吳曉娟，唐小平，蘇艷秋，羅國強(qiáng)（通威股份有限公司，四川成都610041）

生產(chǎn)蝦青素的雨生紅球藻藻株及其培養(yǎng)基篩選

吳曉娟，唐小平，蘇艷秋，羅國強(qiáng)
（通威股份有限公司，四川成都610041）

為篩選獲得適合大規(guī)模生產(chǎn)蝦青素的藻株及適宜其生長和蝦青素積累的培養(yǎng)基，研究比較了3個不同品系的雨生紅球藻H 2、H 3、H 4在4種不同培養(yǎng)基BBM、BBM+1 g/L NaAC、SM、BG11中的生長和蝦青素積累情況。結(jié)果表明：SM有利于雨生紅球藻的生長和生物量的積累；而在相同培養(yǎng)基中，生長速度為H3＞H2＞H4。在所有試驗組中，藻株H3在培養(yǎng)基SM中營養(yǎng)生長和生物量積累最快，在培養(yǎng)基BBM+1 g/LNaAC中蝦青素含量（2.17％）和蝦青素產(chǎn)量（30.1mg/L）最高，分別為其他試驗組的1.16～4.72倍（P＜0.05）和1.18～6.28倍（P＜0.01）。因此，藻株H3比較適宜作為大規(guī)模培養(yǎng)的藻株，其最適生長繁殖和蝦青素積累的培養(yǎng)基分別為SM和BBM+1 g/LNaAC。

雨生紅球藻；培養(yǎng)基；干重；蝦青素；篩選

［Abstract］Ⅰn order to gain the suitable algae and culturemedium for astaxanthin production，the influence of culture medium on the cell growth and astaxanthin accumulation of Haematococcus pluvialis were studied and compared.Three strains of Haematacoccus pluvialis（H2，H3 and H4）were cultured in four differentmedia（BBM，BBM+1 g/L NaAC，SM and BG11）.The results showed that the SM medium was benefit for the growth and biomass accumulation of Haematacoc鄄cus pluvialis.Ⅰn the samemedium，the growth rate was faster in H3 than H2 and H4.Ⅰn all experimental groups，the strain H3 had the fastest growth rate and biomass accumulation rate in themedium SM，and had the highest astaxanthin content （2.17％）and astaxanthin yield（30.1mg/L）in BBM+1 g/L NaACmedium，reaching 1.16～4.72 times（P＜0.05）and 1.18～6.28 times（P＜0.01）of those of other experimental groups，respectively.So，the strain H3 was fit for large scale cultivation，and its optimalmedium for growth and astaxanthin accumulation were SM and BBM+1 g/L NaAC，respectively.

［Key words］Haematacoccus pluvialis；culturemedia；dry weight；astaxanthin；selection

雨生紅球藻是一種淡水單細(xì)胞綠藻，其細(xì)胞內(nèi)的蝦青素含量高達(dá)4％，是已知的天然蝦青素含量最高的生物，被認(rèn)為是自然界中生產(chǎn)天然蝦青素的最好來源（Orosa等，2005）。蝦青素是一種具有很強(qiáng)抗氧化性的類胡蘿卜素，具有促進(jìn)抗體產(chǎn)生、增強(qiáng)免疫力、抑制腫瘤、清除自由基和活性氧以及抗紫外線輻射等多種生物功能 （Martin和Mark，2003）。雨生紅球藻中的蝦青素在結(jié)構(gòu)、生理功能（穩(wěn)定性和氧化活性）、應(yīng)用效果及安全性等方面要優(yōu)于合成蝦青素（蔡明剛等，2003）。大量研究表明，富含蝦青素的雨生紅球藻作為飼料添加劑，對魚、蝦等養(yǎng)殖對象的著色、存活率、生長、繁殖和發(fā)育、生理功能和營養(yǎng)價值具有積極的意義（吳曉娟等，2015；Ju等，2012；Ansari等，2011）。

然而目前雨生紅球藻培養(yǎng)依然存在生長慢、生物量低、蝦青素含量偏低等問題。雨生紅球藻在弱光、氮磷豐富等適宜條件下進(jìn)行營養(yǎng)生長積累生物量，在強(qiáng)光等不利條件下積累蝦青素。其中，藻株和培養(yǎng)基質(zhì)是雨生紅球藻生長和蝦青素積累的關(guān)鍵因子（董慶霖等，2007；劉健暉和李愛芬，2006）。本試驗以3株不同品系的雨生紅球藻為試驗材料，研究4種不同培養(yǎng)基對雨生紅球藻生長及蝦青素積累的影響，以期篩選出適合大規(guī)模生產(chǎn)蝦青素的藻株及其培養(yǎng)基，為大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗材料試驗藻種為雨生紅球藻（Haema鄄tococcus pluvialis）H2、H3、H4，購買自中科院水生生物研究所淡水藻種庫，為經(jīng)過本公司無菌純化的藻種。

1.2試驗方法將3株雨生紅球藻預(yù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期，分別接種于培養(yǎng)基BBM、BBM+1g/L NaAC、SM、BG11中，調(diào)整接種密度2×104/mL左右，每個試驗組3個重復(fù)，置于光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。營養(yǎng)培養(yǎng)8 d：25℃，光強(qiáng)3000 lx，24 h光照；誘導(dǎo)培養(yǎng)30 d：溫度30℃，光強(qiáng)12000 lx，12 h光照。每天搖動培養(yǎng)瓶3～4次。

1.3生長指標(biāo)測定

1.3.1藻細(xì)胞數(shù)及比生長速率的測定營養(yǎng)培養(yǎng)階段每天定時取樣，樣品經(jīng)lugol’s碘液固定后，利用血球計數(shù)板計數(shù)活細(xì)胞數(shù)。根據(jù)Gao等（2007）的方法，按以下公式，以藻細(xì)胞數(shù)來計算比生長速率（滋）：

式中：C1和C2分別代表培養(yǎng)時間為T1和T2時的藻細(xì)胞數(shù)。

1.3.2藻液OD值的測定參照劉健暉和李愛芬（2006）的方法，用分光光度計定時測定雨生紅球藻營養(yǎng)細(xì)胞懸液在680 nm處的吸光度值（OD680），得到藻細(xì)胞的濃度，作為生物量的參考指標(biāo)。

1.3.3細(xì)胞干重的測定通過把一定量的藻液過濾到已知干重的濾膜上，用蒸餾水沖洗掉藻細(xì)胞上附著的鹽分，放入烘箱中經(jīng)80℃烘干24 h以上至恒重，放在干燥器中冷卻，經(jīng)電子天平稱重并減掉濾紙重量后得到藻體干重。（吳曉娟等，2013）

1.4蝦青素測定方法根據(jù)Boussiba等（1992）的方法提取和測定蝦青素。稱取藻粉W mg，置于15mL玻璃試管中，加入4mL含5％NaOH、30％甲醇的水溶液，70℃水浴10min，保溫過程中經(jīng)常搖動，3000 r/min離心3min，棄去上清液（葉綠素被抽提到上清液中）。加入4mL含少量醋酸（5滴每10mL）的DMSO，搖勻，70℃水浴10min，間隔搖動玻璃試管。3000 r/min離心3min，將上清液轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中。重復(fù)提取直到藻渣無色。將待測溶液放入1 cm光徑比色皿中，用DMSO作為空白對照，在492 nm下測定吸光值A(chǔ)，按消光系數(shù)A1cm1％=2200及以下公式計算蝦青素濃度：

式中：C1為溶液中蝦青素的濃度；C2為藻粉中蝦青素的含量。

1.5數(shù)據(jù)分析試驗數(shù)據(jù)利用Excel 2007進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用Origin 7.0中的單因素方差分析方法（one-way ANOVA）對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P＜0.05和P＜0.01分別表示差異顯著和差異極顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)基對雨生紅球藻營養(yǎng)生長的影響圖1可知，培養(yǎng)前2 d，雨生紅球藻H2、H3在各培養(yǎng)基中OD680值沒有明顯差異，都處于生長延滯期，而雨生紅球藻H4在培養(yǎng)基SM、BBM+1 g/L NaAc中生長表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。隨培養(yǎng)時間的延長，3株雨生紅球藻均在SM培養(yǎng)基中生長最快。培養(yǎng)到第8天，以培養(yǎng)基SM培養(yǎng)的H3營養(yǎng)生長最快，其OD680值達(dá)到0.85，為其他試驗組的1.77～8.89倍（P＜0.01）。

由圖1～2可知，培養(yǎng)8 d后，3株雨生紅球藻在各培養(yǎng)基中細(xì)胞數(shù)與OD680值呈現(xiàn)相同的趨勢。在所有3株雨生紅球藻和4種培養(yǎng)基中，以培養(yǎng)基SM培養(yǎng)的H3營養(yǎng)生長最快，其藻細(xì)胞數(shù)為5.2×105個/mL，是其他組的1.71～4.53倍 （P＜0.01）。以培養(yǎng)8 d后的藻細(xì)胞數(shù)為基數(shù)，計算雨生紅球藻營養(yǎng)生長階段的比生長速率，結(jié)果見圖3。由圖3可知，4種培養(yǎng)基中，雨生紅球藻H2在培養(yǎng)基SM中營養(yǎng)生長的比生長速率最快，分別比BBM、BBM （+NaAC）、BG11試驗組高55.2％（P＜0.01）、18.6％（P＜0.01）、11.4％（P＜0.05）；H3也是在培養(yǎng)基SM中營養(yǎng)生長的比生長速率最快，分別比BBM、BBM （+NaAC）、BG11試驗組高25.7％、32.1％、68.6％（P＜0.01）；H4是在培養(yǎng)基BBM （+NaAC）和SM中營養(yǎng)生長的比生長速率最快，比BBM、BG11試驗組高24.4％～28.9％（P＜0.01）。

由上述分析來看，根據(jù)生長參數(shù)OD680、藻細(xì)胞數(shù)、比生長速率等指標(biāo)判斷，3株雨生紅球藻（H2、H3、H4）均在培養(yǎng)基SM中營養(yǎng)生長最快；而在相同培養(yǎng)基中，生長速度為H3＞H2＞H4。在所有試驗中，以培養(yǎng)基SM培養(yǎng)的雨生紅球藻H3營養(yǎng)生長最快。

圖1　3株雨生紅球藻在不同培養(yǎng)基中營養(yǎng)生長階段的OD680值變化

圖2　不同培養(yǎng)基中雨生紅球藻各營養(yǎng)生長階段的細(xì)胞數(shù)

2.2培養(yǎng)基對雨生紅球藻細(xì)胞干重的影響從圖4可以看出，雨生紅球藻H2、H3在培養(yǎng)基SM中的干重積累最高，而H4則在培養(yǎng)基BBM+1 g/L NaAc中的干重積累最高。相同培養(yǎng)基中，H2、H3的細(xì)胞干重均要高于H4。在各試驗組中，以培養(yǎng)基SM培養(yǎng)的雨生紅球藻H2、H3的藻細(xì)胞干重最高，達(dá)到1.72～1.75 g/L，比其他組高9.8％～79.8％ （P＜0.05）。因此，培養(yǎng)基SM有利于雨生紅球藻的生長和生物量的積累。

圖4　不同培養(yǎng)基中3株雨生紅球藻的細(xì)胞干重

2.3培養(yǎng)基對雨生紅球藻蝦青素積累的影響由圖5和圖6可見，脅迫培養(yǎng)后，3株雨生紅球藻（H2、H3、H4）在培養(yǎng)基SM中都沒有變紅，其蝦青素含量均明顯低于使用其他培養(yǎng)基的試驗組，分別為其他培養(yǎng)基試驗組的36.8％～52.7％、24.4％～28.2％、25.3％～42.0％（P＜0.01），不利于蝦青素的積累。在所有試驗組中，藻株H3在培養(yǎng)基BBM+ 1 g/LNaAC中的蝦青素含量最高，達(dá)到2.17％，為其他組的1.16～4.72倍（P＜0.05）。

圖5　不同培養(yǎng)基中3株雨生紅球藻的蝦青素含量

圖6　不同培養(yǎng)基中3株雨生紅球藻的蝦青素產(chǎn)量

3株雨生紅球藻在BBM+1g/LNaAC培養(yǎng)基中的蝦青素含量和蝦青素產(chǎn)量均高于BBM培養(yǎng)基（P＜0.05），可見乙酸鈉可以促進(jìn)雨生紅球藻的蝦青素合成和積累。在所有試驗組中，采用培養(yǎng)基BBM+1g/L NaAC培養(yǎng)的H3和利用BG11培養(yǎng)的H2的最終蝦青素產(chǎn)量均較高，且無顯著差異，分別為30.1mg/L和29.4mg/L，為其他實驗組的1.18～6.28倍 （P＜0.01）；但H3在培養(yǎng)基BBM+1 g/L NaAC中的蝦青素含量更高，有助于降低蝦青素提取成本。因此，在3株雨生紅球藻中，藻株H3和培養(yǎng)基BBM+1 g/LNaAC比較適宜作為大規(guī)模培養(yǎng)的藻株和積累蝦青素的培養(yǎng)基。

3　討論

3.1培養(yǎng)基對雨生紅球藻生長的影響在不同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，雨生紅球藻的生長有較大的差異，可能與培養(yǎng)基的營養(yǎng)鹽組分有關(guān)。本試驗中，各培養(yǎng)基在C、N源種類及含量上存在較大差異。3株雨生紅球藻均在SM培養(yǎng)基中營養(yǎng)生長最快，可能是由于SM培養(yǎng)基中主要C源為2.0 g/L乙酸鈉，高于BBM+1 g/L NaAC試驗組的乙酸鈉含量，而培養(yǎng)基BBM、BG-11中無乙酸鈉。董慶霖等（2007）認(rèn)為乙酸鈉大幅度提高了雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)硝酸還原酶的活性，使藻細(xì)胞迅速吸收硝酸鹽進(jìn)行異養(yǎng)生長，生物量迅速提高。此外，SM培養(yǎng)基中氮源為NH4NO3，其他3種培養(yǎng)基的N源均為NO3-。應(yīng)巧蘭和葉勇（2002）對不同氮源需求做了比較，表明雨生紅球藻797在NH4+-N培養(yǎng)基中培養(yǎng)的生長速率明顯高于 NO3--N培養(yǎng)基。Harker等（1995）也認(rèn)為，與NO3--N相比，NH4+-N能被雨生紅球藻優(yōu)先利用。

3.2培養(yǎng)基對雨生紅球藻蝦青素積累的影響3株雨生紅球藻在培養(yǎng)基SM中的蝦青素含量和蝦青素產(chǎn)量均明顯低于使用其他培養(yǎng)基的試驗組，可能是由于SM中的NH4+-N雖然有利于雨生紅球藻生物量的積累，但不利于蝦青素的積累。Harker等（1995）研究結(jié)果顯示NH4+對藻細(xì)胞內(nèi)蝦青素的合成有抑制作用。

3株雨生紅球藻在培養(yǎng)基BBM+1 g/L NaAC中的蝦青素積累效果均優(yōu)于其他培養(yǎng)基，可能是由于醋酸鈉可以促進(jìn)雨生紅球藻的蝦青素合成和積累，并且沒有受到NH4+-N的抑制。Droop（1961）認(rèn)為醋酸鹽易被紅球藻吸收參與蝦青素的合成。董慶霖等（2007）研究了醋酸鈉誘導(dǎo)雨生紅球藻合成蝦青素的機(jī)理，認(rèn)為乙酸鈉使雨生紅球藻生物量提高，導(dǎo)致硝酸鹽濃度的急速下降和氮源供應(yīng)不足，進(jìn)而造成了“碳饑餓”，使細(xì)胞內(nèi)蝦青素合成的相關(guān)基因被激活。

4　結(jié)論

4.1BBM、BBM+1 g/L NaAC、SM、BG11四種培養(yǎng)基中，3株雨生紅球藻（H2、H3、H4）均在SM中營養(yǎng)生長最快；而在相同培養(yǎng)基中，生長速度為H3＞H2＞H4。

4.2在各試驗組中，雨生紅球藻H3在培養(yǎng)基SM中營養(yǎng)生長和生物量積累最快，在BBM+1 g/L NaAC培養(yǎng)基中蝦青素含量和蝦青素產(chǎn)量最高。4.3在3株雨生紅球藻中，藻株H3比較適宜作為大規(guī)模培養(yǎng)的藻株，其最適生長和產(chǎn)蝦青素的培養(yǎng)基分別為SM和BBM+1 g/LNaAC。

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1004-3314（2016）08-0029-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160808

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