劉建玲，牟　英，戴建英，修志龍（大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，沈陽大連116024）

玉米皮固態(tài)培養(yǎng)混合益生菌的研究

劉建玲，牟英，戴建英，修志龍*
（大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，沈陽大連116024）

本試驗(yàn)以玉米皮為主要原料，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對黑曲霉與釀酒酵母的混合固態(tài)培養(yǎng)進(jìn)行了研究。以蛋白酶、纖維素酶、活菌數(shù)為主要考察指標(biāo)，優(yōu)化得出的最佳培養(yǎng)條件為：尿素添加量0.5％（P＜0.05）、含水量60％、麩皮添加量15％（P＜0.05）、黑曲霉接種量20％、培養(yǎng)天數(shù)7 d；混菌培養(yǎng)接種比（黑曲霉∶釀酒酵母）為3∶1，混菌共培養(yǎng)1 d。在此條件下，纖維素酶的酶活為622.11 U/g，蛋白酶的酶活為606.55 U/g，每克發(fā)酵物含益生活菌總數(shù)超過百億。

玉米皮；固態(tài)培養(yǎng)；纖維素酶；蛋白酶；益生菌

［Abstract］Solid-state culture of Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisiae was studied by using corn bran as main material.Single-factor and orthogonal experimentwere used to optimize the nutritional and environmental conditions for improving the activity of protease，cellulase and the number of living cells.The optimized cultivation conditions for As鄄pergillus niger were as follows：urea content 0.5％（P＜0.05），water content 60％，wheat bran adding level 15％（P＜0.05），inoculation amount 20％，cultivation period 7 days.When co-culture of two strains was conducted，the ratio of As鄄pergillus niger to Saccharomyces cerevisiae was 3∶1，and co-culture time was 1 day.Under the above conditions，the cellulase activity reached to 622.11U/g，the protease activity achieved 605.55U/g，and the total number of living probiotic cells reached tomore than ten billion per gram.

［Key words］corn bran；solid-state cultivation；cellulase；protease；probiotics

玉米皮是玉米深加工的副產(chǎn)物，其本身含有大量的纖維素和半纖維素，適口性差，不利于非反芻類家畜消化（王偉偉等，2013）。相關(guān)研究通過益生菌固態(tài)培養(yǎng)制備蛋白質(zhì)飼料來提高玉米皮的利用率和營養(yǎng)價(jià)值。研究表明，細(xì)菌、真菌、放線菌等都能產(chǎn)生纖維素酶 （劉潔麗和王靖，2008），其中黑曲霉所產(chǎn)酶系豐富，可產(chǎn)十余種酶類，并且自身也是生物安全菌，動(dòng)物利用后能促進(jìn)消化吸收（呂玉麗等，2012）。有研究表明，黑曲霉在培養(yǎng)過程中能水解出過量的還原糖，可以接入釀酒酵母進(jìn)行混菌培養(yǎng)。酵母菌在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物能提高瘤胃中有益菌的數(shù)量和活力，調(diào)節(jié)瘤胃的發(fā)酵功能，另外酵母菌還能產(chǎn)生維生素，這樣既能減輕還原糖對纖維素酶活性的抑制，又能進(jìn)一步提高活菌飼料的性能。本研究以纖維素酶酶活、蛋白酶酶活、活菌數(shù)為考察指標(biāo)，以成本廉價(jià)、來源豐富的玉米皮為主要原料，對黑曲霉與釀酒酵母混合體系的固態(tài)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料菌種：黑曲霉DL-1，由大連工業(yè)大學(xué)提供；釀酒酵母，篩選自安琪高活性干酵母粉。玉米皮，由長春博納士環(huán)?？萍加邢薰咎峁?。

黑曲霉活化培養(yǎng)基 （沙氏培養(yǎng)基）：葡萄糖4％，蛋白胨1％，115℃滅菌20min。

黑曲霉種子培養(yǎng)基（L）：玉米皮60 g，麩皮20 g，玉米漿干粉20 g，水900mL，121℃滅菌20min。

酵母菌培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，加水煮沸30 min，用紗布過濾后加入20 g葡萄糖，加水補(bǔ)至1 L，115℃，20min滅菌。

1.2試驗(yàn)方法分別考察尿素添加量、含水量、麩皮添加量、培養(yǎng)周期、接種量等因素對黑曲霉纖維素酶產(chǎn)量和活菌數(shù)的影響。在此基礎(chǔ)上，選定麩皮添加量、培養(yǎng)周期、接種量設(shè)計(jì)三因素三水平的正交試驗(yàn)。在優(yōu)化的黑曲霉固態(tài)培養(yǎng)條件基礎(chǔ)上接入酵母菌，考察混菌接種比例、培養(yǎng)天數(shù)等因素對纖維素酶酶活、蛋白酶酶活及活菌數(shù)的影響。

1.3分析方法活菌數(shù)的確定：固態(tài)培養(yǎng)完成后，取0.5 g固態(tài)培養(yǎng)基置于10 mL離心管中，加入4.5mL的生理鹽水，充分振蕩混勻，釋放出菌體，通過稀釋涂布，計(jì)算出每克固態(tài)培養(yǎng)基所含的活菌數(shù)。

纖維素酶酶活的測定：取1mL稀釋后的酶液于25mL的試管中，再加入1mL pH 4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液，將試管置于40℃的恒溫水浴鍋中保溫2 min，向每個(gè)試管中加入1 cm×1 cm的新華1號(hào)濾紙6片，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)60 min，然后置于沸水浴鍋中10 min，使酶變性失活，冷卻后，再向每個(gè)試管中加入3mL的DNS溶液，置于沸水浴鍋中15 min，迅速冷卻后，加入10 mL蒸餾水，混勻，在540 nm的波長下測吸光值，并從葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中查找出相應(yīng)的葡萄糖質(zhì)量濃度，折算出酶活（胡慧東和許贛榮，2011）。纖維素酶酶活的定義：在pH 4.5、溫度40℃條件下，每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1μg葡萄糖所需要的酶量定義為1單位酶活，單位為U/g（樣品）或U/mL。

蛋白酶酶活的測定：取稀釋后的酶液1 mL置于5mL的離心管中，與10 g/L的酪素溶液共同在40℃條件下預(yù)熱5min，然后取1mL 10 g/L的酪素溶液迅速加入到離心管中，精確保溫10min使酶發(fā)揮水解作用，10min后，迅速精確地向離心管中加入2mL 0.4 mol/L三氯乙酸，終止酶解反應(yīng)，繼續(xù)在水浴鍋中保溫20 min，使蛋白質(zhì)變性沉淀，5000 r/min條件下離心10min，取上清液1mL于離心管中，加入福林酚試劑甲5mL，充分混勻后，置于25℃條件下保溫10min，然后加入福林酚試劑乙0.5mL，立即搖勻，繼續(xù)保溫30min，500 nm波長下測吸光值，并從酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線中查找出相應(yīng)的酪氨酸質(zhì)量濃度，折算出酶活。蛋白酶酶活的定義：在40℃條件下，每分鐘水解酪素產(chǎn)生1μg酪氨酸所需的酶量定義為一個(gè)單位的酶活，單位為U/g（樣品）或U/mL。

測定所用福林-酚試劑甲、乙的區(qū)別如下，試劑A：稱取1 g的碳酸鈉置于燒杯中，配制0.2mol/L的氫氧化鈉溶液，量取50 mL倒入燒杯，與碳酸鈉混勻。

試劑B：配制1％的酒石酸鉀鈉，稱取0.5 g的硫酸銅溶于100mL 1％的酒石酸鉀鈉溶液中，混勻。

將試劑A和試劑B按50∶1的比例混勻，即為試劑甲，該試劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

試劑乙為生物公司購買的福林-酚試劑。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)用Excel軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異。

2　結(jié)果與討論

2.1黑曲霉固態(tài)培養(yǎng)條件的單因素考察鑒于黑曲霉具有能夠產(chǎn)生豐富的纖維素酶、蛋白酶的特性，前期主要采用單因素試驗(yàn)考察麩皮添加量、含水量、尿素、培養(yǎng)周期、接種量等因素對黑曲霉產(chǎn)酶及活菌數(shù)的影響。

2.1.1尿素添加量的影響由圖1可知，當(dāng)尿素添加量為0.5％時(shí)，纖維素酶酶活最高，達(dá)到670.21 U/g，較對照組提高12.79％（P＜0.05）；活菌數(shù)也達(dá)到最高，是空白對照的1.61倍。由此可見，少量的尿素能夠促進(jìn)纖維素酶的合成，促進(jìn)黑曲霉菌體的生長；而當(dāng)尿素的含量過高，就會(huì)抑制纖維素酶的產(chǎn)生，導(dǎo)致酶活降低，這可能是由于尿素的添加量過高，影響了培養(yǎng)基的pH，不利于纖維素酶的產(chǎn)生。

圖1　尿素添加量對酶活及活菌數(shù)的影響

2.1.2含水量的影響在黑曲霉固態(tài)培養(yǎng)過程中，水分的含量影響營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸和吸收，因此對黑曲霉的生長和產(chǎn)酶起著至關(guān)重要的作用。在固定玉米皮、麩皮和玉米漿干粉的比例為3∶1∶1的條件下，分別加入不同量的水，培養(yǎng)6 d后，測定酶活和活菌數(shù)，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，培養(yǎng)基含水量為60％時(shí)，酶活和菌落數(shù)達(dá)到最大值，這與已報(bào)道的研究結(jié)果類似（孫付保等，2010；王菁莎等，2006）。含水量太低，不利于黑曲霉對營養(yǎng)成分的利用，導(dǎo)致酶活及菌落數(shù)都較低，但水分含量過高，培養(yǎng)基的通透性變差，氧氣供應(yīng)不足，使菌體處于不利于生長的狀態(tài)，導(dǎo)致酶活和活菌數(shù)也降低。

圖2　含水量對酶活及活菌數(shù)的影響

2.1.3麩皮添加量的影響纖維素酶是一種誘導(dǎo)酶，本試驗(yàn)對麩皮的添加量對纖維素酶的誘導(dǎo)作用進(jìn)行了考察。以玉米皮為主要培養(yǎng)基，玉米皮和玉米漿干粉比例為3∶1，含水量60％，不同麩皮添加量的培養(yǎng)結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，當(dāng)麩皮添加量為15％時(shí)，纖維素酶酶活達(dá)到最高，較對照提高34.59％（P＜0.05），黑曲霉的菌落數(shù)與麩皮添加量呈正相關(guān)。雖然麩皮的營養(yǎng)成分豐富，能夠有效的誘導(dǎo)纖維素酶的產(chǎn)生，但如果含量過高，會(huì)導(dǎo)致滅菌后的培養(yǎng)基變黏稠，氧氣供應(yīng)不足，進(jìn)而抑制酶的產(chǎn)生。菌落數(shù)與麩皮添加量正相關(guān)是因?yàn)楫a(chǎn)生了更多的孢子。

圖3　麩皮添加量對酶活和活菌數(shù)的影響

2.1.4培養(yǎng)周期的影響以玉米皮為主要培養(yǎng)基成分，含水量60％，121℃、20min滅菌，接種量10％，考察不同培養(yǎng)時(shí)間對酶活及活菌數(shù)的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可見，培養(yǎng)至第3天，培養(yǎng)基中開始出現(xiàn)明顯的白色菌絲；第5天時(shí)，開始出現(xiàn)褐色的孢子。蛋白酶酶活與活菌數(shù)并未呈現(xiàn)正相關(guān)，第5天時(shí)達(dá)到了最大酶活（496 U/g）；纖維素酶酶活與菌落數(shù)呈正相關(guān)?；罹鷶?shù)隨著培養(yǎng)周期的延長而增加，這是因?yàn)榈?天之后有大量的孢子產(chǎn)生。

圖4　培養(yǎng)時(shí)間對酶活和活菌數(shù)的影響

2.1.5接種量的影響接種量直接影響微生物培養(yǎng)的時(shí)間和質(zhì)量，接種量過低，培養(yǎng)過程緩慢，培養(yǎng)時(shí)間延長；接種量過高，營養(yǎng)不足，導(dǎo)致菌體大量死亡，反而不利于最終的培養(yǎng)。不同接種量對玉米皮固態(tài)培養(yǎng)的影響結(jié)果如圖5所示。由圖5可見，不同試驗(yàn)組之間蛋白酶酶活的差異不顯著，纖維素酶和活菌數(shù)都表現(xiàn)出了先增加后降低的趨勢，接種量在15％時(shí)，纖維素酶酶活達(dá)到最大值，為511.82U/g。

圖5　接種量對酶活和活菌數(shù)的影響

2.2正交試驗(yàn)優(yōu)化固態(tài)培養(yǎng)工藝在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定玉米皮和玉米漿干粉的比例為3∶1，含水量為60％，再選定麩皮添加量、培養(yǎng)天數(shù)、接種量三個(gè)重要因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，如表1所示。正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。從纖維素酶酶活角度考慮，最優(yōu)組合為A2B3C2；蛋白酶酶活則為A1B1C2；活菌數(shù)的最優(yōu)組合為A1B3C1。由此可見，孢子的產(chǎn)生不利于蛋白酶的形成，與單因素試驗(yàn)相吻合。綜合考慮最優(yōu)組合為A2B3C2，即麩皮添加量為15％，培養(yǎng)天數(shù)為7 d，接種量為20％。

2.3釀酒酵母接種時(shí)間對混菌培養(yǎng)的影響黑曲霉在培養(yǎng)過程中會(huì)產(chǎn)生多種酶類，將原料中的纖維素、半纖維素等水解成還原糖供自身生長利用。由于酶活較高，培養(yǎng)結(jié)束后會(huì)有過量的還原糖存在。為了降低還原糖對酶的抑制作用，同時(shí)增加飼料的性能，在培養(yǎng)過程中添加了酵母菌。本次試驗(yàn)考察了酵母菌接種時(shí)間對混菌共培養(yǎng)的影響。分別在黑曲霉培養(yǎng)第3、4、5天時(shí)接入酵母菌，培養(yǎng)結(jié)果如圖6所示。由圖6可見，纖維素酶和蛋白酶的酶活都表現(xiàn)出先增后降的趨勢，最佳接種時(shí)間為第5天；就活菌數(shù)而言，共培養(yǎng)時(shí)間越長，活菌數(shù)越多。綜合考慮，確定酵母菌的最佳接種時(shí)間為黑曲霉培養(yǎng)5 d后接種，即共同培養(yǎng)1 d。

圖6　混菌共培養(yǎng)時(shí)間對酶活和活菌數(shù)的影響

表1　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果

2.4黑曲霉與釀酒酵母接種比對固態(tài)混菌培養(yǎng)的影響酵母菌生長所需的碳源依賴于黑曲霉，但同時(shí)又與黑曲霉競爭營養(yǎng)物質(zhì)，阻礙黑曲霉的生長，抑制酶的生成。本試驗(yàn)不同比例接種量的培養(yǎng)結(jié)果如圖7所示。從圖7可以看出，添加少量的酵母菌對纖維素酶的產(chǎn)生是有利的，這與已報(bào)道的研究結(jié)果類似（唐海翠等，2006）。圖中顯示的最佳比例為4∶1；就蛋白酶酶活而言，最適混菌比例為3∶1，酶活較對照提高42.79％（P＜0.05）；而對活菌數(shù)而言，二者比例為3∶1時(shí)比較合適。酵母菌添加量過高，對纖維素酶、蛋白酶和活菌數(shù)均不利，這表明酵母菌與黑曲霉之間確實(shí)存在生長競爭關(guān)系。綜合考慮，選定黑曲霉與酵母菌的最優(yōu)接種比例為3∶1。

圖7　混菌接種比例對酶活和活菌數(shù)的影響

3　結(jié)論

經(jīng)過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)，最終確定的玉米皮固態(tài)培養(yǎng)黑曲霉的優(yōu)化工藝為尿素添加量0.5％、含水量60％、麩皮添加量15％、黑曲霉接種量20％、培養(yǎng)天數(shù)7 d。在滿足黑曲霉最優(yōu)生長的條件下接入酵母菌，最佳接種比例為黑曲霉∶酵母菌為3∶1，混菌共培養(yǎng)時(shí)間為1 d。

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S816.7

A

1004-3314（2016）08-0025-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160807