanase；enzymatic characteristics；enzyme producing conditions

木聚糖酶可以將β-D-1，4-木糖苷鍵連接的木聚糖降解為低聚木糖。自然界中多種生物可以分泌木聚糖酶，如真菌、酵母、瘤胃細(xì)菌以及無脊椎動(dòng)物等，部分植物也能產(chǎn)木聚糖酶。目前研究較多的是微生物法生產(chǎn)木聚糖酶（王麗和陳衛(wèi)平，2005）。微生物木聚糖酶多為誘導(dǎo)酶，而木聚糖、木寡糖、木質(zhì)纖維素殘基是其常見的誘導(dǎo)底物（李秀婷等，2008）。已報(bào)道的從農(nóng)業(yè)廢棄物中分離篩選出的產(chǎn)木聚糖酶的菌株主要有木霉（Tenkanen等，2013；Miyauchi等，2013）、曲霉 （Fadel等，2014）、鏈霉菌（He等，2014）和芽孢桿菌（Kumar等，2014）等。呂秋鳳等（2013）在小麥日糧中添加木聚糖酶，可減少14～42日齡AA肉仔雞的腸道大腸桿菌數(shù)，降低食糜pH值和食糜黏度。王利等（2012）在以小麥作為基礎(chǔ)的生長仔豬日糧中添加木聚糖酶，可以顯著提高仔豬的生長性能和營養(yǎng)物質(zhì)消化率（P＜0.05），維持腸道微生物菌群的平衡。通常微生物分泌的木聚糖酶的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性較差，這極大限制了其在飼料生產(chǎn)中的應(yīng)用。因此，篩選穩(wěn)定性好、耐酸、酶活高的木聚糖降解菌可有效提高粗飼料的利用，拓寬飼料資源。本研究從土樣中分離產(chǎn)木聚糖酶的菌株，并對其進(jìn)行種屬鑒定，同時(shí)分析其所產(chǎn)木聚糖酶的酶學(xué)特性，優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，研究其所產(chǎn)木聚糖酶對三種粗飼料（麥秸、玉米秸稈、苜蓿草粉）的降解效果，進(jìn)而為該酶作為酶制劑應(yīng)用于粗纖維飼料降解提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1樣品采集樣品采集于咸陽市楊陵區(qū)長期堆積秸稈的土壤以及寧夏紅寺堡區(qū)天源良種羊繁育養(yǎng)殖有限公司灘羊的糞便。

1.2培養(yǎng)基初篩固體培養(yǎng)基（g/L）：KH2PO41.0 g、MgSO40.3 g、NaCl 0.1 g、NaNO32.5 g、CaCl2·6H2O 0.1 g、FeCl30.01 g、樺木木聚糖20 g、瓊脂20 g，pH 7.0，121℃滅菌30min。

樺木木聚糖分離培養(yǎng)基（g/L）：樺木木聚糖20 g、Na2HPO42.5 g、KH2PO41.5 g、蛋白胨2.5 g、瓊脂20 g，pH自然，121℃滅菌30min。

基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10 g、酵母提取物 5 g、（NH4）2SO42.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO41.0 g、NaCl 0.5 g、樺木木聚糖2.0 g、瓊脂20 g，pH 7.0，121℃滅菌30min后備用。

發(fā)酵培養(yǎng)基：在100 mL基礎(chǔ)產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基（不添加木聚糖）中分別加入10.0 g小麥麩皮、麥秸、玉米秸稈、玉米芯，121℃滅菌30min。

科列亞科瓊脂培養(yǎng)基（g/L）：KNO31 g、葡萄糖 20 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、檸檬酸鐵0.5 g、CaCO31 g、瓊脂20 g，121℃滅菌30min。

種子培養(yǎng)基（g/L）：土豆200 g/L、木糖20 g/L。將土豆去皮切塊200 g，加蒸餾水煮沸30min，紗布過濾，將過濾后的土豆水用蒸餾水補(bǔ)足1 L，pH 7.0，121℃滅菌30min。

1.3菌株初篩、純化及復(fù)篩取樣品于50 mL滅菌離心管中，用滅菌蒸餾水進(jìn)行不同梯度倍數(shù)（10-3、10-4、10-5、10-6）稀釋。將不同稀釋倍數(shù)的稀釋液各100μL，均勻涂布于初篩培養(yǎng)基，每個(gè)稀釋度三個(gè)重復(fù)，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱上，連續(xù)培養(yǎng)7 d后，加入適量1％的剛果紅染液染色1 h，并用1 mo/L NaCl溶液進(jìn)行脫色，觀察菌落周邊的水解圈直徑與菌落直徑比值（D/d）并測定其液體發(fā)酵粗酶液的酶活，將液體發(fā)酵酶活最高的菌株作為目的菌株，進(jìn)行劃線分離純化。

將初篩純化獲得的單菌落接種于30 mL搖瓶（250mL）基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基上，于37℃、220 r/min下培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間后，取液體發(fā)酵液于10000 r/min、4℃離心10min，棄沉淀，上清液即為粗酶液。根據(jù)制定的木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線和木聚糖酶活力測定方法測定該粗酶液的木聚糖酶活。

1.4木聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及粗酶液木聚糖酶活力的測定采用DNS法測定木聚糖酶活力：取3支25 mL比色管，加入2 mL 1％樺木木聚糖，分別置于適溫下預(yù)熱2min，之后迅速加入0.1mL粗酶液，精準(zhǔn)計(jì)時(shí)5 min后，立即加入2.5 mL DNS，煮沸5min后冷卻，定容至10mL，混勻。對照組將粗酶液置于沸水中煮沸30min滅活，測定時(shí)取25 mL比色管，分別加入2 mL 1％樺木木聚糖，2.5 mL DNS和0.1 mL滅活粗酶液，混勻后煮沸5 min后冷卻，定容至10 mL，混勻后用于空白對照，于540 nm波長比色。然后根據(jù)木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算木聚糖酶活力。

酶活單位：按照以上方法測定木聚糖酶酶活，樺木木聚糖1 min內(nèi)被分解成1μmol木糖所需要的酶量定義為1個(gè)酶活單位，U/mL。

分別吸取0.1％標(biāo)準(zhǔn)木糖溶液0、0.5、1.0、2.0、4.0mL，定容至10mL。取上述不同濃度木糖溶液各2mL于比色管中，每管分別加入3，5-二硝基水楊酸（DNS）2.5mL，煮沸5min。冷卻后，加水稀釋至10mL。用HⅠTACH紫外分光光度計(jì)U-3900 在540 nm波長下進(jìn)行比色，以光密度值作橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)木糖溶液濃度為縱坐標(biāo)，繪制木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5菌株W L003的形態(tài)學(xué)鑒定及種屬鑒定將篩選的目的菌株在科列亞科瓊脂培養(yǎng)基上37℃恒溫培養(yǎng)10 d，觀察菌落的形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色。提取目的菌株的基因組DNA，以其基因組DNA為模板，利用16S rDNA通用引物，通過PCR擴(kuò)增該菌株的保守片段，將擴(kuò)增到的產(chǎn)物送南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測序，然后對測序結(jié)果進(jìn)行同源性比對。

菌株的培養(yǎng)特征和部分生理生化特征按 《鏈霉菌鑒定手冊》（1975）中的指導(dǎo)方法進(jìn)行分析。

1.6菌株W L003木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)分析將菌株的種子液接種于基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基上，于37℃、220 r/min培養(yǎng)7 d，然后10000 r/min、4℃離心15 min制得木聚糖酶粗酶液。以下處理均設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.6.1最適酶促反應(yīng)溫度和酶的熱穩(wěn)定性將粗酶液與底物緩沖液混勻，利用DNS法分別于30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80℃下測木聚糖酶活力。酶的熱穩(wěn)定性測定方法為將粗酶液在不同溫度（30、35、40、45、50、55、60、65℃）下處理10min，利用DNS法于最適溫度和pH測定木聚糖酶活力，以未經(jīng)處理的粗酶液的酶活力的100％計(jì)算。

1.6.2最適酶促反應(yīng)pH和酶的pH穩(wěn)定性將不同pH值（3.0～12.0）的底物緩沖液與粗酶液混勻，利用DNS法于最適溫度下測定木聚糖酶活力。酶的pH穩(wěn)定性測定方法為將粗酶液與不同pH底物緩沖液混勻置于4℃恒溫培養(yǎng)箱中放置1.5 h，利用DNS法于最適反應(yīng)條件下測定木聚糖酶活力，以未經(jīng)處理的粗酶液的酶活力為100％計(jì)算。

1.6.3對金屬離子和有機(jī)試劑的耐受性將粗酶液與相應(yīng)濃度的金屬離子溶液和有機(jī)試劑溶液混勻，4℃處理1.5 h。利用DNS法在最適反應(yīng)條件下測定木聚糖酶活力，以未經(jīng)處理的粗酶液的酶活力為100％計(jì)算。

1.7菌株W L003產(chǎn)酶條件優(yōu)化通過單因素試驗(yàn)，確定液體發(fā)酵時(shí)間、接種量、初始pH、碳源、氮源對菌株產(chǎn)木聚糖酶的影響。

通過正交試驗(yàn)優(yōu)化菌株WL003的培養(yǎng)溫度、吐溫-80添加量、麥秸添加量、轉(zhuǎn)速，每個(gè)因素3個(gè)水平（表1）。

表1　正交試驗(yàn)因素與水平

1.8菌株W L003產(chǎn)木聚糖酶對粗纖維的降解效果取2.0 g農(nóng)業(yè)廢棄物（麥秸、玉米秸、苜蓿草粉）與90 mL乙酸鈉緩沖液（pH 4.5）混勻，于121℃高壓滅菌30min，加入最佳產(chǎn)酶條件下制得的粗酶液10 mL（酶活單位為50.82 U/mL），以相同體積的基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)液作空白對照，于37℃恒溫?fù)u床中分別處理12、24、36、48、60 h，測定處理液中還原糖含量（取降解液2 mL與2.5 mL DNS混勻煮沸5min，測定OD540值），每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.9數(shù)據(jù)分析用SPSS 19進(jìn)行統(tǒng)計(jì)差異性分析，以P＜0.05作為檢驗(yàn)各項(xiàng)數(shù)據(jù)的差異顯著性水平。

2　結(jié)果與分析

2.1菌株的篩選與鑒定

2.1.1產(chǎn)木聚糖酶菌株的篩選經(jīng)反復(fù)篩選，獲得6株產(chǎn)木聚糖酶菌株。由表2可知，其中5株分離于灘羊糞便，1株分離自土壤（WL003）。由表2可知，菌株 WL003的木聚糖酶活性最高，為20.68 U/mL，因此選作后續(xù)研究對象。

表2　木聚糖酶產(chǎn)生菌篩選結(jié)果

2.1.2菌株形態(tài)學(xué)鑒定將菌株WL003接種科列亞科瓊脂培養(yǎng)基上生長10 d后，可觀察到菌落成圓形、灰白色、周圍氣生菌絲成發(fā)散狀分布；剛果紅染色發(fā)現(xiàn)菌體周圍有明顯的水解圈；顯微鏡下觀察氣生菌絲，發(fā)現(xiàn)菌絲呈柔曲狀、緊密交錯(cuò)；革蘭氏染色呈藍(lán)紫色，為革蘭氏陽性菌。

2.1.3培養(yǎng)特征和生理生化特征菌株WL003在大多數(shù)培養(yǎng)基上生長良好，但是在葡萄糖天冬素培養(yǎng)基上無法生長。菌株氣生菌絲在高氏合成1號(hào)呈灰白色，培養(yǎng)基內(nèi)菌絲呈褐色；克式合成1號(hào)氣生菌絲呈白色，培養(yǎng)基內(nèi)菌絲呈污黃色，周圍可產(chǎn)生微黃色色素；察氏瓊脂培養(yǎng)基氣生菌絲呈白色，培養(yǎng)基內(nèi)菌絲呈乳脂色；淀粉瓊脂培養(yǎng)基上氣生菌絲呈白色，基內(nèi)菌絲呈乳脂色；馬鈴薯塊上氣生菌絲呈白色，而培養(yǎng)基內(nèi)菌絲呈淺褐色。

菌株WL003生理生化特征的分析結(jié)果表明該菌株牛奶凝固隨后胨化，明膠液化、淀粉水解、纖維素生長產(chǎn)生的反應(yīng)為陽性，硝酸鹽還原、色素產(chǎn)生為陰性，不產(chǎn)生H2S。能利用木糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇、甘油、酒石酸鉀鈉、檸檬酸鈉，不能利用蔗糖。

2.1.4菌株WL003的16SrDNA序列分析以菌株WL003的基因組DNA為模板，用16S rDNA通用引物擴(kuò)增該菌株16S rDNA基因，測序后，將測序結(jié)果進(jìn)行 NCBⅠBlast同源性比對，發(fā)現(xiàn)WL003的16S rDNA與Streptomyces griseorubens strain MMH9（KR133201.1）相似性達(dá)99％。將比對到的同源性高的16S rDNA序列，利用MEGA5.10軟件中Neighbor-Joining方法，bootstrap值設(shè)定為1000，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果見圖1。結(jié)合菌株的培養(yǎng)特性和生理生化特性，參考 《鏈霉菌鑒定手冊》，該菌株與灰略紅鏈霉菌（Streptomyces grise鄄orubens）的特性比較相似，因此鑒定WL003為灰略紅鏈霉菌。

圖1　基于16S rDNA基因同源序列構(gòu)建的菌株WL003系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2菌株WL003所產(chǎn)木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.2.1酶促反應(yīng)的最適pH和對pH穩(wěn)定性如圖2A和C所示，菌株WL003所產(chǎn)木聚糖酶在pH 4.5時(shí)的酶活性最高，在pH 3.5～11.0范圍內(nèi)仍有較高的活力。因此說明，該菌所產(chǎn)木聚糖酶具有較寬的pH范圍，尤其是對偏酸性環(huán)境的適應(yīng)性較強(qiáng)。粗酶液于pH 3.5～11.0處理1.5 h，殘余酶活可保持在88％以上，說明該菌株具有較寬pH穩(wěn)定范圍。

注：A為最適pH，B為最適溫度，C為pH穩(wěn)定性，D為熱穩(wěn)定性。圖2　菌株產(chǎn)木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)分析

2.2.2酶促反應(yīng)的最適溫度和熱穩(wěn)定性圖2B 和D顯示，菌株WL003所產(chǎn)木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為65℃，粗酶液在30～55℃處理10min后，殘余酶活可保持在80％以上；60℃處理10min后，殘余酶活僅有36％，說明菌株WL003所產(chǎn)的木聚糖酶在60℃以下時(shí)耐熱性較好。

2.2.3對金屬離子及有機(jī)溶劑的耐受性由表3可知，Cu2+、SDS和β-巰基乙醇處理粗酶液后，木聚糖酶酶活分別下降至 34.84％、41.17％和47.95％，說明三者對木聚糖酶活力起較強(qiáng)的抑制作用。而Tween-80處理粗酶液后，其酶活提高至112.12％，說明吐溫對木聚糖酶活力有一定的促進(jìn)作用。

2.3鏈霉菌W L003的產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.3.1不同接種量對菌株 WL003產(chǎn)酶的影響由圖3可知，以9％的接種量發(fā)酵的粗酶液中木聚糖酶活力最高，為19.41 U/mL，但與5％、7％和11％接種量的酶活力差異不顯著（P＞0.05），因此選擇接種量為9％作為最佳接種量進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3.2不同培養(yǎng)時(shí)間對菌株WL003產(chǎn)酶的影響由圖4可知，發(fā)酵3 d時(shí)，WL003所產(chǎn)木聚糖酶酶活較低，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，酶活力也隨之增加，第7天達(dá)到最大值，為32.00 U/mL，從第8天開始酶活力下降，蛋白質(zhì)被分解，酶活下降。

表3　金屬離子和有機(jī)試劑對木聚糖酶酶活的影響

注：大寫字母不同表示差異極顯著（P＜0.01），小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）；下同。圖3　不同接種量對菌體產(chǎn)酶的影響

圖4　不同培養(yǎng)時(shí)間對菌株WL003產(chǎn)酶的影響

2.3.3不同初始pH對菌株WL003產(chǎn)酶的影響在優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，用1 mol/L的HCL 或1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)初始pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵7 d。結(jié)果見圖5。由圖5可知，初始pH為 6.0時(shí)，其發(fā)酵粗酶液的木聚糖酶活力最高，達(dá)33.04 U/mL。說明該菌株所產(chǎn)的木聚糖酶的最適pH是偏酸性的。

圖5　不同初始pH對菌體產(chǎn)酶的影響

2.3.4不同碳源對菌株WL003產(chǎn)酶的影響由圖6可知，以麥秸作為碳源培養(yǎng)7 d時(shí)，WL003所產(chǎn)木聚糖酶酶活最高，為33.64 U/mL，顯著高于玉米芯、玉米桿和麩皮（P＜0.05）；而玉米芯作為碳源時(shí)，WL003所產(chǎn)木聚糖酶活性顯著高于玉米桿和麩皮。因此選擇麥秸作為碳源進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖6　不同碳源對菌體產(chǎn)酶的影響

2.3.5不同氮源對菌株WL003產(chǎn)酶的影響由圖7可知，以牛肉膏（1.41％）作為氮源發(fā)酵的粗酶液中木聚糖酶活力最高，為34.31 U/mL，酵母提取物次之，氯化銨最低。因此選擇牛肉膏作為發(fā)酵的最佳氮源。

圖7　不同氮源對菌株WL003產(chǎn)酶的影響

2.3.6不同培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、麥秸添加量、吐溫-80添加量對WL003產(chǎn)酶的影響結(jié)果見圖8。為提高菌株產(chǎn)酶能力，在之前培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎(chǔ)上，應(yīng)用正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化菌株WL003發(fā)酵產(chǎn)酶條件。結(jié)果表明，當(dāng)菌株WL003產(chǎn)酶培養(yǎng)基吐溫-80添加0.1％、麥秸添加10％，于32℃、180 r/min發(fā)酵培養(yǎng)7 d時(shí)，粗酶液木聚糖酶活力高達(dá)50.82 U/mL，最適發(fā)酵條件下菌株WL003所產(chǎn)木聚糖酶的酶活是優(yōu)化前的2.5倍。

注：圖中2、6、10為麥秸添加百分含量。圖8　不同培養(yǎng)溫度、不同轉(zhuǎn)速、麥秸添加量、吐溫-80添加量下菌株WL003產(chǎn)木聚糖酶活力的比較

2.4粗纖維降解效果分析將菌株WL003所產(chǎn)木聚糖酶粗酶液分別處理麥秸、玉米秸、苜蓿草粉。于不同時(shí)間測定三種粗飼料的還原糖含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三種粗飼料中還原糖含量隨酶液處理時(shí)間顯著變化（P＜0.05），其中麥秸和苜蓿草粉呈極顯著變化（P＜0.01）。菌株WL003所產(chǎn)粗酶液對麥秸的降解效果最好，對苜蓿草粉的降解效果最差（表4）。

表4　不同處理時(shí)間三種粗纖維還原糖的含量

3　討論

本試驗(yàn)利用此方法篩選得到一株降解木聚糖的菌株，對其生理生化特性、培養(yǎng)特性及16S rDNA序列進(jìn)行分析，鑒定WL003為灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens）。產(chǎn)木聚糖酶菌株報(bào)道較多的是絲狀真菌（包怡紅等，2005）。鏈霉菌雖然是細(xì)菌，但在形態(tài)上分化有菌絲和孢子，培養(yǎng)特性與真菌類似，具有真菌的特性，在木聚糖酶產(chǎn)生過程中，用孢子進(jìn)行接種，經(jīng)液體培養(yǎng)利用菌絲產(chǎn)酶。

由于營養(yǎng)物質(zhì)的消耗以及菌體代謝產(chǎn)物的增加，導(dǎo)致發(fā)酵環(huán)境較起始發(fā)生改變不利于產(chǎn)酶，液體發(fā)酵7 d酶活達(dá)到最高，隨后開始下降，因此菌株WL003最佳發(fā)酵時(shí)間為7 d。不同接種量對酶活有一定的影響，接種量太小，接入的生物量不足，至產(chǎn)酶量上不去；接種量太大，菌體之間相互競爭營養(yǎng)物質(zhì)及空間通氣量，進(jìn)而影響菌體的生長，無法大量分泌成熟的酶蛋白。以接種量9％種子液進(jìn)行接種，產(chǎn)酶最佳；初始pH影響菌絲的生長，菌絲對酶活有直接的影響，結(jié)果表明初始pH 為6.0接種的粗酶液木聚糖酶活力最高。放線菌和細(xì)菌的最適生長和產(chǎn)酶pH接近于中性 （陸鍵和曹鈺，2001），而本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，偏酸性條件有利用菌株WL003木聚糖酶的產(chǎn)生。吐溫-80是一種表面活性劑，由于表面活性劑可以增加細(xì)胞膜的通透性，減少酶在膜上的吸附率，有利于產(chǎn)物酶及時(shí)分泌到胞外（Battan等，2007）。添加吐溫-80能夠提高產(chǎn)酶活性，最佳添加量為0.1％。一般來說有機(jī)氮較于無機(jī)氮發(fā)酵分泌的木聚糖酶酶活更高（Zhang等，2013）。說明菌株偏好利用營養(yǎng)豐富的氮源進(jìn)行生物體的代謝，本試驗(yàn)中以牛肉膏作為氮源，菌株WL003發(fā)酵液的酶活最高。由于木聚糖酶通常是一種誘導(dǎo)酶，在誘導(dǎo)物的誘導(dǎo)下，刺激菌體分泌較多的木聚糖酶蛋白到胞外，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以麥秸作為誘導(dǎo)碳源，液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶最高。農(nóng)業(yè)廢棄物作為誘導(dǎo)物能夠有效地降低酶制劑的生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)木聚糖酶在飼料工業(yè)中的廣泛應(yīng)用。

本試驗(yàn)中鏈霉菌胞外分泌木聚糖酶最適反應(yīng)溫度和 pH分別為 65℃、4.5，這與馮佳麗等（2011）報(bào)道的結(jié)果相似。但WL003所產(chǎn)木聚糖酶的酶促反應(yīng)溫度較高，而且具有較好的熱穩(wěn)定性。WL003所產(chǎn)木聚糖酶的最適pH值為4.5，而已報(bào)道的放線菌最適生長和產(chǎn)酶pH大多接近于中性，表明菌株WL003可能分泌一組偏酸性木聚糖酶。酶在工業(yè)上的應(yīng)用，一般要經(jīng)過長時(shí)間的高溫（50～60℃）處理，因此酶對高溫耐受性成為評(píng)價(jià)其性質(zhì)的重要指標(biāo)。熱處理后酶殘余的酶活力通常預(yù)示在高溫條件下酶蛋白的結(jié)構(gòu)域與催化域的穩(wěn)定性。本試驗(yàn)所產(chǎn)木聚糖酶在30～55℃處理10 min后，剩余酶活可保持在80％以上，說明試驗(yàn)菌株產(chǎn)木聚糖酶對熱環(huán)境具有一定的耐受力，熱穩(wěn)定性較好。該酶在pH 3.5～11.0緩沖液中處理90 min，仍有88％以上的剩余酶活，說明該酶對pH值（pH 3.5～11.0）耐受范圍較寬，具有更廣泛的應(yīng)用潛力。該酶對酸和堿耐受性較好，其應(yīng)用于飼料工業(yè)進(jìn)行工藝處理時(shí)具有很強(qiáng)的適應(yīng)性和耐受度。金屬離子及有機(jī)試劑的耐受性結(jié)果顯示，Tween-80對木聚糖酶酶活有促進(jìn)作用，Cu2+、SDS

和β-巰基乙醇處理對酶活有較強(qiáng)的抑制，因此將該酶應(yīng)用于飼料加工時(shí)應(yīng)盡量避免接觸這些抑制劑。通過酶學(xué)性質(zhì)分析，菌株WL003表現(xiàn)出較好的酶學(xué)性質(zhì)，表明將其產(chǎn)木聚糖酶作為飼用酶制劑應(yīng)用于飼料工業(yè)有很大的潛力和價(jià)值。

4　結(jié)論

本試驗(yàn)篩選得到一株木聚糖降解菌株WL003，經(jīng)鑒定為灰略紅鏈霉菌，命名為Strepto鄄myces griseorubens WL003。菌株WL003所產(chǎn)木聚糖酶最適溫度為65℃，最適pH為4.5，具有較好的耐熱性和pH穩(wěn)定性；Tween-80可提高木聚糖酶活力，而Cu2+、SDS及β-巰基乙醇對酶活有較強(qiáng)的抑制作用。菌株WL003的最佳產(chǎn)酶條件為：接種量9％，碳源為10％麥秸，氮源為1.41％牛肉膏，0.1％吐溫-80，初始pH為6.0，于32℃、180 r/min條件下培養(yǎng)7 d。該條件下所產(chǎn)木聚糖酶活性最高，為50.82 U/mL。菌株WL003對麥秸具有較強(qiáng)的降解能力。

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A

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10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160805

國家自然基金（31072060）；國家絨毛用羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-40-13）