陳麗娟　乞艷華　鄔晉芳*　高慶　周妮　韓瑞寧　石麗葉　張建光　賈建坤

(1.西安交通大學第二附屬醫(yī)院，陜西 西安 710004；2.北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司，北京 100015)

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高通量測序技術(shù)在低齡孕婦胎兒染色體非整倍體疾病無創(chuàng)產(chǎn)前檢測中的應用研究

陳麗娟1乞艷華1鄔晉芳1*高慶1周妮1韓瑞寧1石麗葉1張建光2賈建坤2

(1.西安交通大學第二附屬醫(yī)院，陜西 西安 710004；2.北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司，北京 100015)

目的探討傳統(tǒng)血清學篩查、超聲篩查及HTS檢測應用于染色體非整倍體產(chǎn)前檢測的檢測效率，評價HTS及聯(lián)合篩查對胎兒染色體非整倍體疾病檢測的靈敏度和特異度及臨床可行性。方法收集2013年1月1日至2013年12月31日進行HTS檢測的低齡孕婦資料1612例。本研究以核型分析為金標準，血清學篩查高風險、超聲篩查異?；騂TS檢測陽性者在知情同意基礎上進行核型分析。其余病例隨訪至胎兒出生后。結(jié)果血清學篩查、超聲篩查、HTS對低齡孕婦胎兒染色體非整倍體疾病檢測的靈敏度分別為65%(13/20)、24%(6/25)、92%(23/25)，特異度分別為42.52%(608/1430)、91.50%(1442/1576)、99.56%(1569/1576)，陽性預測值分別為1.56%(13/835)、4.29%(6/140)、76.67%(23/30)。超聲聯(lián)合血清學篩查、超聲聯(lián)合HTS的檢測靈敏度分別為68%(17/25)、96%(24/25)，特異度分別為40.55%(647/1576)、91.24%(1438/1576)，陽性預測值分別為1.78%(17/954)、14.81%(24/162)。結(jié)論HTS檢測T21、T18的靈敏度高、假陽性率低，而且HTS可以檢測13、X、Y染色體非整倍體等目前血清學篩查無法檢測的染色體疾病，因此HTS檢測應用于胎兒染色體非整倍體的產(chǎn)前篩查具有臨床可行性；與血清學篩查、超聲篩查相比，HTS檢測效率較高，且無孕周限制，可避免因較高假陽性而造成的不必要的侵入性產(chǎn)前診斷；相比于超聲聯(lián)合血清學篩查，超聲聯(lián)合HTS具有更高的靈敏度、更低的假陽性率，可以緩解產(chǎn)前診斷工作的壓力。

染色體非整倍體；血清學篩查；超聲篩查；高通量測序

染色體異常是導致新生兒出生缺陷的主要原因之一，目前國內(nèi)外對該類疾病均無有效的治療方法，給患兒家庭及社會帶來沉重的精神和經(jīng)濟負擔。因此在孕期及時診斷出胎兒染色體異常、適時終止妊娠是降低出生缺陷的重要手段。產(chǎn)前篩查存在的假陽性、產(chǎn)前診斷方法的創(chuàng)傷性是目前我國染色體疾病產(chǎn)前診斷存在的關鍵問題。高通量測序技術(shù)(high-throughput sequencing，HTS)為當前的產(chǎn)前篩查-產(chǎn)前診斷模式提供了新的選擇。但是目前為止，關于常規(guī)血清學篩查和HTS產(chǎn)前檢測的比較卻有許多爭議。雖然國內(nèi)外指南均已推薦HTS用于高危人群的初篩，但仍需要對更多人群，尤其是普通人群的檢測能力進行評價，以明確此方法對非整倍體低危人群的檢測能力。為此，本課題對1612例進行HTS檢測的低齡單胎樣本進行回顧性研究，探討傳統(tǒng)血清學篩查、超聲篩查及HTS檢測應用于染色體非整倍體產(chǎn)前檢測的檢測效率，評價HTS及聯(lián)合篩查對胎兒染色體非整倍體疾病檢測的靈敏度和特異度及臨床可行性。

1　資料與方法

1.1臨床資料按照“知情同意及知情選擇”原則，本實驗收集2013年1月1日至2013年12月31日進行HTS檢測的低齡孕婦資料1612例。入選條件為：①預產(chǎn)期年齡<35歲；②孕11周以上單胎孕婦；③自然受孕；④孕婦體重<100kg；⑤孕婦知情同意，并簽署知情同意書。排除標準為：①孕婦為染色體疾病患者；②孕婦近期接受過異體輸血、移植手術(shù)、干細胞治療等。本研究在研究前已取得醫(yī)院倫理委員會認可。

1.2實驗方法

1.2.1超聲篩查①孕早期超聲篩查在妊娠11～13+6周進行，常規(guī)測量胎兒頂臀徑以估算孕周，主要檢查有無頸項透明帶(NT)增厚、鼻骨缺失、三尖瓣反流、靜脈導管a波倒置等；②孕中期超聲篩查，在妊娠22～24周進行，測量雙頂徑、頭圍、腹圍、股骨長、肱骨長、側(cè)腦室寬度等，并按順序檢查胎兒頭顱、顏面、胸部、心臟、腹部、脊柱、四肢、胎盤等，篩查胎兒解剖結(jié)構(gòu)的異常。當超聲篩查出現(xiàn)一個或多個軟指標異常時，判定為高風險。

1.2.2血清學篩查本研究采用血清學二聯(lián)篩查，母血清篩查標記物為 AFP和β-hCG，儀器使用AutoDELFIA自動時間分辨熒光免疫檢測系統(tǒng)，時間分辨免疫熒光試劑盒來自PerkinElmer公司，應用LifeCycle統(tǒng)計軟件處理分析。采樣方法：空腹采集肘靜脈血2～3ml于20℃靜置30分鐘，離心(2000r/min)10分鐘，取上層血清保存于4℃冰箱，1周內(nèi)檢測，剩余血清置-20℃保存以備復測。21-三體≥1/270、18-三體≥1/350判定為高風險。

1.2.3高通量測序技術(shù)妊娠12周以上的孕婦抽取10ml外周血至BCTTM管，72小時內(nèi)送至北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司。然后分離血漿、抽提DNA、制備測序文庫。將制作好的文庫質(zhì)控后，Illumina Hiseq2000進行36bp單端測序。將每個樣本測序所得的序列與人類參考基因組進行比對，統(tǒng)計每條染色體上的唯一比對序列(unique reads)數(shù)和GC含量。對于每個樣本的每條染色體，我們計算GC矯正過的NCRgc值，并根據(jù)所得的NCRgc值計算Z-score值。Z-score值的正常參考值為-3.0～3.0。

1.2.4羊水穿刺孕婦在簽完知情同意書后，在超聲引導下行羊膜腔穿剌術(shù)抽取20ml羊水， 2000r/min離心10分鐘，去上清后每管沉淀中加入4ml羊水細胞培養(yǎng)基，吸管輕輕混勻，將細胞懸液移至無菌培養(yǎng)瓶中，放入CO2培養(yǎng)箱，5% CO2、37°C培養(yǎng)；待瓶中已有3個以上的克隆形成，每個克隆有較多的球形透亮細胞，即可收獲。染色體G顯帶核型分析參照(ISCN 2005)標準進行。核型分析確診者建議其盡早終止妊娠；陰性者隨訪至嬰兒出生后。

1.3統(tǒng)計學分析本研究所有數(shù)據(jù)均使用Microsoft Office Excel2007錄入，采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用平均數(shù)±標準差表示，并用方差分析檢驗，計數(shù)資料用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1基本資料本研究共收集1612例低齡單胎樣本，其中3例未有妊娠結(jié)局隨訪結(jié)果，8例未通過測序前的質(zhì)控，因此有效樣本數(shù)為1601例。受檢孕婦的年齡跨度為17～34歲，平均年齡為(28.28±3.24)歲；采樣孕周的范圍為11～34+3周，平均采樣孕周為(18.80±3.18)周。

2.2血清學、超聲、HTS及核型分析結(jié)果統(tǒng)計

2.2.1血清學、超聲及HTS檢測效力1601例低齡孕婦樣本中經(jīng)統(tǒng)計有1450例于孕中期行血清學二聯(lián)篩查，篩查高危者835例。其中，T21高危者786例，T18高危者52例(其中有3例樣本篩查結(jié)果為T21、T18均高風險)。篩查高危者中有13例經(jīng)核型分析確診為染色體非整倍體，其中12例T21、1例T18。1601例超聲篩查樣本中提示異常者有140例，6例經(jīng)核型分析確診為染色體非整倍體，其中2例T21，2例T18，1例45,X，1例47,XYY。HTS結(jié)果異常者共計30例，其中12例T21(2例為T21嵌合)，4例T18(1例為T18嵌合)，1例T13，8例45,X，1例47,XXX，2例47,XXY，2例47,XYY，檢測陽性率為1.87%(30/1601)。

我們共計對58例HTS異常及主動要求產(chǎn)前診斷者進行了侵入性產(chǎn)前診斷，有9例與核型分析結(jié)果不一致：①編號12X50869，HTS結(jié)果為正常，核型分析結(jié)果為T21；②編號13X93605，HTS結(jié)果為正常，核型分析結(jié)果為T21；③編號12X18586，HTS結(jié)果為ChrX-，核型分析結(jié)果正常；④編號12X43066，HTS結(jié)果為ChrX-，核型分析結(jié)果正常；⑤編號13C28643，HTS結(jié)果為ChrX+，核型分析結(jié)果正常；⑥編號13C40653，HTS結(jié)果為ChrX-，核型分析結(jié)果正常；⑦編號13X16728，HTS結(jié)果為47,XYY，核型分析結(jié)果正常；⑧編號13X43507，HTS結(jié)果為T21，核型分析結(jié)果正常；⑨編號13X43539，HTS結(jié)果為T13，核型分析結(jié)果正常。25例核型分析異常的孕婦最終選擇了終止妊娠，其余病例隨訪至出生后，新生兒未發(fā)現(xiàn)與染色體非整倍體疾病相關的外觀特征。

我們以核型分析為金標準，比較血清學篩查、超聲篩查和HTS在檢測染色體非整倍體方面的效力，見表1。本研究中，血清學篩查對低齡孕婦胎兒染色體非整倍體疾病的檢測靈敏度為65%(13/20)，特異度為42.52%(608/1430)，陽性預測值為1.56%(13/835)。25例核型分析異常者，6例被超聲篩查檢出，19例被超聲篩查漏掉，超聲篩查檢測胎兒染色體非整倍體疾病的靈敏度為24%(6/25)，特異度為91.50%(1442/1576)，陽性預測值為4.29%(6/140)。核型分析確診的25例染色體非整倍體樣本中，23例被HTS檢出，2例被HTS漏掉，HTS對胎兒染色體非整倍體疾病的檢測靈敏度為92%(23/25)，特異度為99.56%(1569/1576)，陽性預測值為76.67%(23/30)。HTS對各條染色體檢測的靈敏度和特異度在表2列出。

表1　血清學、超聲及HTS對低齡孕婦胎兒染色體非整倍體的檢測效力

注：+：陰性；-：陽性

表2　HTS對各條染色體的檢測效力

注：+：陰性；-：陽性

2.2.2聯(lián)合篩查的檢測效力為了避免出生缺陷患兒的出生，提高產(chǎn)前篩查效力，我們進一步評價了超聲聯(lián)合血清學篩查及超聲聯(lián)合HTS對低齡孕婦胎兒染色體非整倍體疾病的檢測效力。核型分析確診的25例染色體非整倍體樣本中，超聲聯(lián)合血清學篩查檢出17例，漏診8例；超聲聯(lián)合HTS檢出24例，1例T21被漏診。因此超聲聯(lián)合血清學篩查對胎兒染色體非整倍體疾病檢測的靈敏度為68%(17/25)，特異度為40.55%(647/1576)，陽性預測值為1.78%(17/954)；超聲聯(lián)合HTS檢測胎兒染色體非整倍體疾病的靈敏度為96%(24/25)，特異度為91.24%(1438/1576)，陽性預測值為14.81%(24/162)(表3)。

表3　聯(lián)合篩查對低齡孕婦胎兒染色體非整倍體的檢測效力

注：+：陰性；-：陽性

3　討論

血清學篩查因其有效、簡便、無創(chuàng)且安全、經(jīng)濟，一直作為唐氏綜合征產(chǎn)前篩查的主要方法。本研究結(jié)果顯示，血清學篩查對低齡孕婦胎兒染色體非整倍體檢測的陽性預測值為1.56%，可能受到統(tǒng)計基數(shù)及地域的限制，本次統(tǒng)計結(jié)果不能以點概面，但近幾年其他文獻報道的數(shù)據(jù)顯示[1,2]，唐氏綜合征血清學初篩的陽性預測值皆為1%左右，可見孕中期血清學二聯(lián)篩查的陽性結(jié)果可信度較低。單純將血清學篩查高風險作為侵入性產(chǎn)前診斷的指征，勢必會造成大量的不必要的有創(chuàng)產(chǎn)前檢查，為后續(xù)侵入性產(chǎn)前診斷帶來了較大的臨床壓力和實驗室壓力。

超聲篩查也是染色體非整倍體產(chǎn)前篩查的重要一部分。超聲篩查安全、直觀，產(chǎn)前超聲4級針對性篩查提供了檢出染色體非整倍體的機會，可以檢出大量的染色體核型異常胎兒，而未明顯增加侵入性檢查率，其結(jié)果大大降低了正常胎兒的丟失率，因此在孕早、中期對胎兒染色體異常的診斷具有較高的參考價值。但是40%的胎兒染色體異常沒有超聲的異常表現(xiàn)，不能通過超聲診斷，而且胎兒體位、孕婦腹壁厚度等，均對胎兒結(jié)構(gòu)的觀察有影響。單獨的超聲篩查可以篩查出一部分染色體異常，本研究中超聲篩查對染色體異常的檢出率為8.74%，且陽性與陰性對于染色體異常的篩查有統(tǒng)計學意義。但是超聲篩查的靈敏度僅為24%，漏診率達76%，陽性預測值為4.29%，因此將超聲篩查作為單一篩查方法臨床價值有限。單一的超聲軟指標異常不足以將染色體異常胎兒與正常胎兒進行區(qū)分，聯(lián)合血清學篩查或HTS檢測時意義更大。本研究結(jié)果顯示，與單純的超聲篩查相比，超聲篩查聯(lián)合血清學篩查或HTS檢測染色體非整倍體的靈敏度均明顯提高，差異有統(tǒng)計學意義。

傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷的指征是預產(chǎn)期年齡超過35歲，但是根據(jù)流行病學調(diào)查[3]，80%的唐氏綜合征患兒是由年齡小于35歲的低危人群娩出，因此在臨床工作中，我們不能忽視對低齡孕婦的產(chǎn)前篩查。對于低齡孕婦，血清學篩查對染色體非整倍體的檢出率為57.59%，HTS的檢出率為1.87%，HTS使97%的低齡孕婦避免了不必要的侵入性產(chǎn)前診斷操作，這與Chiu等[4]得出的可以避免98%孕婦進行有創(chuàng)操作的研究結(jié)果相似。本研究中，常規(guī)的血清學篩查檢測胎兒染色體非整倍體疾病的陽性預測值為1.56%，與以往的研究結(jié)果接近[5]。HTS檢測染色體非整倍體的陽性預測值為76.67%，說明其對于低齡孕婦胎兒染色體非整倍體的篩查效率遠高于前者，相差數(shù)十倍之多。而且在常規(guī)血清學篩查方法中，存在假陰性結(jié)果(35%)，相比而言，HTS篩查方法8%的假陰性率能夠很好地彌補前者漏診的不足[6]，并顯著提高產(chǎn)前胎兒染色體非整倍體疾病的篩查效率。

2012年，北京協(xié)和醫(yī)院完成的一項對低危人群進行游離胎兒DNA檢測的研究結(jié)果顯示，該技術(shù)對21、18、13號染色體非整倍體的檢測靈敏度100%，特異度99.94%，假陽性率0.12%[7]。此項研究更進一步驗證了HTS未來在中等風險及低風險孕婦人群中的應用。不謀而合的是，國外研究也表明HTS在中等風險人群中也具有類似的靈敏度和特異度[8]。這預示著隨著臨床數(shù)據(jù)的積累，未來HTS可以覆蓋到中等風險孕婦人群。

Pan等[9]對1例孕婦孕早期血清學篩查發(fā)現(xiàn)21-三體高風險，但孕12周行絨毛膜穿刺檢查胎兒核型正常；隨后抽取孕婦外周血進行HTS，結(jié)果顯示胎兒21-三體高危，出生后取胎盤驗證，發(fā)現(xiàn)胎盤為21-三體嵌合型。據(jù)文獻報道，孕婦本身存在染色體異常、患有腫瘤，或前期接受過異體輸血、移植手術(shù)、干細胞治療等引入外源DNA，均會影響檢測結(jié)果[10]。這說明HTS可能檢測出胎盤嵌合型或者其他與母親異常相關的未知情況，對于HTS檢出的陽性均需要侵入性檢查及核型分析最終確認。本研究中共有30例HTS檢測高風險，其中7例經(jīng)核型分析證實為假陽性，包括1例T13，1例T21，3例45,X，1例47,XXX，1例47,XYY。本研究對21-三體的檢測靈敏度與相關研究結(jié)果[11,12]相比略低，特別是結(jié)果處于臨界值的高風險樣本，經(jīng)核型分析確診幾乎均為正常染色體核型。原因可能是：HTS檢測的是游離至母血循環(huán)的胎盤絨毛組織細胞的胎兒DNA，如果存在胎盤鈣化、破損或發(fā)育不良等，就會導致DNA含量減少，無法排除母體遺傳背景干擾而影響檢測結(jié)果。而HTS對13-三體及性染色體異常檢測效能偏低，除了與本研究樣本量較小有關之外，還可能與染色體拷貝數(shù)變異相關[13,14]，說明其還需要通過進一步臨床驗證以積累新的測序數(shù)據(jù)，提高檢測效率。

本文通過回顧性研究證實了HTS的檢測效率優(yōu)于傳統(tǒng)的血清學篩查，但二者并不沖突，血清學篩查、超聲篩查結(jié)合HTS可以大大提高胎兒染色體非整倍體疾病的檢出率，從而降低有創(chuàng)產(chǎn)前診斷率。建議孕婦在孕中期可采用2種產(chǎn)前篩查方法相互結(jié)合的模式，同時在此基礎上可將HTS技術(shù)延伸至檢測各類染色體結(jié)構(gòu)異常，乃至胎兒染色體亞顯微異常等。隨著技術(shù)方法的發(fā)展和成熟，產(chǎn)前篩查體系將能最大程度惠及各類孕婦，降低染色體異常胎兒的出生率。

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編輯：劉鄧浩

ObjectiveTo discuss the detection efficiency of traditional serological screening,ultrasound screening and HTS in the prenatal testing of chromosome aneuploidy.Meanwhile,sensitivity,specificity and clinical feasibility of HTS and combined screening for fetal chromosomal aneuploid are evaluated.MethodThe subject collect information of 1612 cases who have HTS testing during 2013.01.01 and 2013.12.31.In this study,the gold standard is karyotype analysis.On the basis of informed consent,karyotype analysis was taken in pregnant women who had abnormal serological screening result,abnormal ultrasound screening or HTS positive.The remaining cases were followed up until after birth.ResultsFor the prenatal detection of fetal chromosomal aneuploidy in younger pregnant women,sensitivities of serological screening,ultrasound scanning and HTS respectively was 65% (13/20),24% (6/25) and 92% (23/25); specificities respectively was 42.52%(608/1430),91.50% (1442/1576) and 99.56%(1569/1576); meanwhile,positive predictive values respectively was 1.56% (13/835),4.29% (6/140) and 76.67% (23/30).Sensitivities of ultrasound combined with serological screening and ultrasound combined with HTS separately was 68% (17/25),96% (24/25); specificities separately was 40.55% (647/1576),91.24% (1438/1576); and positive predictive values separately was 1.78% (17/954),14.81% (24/162).ConclusionsThe sensitivity of HTS for T21,T18 is higher,while false positive rate is lower; meanwhile,HTS can detect 13,X,Y chromosome aneuploidy which currently serological screening cannot detect.Therefore,HTS used in the prenatal screening of fetal chromosomal aneuploidy is clinically feasible.Compared with serological screening and ultrasound screening,HTS has higher detection efficiency,with no gestational age and age limit; it can avoid unnecessary invasive prenatal diagnosis caused by high false positive.Meanwhile,compared with ultrasound combined with serological screening,the sensitivity of ultrasound combined with HTS is higher,while false positive rate is lower,which can relieve the pressure of prenatal diagnosis.

chromosomal aneuploidy；serological screening；ultrasound screening；high-throughput sequencing

10.13470/j.cnki.cjpd.2016.02.002

陜西省社發(fā)攻關項目(2015SF126)；西安交通大學第二附屬醫(yī)院院重大科研方向科研基金[YJ(ZDJH)201303]

鄔晉芳，E-mail：wjflmz@163.com

R714.55

A

2016-04-26)