張麗清，陳　霞，胡海超，張俊艇，官慧謙，劉慶坡（浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 臨安 311300）

miR3979在水稻砷耐受性中的作用

張麗清，陳霞，胡海超，張俊艇，官慧謙，劉慶坡
（浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 臨安 311300）

miR3979可能參與水稻Oryza sativa應(yīng)答亞砷酸鹽和過(guò)氧化氫脅迫，但其具體的生物學(xué)功能未知。以miR3979過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系（As21-2，As21-3）和野生型品種中花11為試材，系統(tǒng)研究了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)亞砷酸鹽的耐受性表現(xiàn)及其初步生理機(jī)制。結(jié)果表明：與野生型相比，miR3979過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)亞砷酸鹽更加敏感，其對(duì)砷的吸收與轉(zhuǎn)移能力明顯增強(qiáng)；轉(zhuǎn)基因植株在砷脅迫下，其根部脯氨酸、可溶性蛋白質(zhì)量濃度顯著升高，但各抗氧化酶活性卻受到明顯抑制，miR3979在亞砷酸鹽處理后的野生型和轉(zhuǎn)基因植株葉片中的表達(dá)譜截然不同。這些結(jié)果可為進(jìn)一步揭示由該基因介導(dǎo)的水稻對(duì)砷耐性改變的分子機(jī)制以及抗逆育種提供理論參考。圖9表2參39

作物遺傳育種；miR3979；水稻；砷；轉(zhuǎn)基因；生理機(jī)制

砷是人類Ⅰ級(jí)致癌物，為表土污染五大有害元素之一［1］，對(duì)動(dòng)植物具有強(qiáng)烈毒害作用。據(jù)報(bào)道，南亞和東南亞地區(qū)［2］是目前全球受砷毒害最為嚴(yán)重的地區(qū)之一。長(zhǎng)期以來(lái)，由于自然環(huán)境與氣候影響，以及采礦、含砷地下水灌溉等人類作業(yè)活動(dòng)加劇了土壤中砷的過(guò)量積累［3］。特別是近年來(lái)，隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的快速發(fā)展，環(huán)境質(zhì)量不斷下降，中國(guó)土壤尤其水稻田等耕地呈現(xiàn)砷污染區(qū)域和污染程度進(jìn)一步擴(kuò)大和惡化的態(tài)勢(shì)，嚴(yán)重影響到農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全。水稻Oryza sativa對(duì)砷的吸收與富集能力顯著大于小麥Triticum aestivum和玉米Zea mays等旱糧作物［4］，這使得水稻砷污染已成為以稻米為主食人群砷暴露為害的主要途徑之一。比如，在中國(guó)土壤砷污染嚴(yán)重的衡陽(yáng)、湘潭等地，水稻籽粒中砷含量明顯增高［5］。水稻對(duì)砷的吸收、積累和耐受性等存在顯著的基因型差異［6-9］。NORTON等［10］發(fā)現(xiàn)，300多個(gè)供試水稻基因型中，其籽粒砷濃度相差3～34倍，遺傳變異占總變異的40%～64%。另外發(fā)現(xiàn)，與耐砷基因型相比，砷敏感水稻往往在根部積累較少量的砷［11］。因此，若以不同砷耐性基因型為材料，研究植株對(duì)砷的積累、分布及耐受性等［12-13］，可揭示水稻對(duì)砷耐性差異的內(nèi)在生理與分子機(jī)制。miRNA是生物體內(nèi)源產(chǎn)生的一種長(zhǎng)度約20～24 nt的非編碼小核糖核酸（RNA），它們通過(guò)序列互補(bǔ)配對(duì)的方式在轉(zhuǎn)錄后或翻譯水平上調(diào)控靶基因的表達(dá)［14-15］。大量研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在生物體應(yīng)對(duì)外界環(huán)境因子脅迫中發(fā)揮著重要作用［15-18］。比如，水稻基因組中存在特異miRNA分別應(yīng)答鎘、過(guò)氧化氫、干旱和高溫等逆境脅迫［16，19-20］。砷作為重要的環(huán)境污染物之一，植物基因組亦編碼特異miRNA來(lái)調(diào)控其對(duì)該脅迫因子的適應(yīng)性。近年來(lái)，采用 miRNA芯片技術(shù)，SRIVASTAVA等［17］，PANDEY等［21］以及 SHARMA等［22］分別從芥菜 Brassica juncea和水稻幼苗中鑒定到69，46和280個(gè)亞砷酸鹽或砷酸鹽響應(yīng)特異表達(dá)的miRNA。另外，采用新一代高通量測(cè)序結(jié)合定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)，YU等［23］以及LIU等［20］分別發(fā)掘出36 和67個(gè)水稻亞砷酸鹽響應(yīng)相關(guān)的miRNA。但目前為止，鮮見有關(guān)miRNA在調(diào)控水稻砷脅迫應(yīng)答中的生物學(xué)功能方面的研究報(bào)道。miR3979是LI等［19］在研究水稻對(duì)過(guò)氧化氫脅迫應(yīng)答時(shí)鑒定到的一個(gè)新miRNA。隨后，LIU等［20］研究發(fā)現(xiàn)，在亞砷酸鹽脅迫下，miR3979在秈稻明恢86根系中被明顯抑制表達(dá)。除此之外，再未見到有關(guān)該miRNA的研究報(bào)道。從miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)（Release 21）的注釋可以看出，該miRNA可編碼2個(gè)成熟序列，即miR3979-5p和miR3979-3p，但其生物學(xué)功能未知，尤其是該miRNA是否參與調(diào)控水稻對(duì)亞砷酸鹽的應(yīng)答反應(yīng)等尚不清楚?；诖耍覀儷@得了miR3979的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株，擬在此基礎(chǔ)上探討miR3979與水稻砷耐性的關(guān)系，并試圖揭示由其介導(dǎo)的水稻應(yīng)答砷脅迫的初步生理機(jī)理。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與處理

本研究以粳稻品種中花11（野生型對(duì)照，WT），miR3979過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系（As21-2和As21-3），中國(guó)普通野生稻以及秈稻品種93-11和明恢86為試材。首先分別挑選各供試材料飽滿種子，用質(zhì)量濃度為5 g·L-1次氯酸鈉消毒15 min，然后用蒸餾水沖洗3～5次，最后在蒸餾水中浸泡過(guò)夜。將浸泡后的種子轉(zhuǎn)移到鋪有濾紙的發(fā)芽盒里，加入質(zhì)量濃度為5.0 g·L-1氯化鈣溶液催芽5～7 d。待幼苗長(zhǎng)至約4 cm時(shí)，將其轉(zhuǎn)移至含有營(yíng)養(yǎng)液的盆缽中繼續(xù)培養(yǎng)，期間每3 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液（配方如下：0.274 mmol·L－1硫酸鎂，0.091 mmol·L－1硝酸鉀，0.5 μmol·L－1氯化錳，0.100 mmol·L－1磷酸二氫鉀，0.4 μmol·L－1硫酸鋅，0.183 mmol·L－1硫酸銨，0.2 μmol·L－1硫酸銅，3.0 μmol·L－1硼酸，0.1 μmol·L－1鉬酸銨，0.183 mmol·L－1硝酸鈣，40.0 μmol·L－1乙二胺四乙酸鐵（Ⅲ）鈉［NaFe（Ⅲ）-EDTA］，2.000 mmol·L－12-嗎啉磺酸（MES），并用氫氧化鈉將pH值調(diào)至pH 5.5）。整個(gè)過(guò)程都在培養(yǎng)箱中進(jìn)行，條件為16 h光照/8 h黑暗。

實(shí)驗(yàn)采取隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。設(shè)對(duì)照和亞砷酸鈉（As）脅迫2種處理，3次重復(fù)。待苗齡21 d時(shí)，將幼苗分別轉(zhuǎn)移到3 L的小培養(yǎng)桶中，8株·桶-1，利用25.0 μmol·L－1亞砷酸鈉進(jìn)行脅迫處理。在處理的第3天和第6天時(shí)分別對(duì)根系和葉片取樣，鮮樣保存在－80℃冰箱中備用，其余樣品在烘箱中105℃殺青30 min，然后在75℃下處理48 h以充分干燥后使用。

1.2轉(zhuǎn)基因植株的獲得及陽(yáng)性檢測(cè)

利用正向引物5′-AAA GAG CTC AGT CAT TCC ACT CCA TGT GCT TTG-3′和反向引物5′-AAA GGA TCC TGT TGC TTA ACT CCA GTA GCC ATG-3′，從中花11基因組中擴(kuò)增出約310 bp的包含miR3979前體序列的DNA片段。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SacⅠ和BamHⅠ雙酶切后，連接至pCAMBIA1300載體上，然后分別采用熱激法和電擊法轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Escherichia coli和農(nóng)桿菌Agrobacterium EHA105。最后，將目標(biāo)基因經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染中花11愈傷組織，并經(jīng)卡那霉素抗性篩選后獲得轉(zhuǎn)基因植株。采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取水稻基因組DNA。分別采用載體通用引物及miR3979基因特異引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增，篩選出陽(yáng)性T2代轉(zhuǎn)基因植株用于后續(xù)研究。PCR反應(yīng)體系為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性1 min，55℃退火45 s，72℃延伸80 s，30個(gè)循環(huán)，72℃總延伸10 min。

1.3實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real time RT-PCR）分析

采用RNAiso for small RNA Kit（TaKaRa）提取水稻小RNA。參照PrimeScript miRNA RT-PCR Kit （TaKaRa）使用說(shuō)明，以U6為內(nèi)參，在Mastercycler ep realplex system （Eppendorf）上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RTPCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系包括5.0 μL cDNA，5.0 μL引物（表1），10.0 μL的2×SYBR混合物。PCR擴(kuò)增條件為：先95℃預(yù)變性1 min，然后95℃變性15 s，60℃復(fù)性30 s，40個(gè)循環(huán)。重復(fù)3次·試驗(yàn)-1。采用2-△△CT法估測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1　miR3979實(shí)時(shí)定量RT-PCR的引物名稱及序列Table 1　Real-time RT-PCR primer sequences for miR3979-5p and miR3979-3p

1.4砷質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

將砷脅迫后的幼苗放在解吸液中處理10 min后，將根系和莖干分別取樣。待充分烘干后，用研磨機(jī)將樣品研磨成粉末。取0.3 g樣品，加入2.0 mL硝酸和0.5 mL過(guò)氧化氫，于120℃條件下硝化24 h。待冷卻后，加入去離子水至20.0 mL。最后，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS，Agilent 7500a）對(duì)樣品中的總砷質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定。水稻根系對(duì)砷的吸收能力是衡量各基因型對(duì)砷吸收能力的常用指標(biāo)，常用根系和莖干中砷的總吸收量與根系干質(zhì)量的比值表示。 SAU=（Troot-As×Rbiomass+Tshoot-As×Sbiomass）/Rbiomass。在公式中，SAU表示水稻根系對(duì)砷的吸收能力。Troot-As和Tshoot-As分別代表根系和莖干中砷的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)。Rbiomass和Sbiomass分別代表根系和莖干的干質(zhì)量。另外，采用轉(zhuǎn)移速率（TF）來(lái)評(píng)估砷從根系轉(zhuǎn)移到莖干的能力，用莖干與根系中砷的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)比值來(lái)表示。

1.5生理指標(biāo)測(cè)定

1.5.1脯氨酸質(zhì)量濃度的測(cè)定采用茚三酮染色法［24］測(cè)定處理6 d時(shí)各材料中游離脯氨酸質(zhì)量濃度。使用分光光度計(jì)測(cè)定萃取液在520 nm處吸光值。使用10.0 mg·L-1的脯氨酸溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)染色法，對(duì)處理3和6 d時(shí)各材料根系和葉片中的可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度進(jìn)行測(cè)定。記錄595 nm處吸光值。使用100 mg·L-1的牛血清蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.3抗氧化酶活性測(cè)定稱取處理3和6 d的根系及葉片各0.2 g，與3.0 mL 50.00 mmol·L-1磷酸鈉緩沖液（pH 7.8，包含0.20 mmol·L-1乙二胺四乙酸EDTA）和質(zhì)量濃度2.0 g·L-1的聚乙烯砒咯烷酮（PVP）混合后，冰浴條件下研磨成勻漿。然后，在4℃下12 000 r·min-1離心20 min。取上清液以用于抗氧化酶活性的測(cè)定。超氧化物歧化酶（SOD），過(guò)氧化氫酶（CAT）以及過(guò)氧化物酶（POD）的活性測(cè)定分別參照GIANNOPOTITIS和RIES［25］，CAKMAK和MARSCHNER［26］以及PüTTER［27］等方法?？箟难徇^(guò)氧化物酶（APX）活性的測(cè)定則根據(jù)抗壞血酸的氧化率來(lái)進(jìn)行估計(jì)［28］。

1.6統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均為3次實(shí)驗(yàn)重復(fù)的平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)誤。采用最小顯著性差數(shù)法（LSD）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，在5%水平上分析不同指標(biāo)間的差異顯著水平（SPSS 19.0）。

2　結(jié)果與分析

2.1不同砷耐性水稻基因型中miR3979的表達(dá)分析

HU等［29］曾系統(tǒng)比較了3種不同基因型水稻對(duì)亞砷酸鹽的耐受性，發(fā)現(xiàn)中國(guó)普通野生稻對(duì)亞砷酸鹽的耐受性最強(qiáng)，其次為93-11和明恢86。為初步明確miR3979與水稻砷耐受性的關(guān)系，分析了它在上述3個(gè)不同砷耐性水稻基因型中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在亞砷酸鹽處理后，miR3979在3個(gè)水稻基因型根部的表達(dá)均受到抑制，但受抑制程度明顯不同（分別下降了8.89，11.66和1 198.36倍，圖1 A），暗示隨著水稻對(duì)亞砷酸鹽耐受程度的增強(qiáng)，miR3979相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)整體下降態(tài)勢(shì)。此外，我們分析了miR3979在明恢86根系、莖干和葉片等不同組織中的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)，在受到亞砷酸鹽脅迫后，miR3979在其根部高度富集，其表達(dá)豐度是莖干和葉片的254.63和1 057.84倍，而在莖部的相對(duì)表達(dá)量又顯著高于葉片（4.15倍，圖1 B）。這些結(jié)果表明：該miR3979在水稻應(yīng)答亞砷酸鹽脅迫過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

圖1　miR3979在不同基因型水稻（A）以及在明恢86不同組織（B）中的表達(dá)量Figure 1　Expression profiling of miR3979 in different rice genotypes（A）and in different tissues of Minghui 86（B）

2.2陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得了miR3979過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)化中花11的轉(zhuǎn)基因植株。采用 pCAMBIA1300載體通用引物對(duì)T2代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測(cè)（圖2）。對(duì)8個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，400個(gè)過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中，352株為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為88%。

圖2　部分轉(zhuǎn)基因水稻的PCR檢測(cè)Figure 2　PCR analysis of the transgenic rice plants carrying overexpressed miR3979

2.3轉(zhuǎn)基因株系中miR3979的表達(dá)分析

采用miR3979特異引物，分析了miR3979-5p和-3p在各轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)情況。我們發(fā)現(xiàn)，在正常生長(zhǎng)條件下，與野生型中花11相比，各轉(zhuǎn)基因株系葉片中，miR3979-5p的表達(dá)水平都顯著升高；miR3979-3p的表達(dá)水平也明顯增加但增幅不及miR3979-5p（圖3）。值得注意的是，在株系A(chǔ)s21-2和As21-3中，miR3979-5p和miR3979-3p的表達(dá)水平與中花11相比都呈現(xiàn)顯著上調(diào)。基于此，我們選擇這2個(gè)株系開展后續(xù)研究。

2.4轉(zhuǎn)基因水稻的砷耐受性分析

在正常田間試驗(yàn)條件下，各轉(zhuǎn)基因株系（As21-2和As21-3）的21 d齡幼苗與中花11并無(wú)明顯表型差異，但是在25.0 μ mol·L－1亞砷酸鈉處理6 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株幼苗表現(xiàn)出典型的砷中毒癥狀，即大部分葉片卷曲、萎蔫、黃化，而中花11在砷脅迫下卻無(wú)明顯葉片卷曲等現(xiàn)象（圖4），表明miR3979被過(guò)表達(dá)后增加了水稻對(duì)亞砷酸鹽的敏感程度。

2.5轉(zhuǎn)基因水稻砷吸收與轉(zhuǎn)移能力分析

圖3　miR3979（-5p和-3p）在各轉(zhuǎn)基因株系葉片中的表達(dá)量Figure 3　Expression analysis of miR3979（-5p and-3p）in the leaves of different transgenic lines

圖4　亞砷酸鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因株系及野生型中花11的表型對(duì)比Figure 4　Phenotypes of Zhonghua 11 and Ubi：MIR3979 transgenic plants under arsenite stress

圖5　中花11和轉(zhuǎn)基因植株對(duì)砷的吸收能力（A）和轉(zhuǎn)移速率（B）的比較Figure 5　Specific arsenic uptake（SAU；A）and As translocation factor（TF；B）of Zhonghua 11 and transgenic rice plants

表2　各供試植株根系和莖干中的總砷質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 2　Comparison of total arsenic concentration in the root and stem of each tested rice genotypes

從表2可以看出：經(jīng)亞砷酸鹽處理后，各轉(zhuǎn)基因株系（As21-2和As21-3）根系和莖干中砷的積累量顯著高于中花11植株。與中花11相比，轉(zhuǎn)基因植株根系中砷的積累量分別上升了403.0%和147.3%。如圖5所示，miR3979過(guò)表達(dá)株系對(duì)砷的吸收能力顯著高于中花11。但轉(zhuǎn)基因植株砷的轉(zhuǎn)移速率與中花11相比有較大不同，其中As21-2向地上部分的轉(zhuǎn)移速率低于中花11，而As21-3株系卻顯著高于中花11。這一現(xiàn)象需在其他轉(zhuǎn)基因株系中進(jìn)行驗(yàn)證。

2.6亞砷酸鹽對(duì)供試材料各生理指標(biāo)的影響

2.6.1對(duì)脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響在亞砷酸鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株根系和葉片以及中花11對(duì)照葉片中的脯氨酸質(zhì)量濃度顯著增加（圖6A和圖6B），但中花11根系中的脯氨酸質(zhì)量濃度卻呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在根系中，脅迫處理后轉(zhuǎn)基因植株中的脯氨酸質(zhì)量濃度上升趨勢(shì)顯著高于中花11植株，而在葉片中，各材料中的脯氨酸質(zhì)量濃度也顯著增加，但中花11植株中的質(zhì)量濃度明顯高于轉(zhuǎn)基因植株（圖6 B）。

圖6　砷脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因植株及野生型中花11脯氨酸質(zhì)量濃度的影響Figure 6　Effect of arsenic stress on proline content of Zhonghua 11 and transgenic rice plants

2.6.2對(duì)可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的影響在25.0 μmol·L－1亞砷酸鹽處理下，各供試材料根系中的可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度顯著性下降（圖7A）。在處理第6天時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系根系中可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度顯著顯著高于中花11。在處理3和6 d時(shí)，各轉(zhuǎn)基因植株葉片中的可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度顯著高于中花11植株。值得注意的是，在砷處理3 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因材料中葉片中的可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度明顯升高，而中花11植株中的質(zhì)量濃度卻顯著性降低（圖7B）。

圖7　亞砷酸鹽對(duì)轉(zhuǎn)基因植株及野生型中花11根系（A）和葉片（B）中可溶性蛋白質(zhì)的影響Figure 7　Effect of arsenite stress on soluble protein content of transgenic plants and Zhonghua 11 rice in roots（A）and leaves（B）

2.6.3對(duì)抗氧化酶活性的影響處理第3天時(shí)，中花11植株根系中的SOD活性顯著增加，且其活性明顯高于轉(zhuǎn)基因植株；但在轉(zhuǎn)基因植株中卻呈現(xiàn)相反趨勢(shì)。到處理第6天時(shí)，各材料中SOD的活性均顯著性升高（圖8A）。在葉片中，砷處理的第3天，各材料中的SOD的活性均顯著性下降，但中花11材料中的SOD活性明顯高于轉(zhuǎn)基因植株。至處理6天時(shí)，中花11中SOD活性顯著性增強(qiáng)，而在轉(zhuǎn)基因植株中的活性卻顯著性減弱。砷脅迫第3天時(shí)，各供試材料根系中POD活性顯著性降低，且轉(zhuǎn)基因材料中的POD活性明顯高于中花11植株；處理了6 d后，中花11植株中的POD活性有升高趨勢(shì)，而在轉(zhuǎn)基因植株中的表現(xiàn)依舊顯著降低，且明顯低于中花11（圖8C）。在亞砷酸鹽處理3 d時(shí)，各供試材料葉片中的POD活性顯著性升高，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)（第6天時(shí)），中花11和As21-3的POD活性依舊呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，但在As21-2中卻開始降低。在砷脅迫下，各供試材料根系中APX酶的活性一直受到抑制。在處理第3天，轉(zhuǎn)基因植株的APX的活性顯著高于中花11植株，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其間的差距逐漸減弱（圖8E）。在葉片中，轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)砷處理后，APX的活性顯著性增強(qiáng)，而中花11植株卻受到強(qiáng)烈抑制。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，As21-2與中花11植株的APX的活性明顯升高，而在As21-3中活性卻受到抑制（圖8F）。另外，我們發(fā)現(xiàn)，在處理第3天時(shí)，各供試材料根系中的CAT活性顯著升高，但隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其活性又被明顯抑制，然而轉(zhuǎn)基因材料中的CAT的活性卻明顯高于中花11植株（圖8G）。在葉片中，砷脅迫后轉(zhuǎn)基因材料中的CAT活性明顯高于中花11植株（圖8H）。經(jīng)砷處理3 d后，各供試材料中CAT活性均有所升高，處理6 d后，As21-3中的CAT的活性依舊顯著升高，而其他材料中CAT活性卻受到明顯抑制。

圖8　亞砷酸鹽脅迫（3和6 d）下轉(zhuǎn)基因植株及野生型中花11根系和葉片中的抗氧化酶活性變化Figure 8　Effect of arsenite stress on the activity of antioxidant enzymes SOD，POD，APX，and CAT activity in the roots and leaves of Zhonghua 11 and transgenic rice plants

2.7miR3979在亞砷酸鹽脅迫不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)分析

如圖9所示：在亞砷酸鹽處理的不同時(shí)間點(diǎn)（0，6和72 h），miR3979在各供試材料葉片中的表達(dá)模式存在一定差異：miR3979-5p在中花11中的表達(dá)量一直呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)；而在2個(gè)過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)量顯著高于中花11，且在砷脅迫6 h時(shí)表達(dá)量最高，但隨著處理時(shí)間的增加（72 h），其表達(dá)量開始下降，因而呈現(xiàn)出先上升后逐漸降低的表達(dá)趨勢(shì)；而miR3979-3p的表達(dá)模式與miR3979-5p正好相反：在砷脅迫處理6 h時(shí)，其在中花11葉片中的表達(dá)量開始上調(diào)，隨后表達(dá)受到明顯抑制，而在轉(zhuǎn)基因材料中一直處于被抑制狀態(tài)（圖9）。

3　討論

近年來(lái)，有關(guān)水稻對(duì)砷吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、積累及代謝相關(guān)重要功能基因的鑒定與作用機(jī)制研究等方面取得了重要進(jìn)展［30］，但有關(guān)水稻砷耐受性相關(guān)基因的鑒定及其應(yīng)答砷脅迫分子機(jī)制等方面進(jìn)展緩慢。目前，僅有少數(shù)蛋白編碼基因被發(fā)現(xiàn)或與水稻的砷耐受性有關(guān)［31-32］，而鮮見miRNA與水稻砷耐受性關(guān)聯(lián)方面的研究報(bào)道。另外，雖然越來(lái)越多的證據(jù)表明，miRNA應(yīng)參與了水稻對(duì)砷脅迫響應(yīng)與應(yīng)答過(guò)程［17，20-23］，但它們?cè)谡{(diào)控水稻砷耐性方面的生物學(xué)功能尚有待深入研究?；诖耍狙芯坎捎眠^(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因策略初次證明，miR3979應(yīng)在調(diào)控水稻砷耐性過(guò)程中起著重要作用，但是它究竟如何與其靶基因互作進(jìn)而參與調(diào)節(jié)水稻植株對(duì)砷脅迫做出應(yīng)答反應(yīng)的機(jī)理等尚有待進(jìn)一步深入探究。

圖9　砷處理不同時(shí)間（0，6和72 h），miR3979（-5p和-3p）在中花11和轉(zhuǎn)基因植株葉中的表達(dá)水平Figure 9　Temporal expression profiles of miR3979-5p and-3p in leaves of As（Ⅲ）-treated Zhonghua 11 and transgenic rice plants

盡管近幾年多個(gè)研究組對(duì)水稻應(yīng)答亞砷酸鹽或砷酸鹽相關(guān)miRNA進(jìn)行了初步探索，但是經(jīng)比較分析發(fā)現(xiàn)，各研究之間鑒定到的共有的差異表達(dá)miRNA的數(shù)量卻相對(duì)較少［17，20-23］。比如，LIU等［20］將miR3979鑒定為亞砷酸鹽脅迫特異表達(dá)miRNA，但在其他研究中卻未見報(bào)道［21-23］。經(jīng)檢索miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)［33］及序列同源性搜索發(fā)現(xiàn)，miR3979應(yīng)為水稻特有的，它在水稻應(yīng)答亞砷酸鹽［20］和過(guò)氧化氫脅迫［19］過(guò)程中起作用。因此，各研究組的結(jié)果差異主要可歸結(jié)為他們所采用的供試水稻基因型、砷脅迫供體（亞砷酸鹽和砷酸鹽）、脅迫處理時(shí)間以及所采用的研究策略（miRNA芯片［17，21-22］和高通量測(cè)序［20，23］）等不同所致。尤其是，與miRNA芯片相比［34］，高通量測(cè)序不僅可鑒定到表達(dá)豐度較低的miRNA，更可發(fā)掘出一些新的、砷脅迫特異應(yīng)答相關(guān)的miRNA［20，35］。這可為水稻抗逆育種提供新的靶基因資源。

研究發(fā)現(xiàn)：不同基因型水稻對(duì)砷的耐受性差異明顯［8-9，29］?；诖?，以耐砷和砷敏感基因型為試材，一些研究組對(duì)水稻砷耐性差異的內(nèi)在機(jī)制進(jìn)行了初步探索［11，23，36］。比如，TRIPATHI等［36］發(fā)現(xiàn)，與IET-4786（砷敏感）相比，耐砷品種 ‘Triguna'在砷脅迫下，一些脅迫響應(yīng)氨基酸包括脯氨酸以及植物螯合肽和硫醇類物質(zhì)的含量大幅增加。本研究發(fā)現(xiàn)：miR3979過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株比野生型中花11對(duì)砷脅迫反應(yīng)更敏感，但其根系和葉片中卻積累了更多的脯氨酸，這與前人的報(bào)道［36］不一致。已知，脯氨酸是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，它的積累有著對(duì)逆境適應(yīng)的意義［37］。但是越來(lái)越多的證據(jù)表明，脯氨酸的積累僅僅是植物對(duì)逆境脅迫的一種生理響應(yīng)，并無(wú)明顯保護(hù)作用［38］。因此，miR3979過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株脯氨酸含量顯著升高或許是其應(yīng)對(duì)砷脅迫的一種應(yīng)激性反應(yīng)。

與動(dòng)物相比，植物更容易遭受外界逆境因子脅迫。因此，在進(jìn)化過(guò)程中，植物衍生出通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA及抗氧化酶系活性等機(jī)制以耐受或適應(yīng)外界脅迫［39］。在本研究中，miR3979過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)砷的耐受性顯著下降，但砷吸收與轉(zhuǎn)移能力上升。這除了可能觸發(fā)基因組中與水稻砷吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)以及耐性相關(guān)基因［30-32］表達(dá)譜的改變外，極有可能引發(fā)了其他miRNA包括一些靶基因?yàn)镾OD，APX或CAT酶的miRNA表達(dá)水平的變化。TRIPATHI等［36］發(fā)現(xiàn)：與砷敏感品種IET-4786相比，耐砷水稻Triguna在砷脅迫下其植株內(nèi)SOD等抗氧化酶活性被明顯上調(diào)，這與本研究的結(jié)論一致。miR3979被過(guò)表達(dá)后導(dǎo)致抗氧化酶活性顯著降低，致使植株內(nèi)產(chǎn)生嚴(yán)重過(guò)氧化脅迫而導(dǎo)致膜通透性增大并伴隨大分子物質(zhì)損失［36］，進(jìn)而造成了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)砷的耐受性改變。

［1］JOHNSON B L，DEROSA C T.Chemical mixtures released from hazardous waste sites：Implications for health risk assessment［J］.Toxicology，1995，105（2/3）：145－156.

［2］BRAMMER H，RAVENSCROFT P.Arsenic in groundwater：a threat to sustainable agriculture in South and South-East Asia［J］.Environ Int，2009，35（3）：647-654.

［3］ZHAO Fangjie，MA J F，MEHARG A A，et al.Arsenic uptake and metabolism in plants［J］.New Phytol，2009，181 （4）：777-794.

［4］SU Yuhong，McGRATH S P，ZHAO Fangjie.Rice is more efficient in arsenite uptake and translocation than wheat and barley［J］.Plant Soil，2010，328（1）：27-34.

［5］雷鳴，曾敏，王利紅，等.湖南市場(chǎng)和污染區(qū)稻米中As，Pb，Cd污染及其健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)［J］.環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30（11）：2314-2320. LEI Ming，ZENG Min，WANG Lihong，et al.Arsenic lead and cadimium pollution in rice from Hunan markets and contaminated areas and their health risk assessment［J］.Acta Sci Circumst，2010，30（11）：2314-2320.

［6］MEHARG A A，LOMBI E，WILLIAMS P N，et al.Speciation and localization of arsenic in white and brown rice grains ［J］.Environ Sci Technol，2008，42（4）：1051-1057.

［7］LIANG Feng，LI Yulan，ZHANG Guilin，et al.Total and speciated arsenic levels in rice from China［J］.Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Exp Risk Ass，2010，27（6）：810-816.

［8］董飛，盧瑛，王興祥，等.華南地區(qū)不同品系水稻積累砷特征及其影響因素［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2011，30 （2）：214-219. DONG Fei，LU Ying，WANG Xingxiang，et al.Characteristics of arsenic accumulation in different rice（Oryza sativa L.）cultivars and its influencing factors in southern China［J］.J Agro-enviroment Sci，2011，30（2）：214-219.

［9］王林友，竺朝娜，王建軍，等.水稻鎘、鉛、砷低含量基因型的篩選［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，24（1）：133-138. WANG Linyou，ZHU Channa，WANG Jianjun，et al.Screening for rice（Oryza sativa L.）genotyeps with Cd Pb and As contents［J］.Acta Agric Zhejiang，2012，24（1）：133-138.

［10］NORTON G J，PINSON S R M，ALEXANDER J，et al.Variation in grain arsenic assessed in a diverse panel of rice （Oryza sativa）grown in multiple sites［J］.New Phytol，2012，193（3）：650-664.

［11］RAI A，TRIPATHI P，DWIVEDI S，et al.Arsenic tolerances in rice（Oryza sativa）have a predominant role in transcriptional regulation of a set of genes including sulphur assimilation pathway and antioxidant system ［J］.Chemosphere，2011，82（7）：986-995.

［12］TRIPATHI R D，SRIVASTAVA S，MISHRA S，et al.Arsenic hazards：strategies for tolerance and remediation by plants［J］.Trends Biotechnol，2007，25（4）：158-165.

［13］BHATTACHARYA P，WELCH A H，STOLLENWERK K G，et al.Arsenic in the environment：Biology and chemistry ［J］.Sci Total Environ，2007，379（2/3）：109-120.

［14］IWAKAWA H O，TOMARI Y.Molecular insights into microRNA-mediated translational repression in plants［J］.Mol Cell，2013，52（4）：591-601.

［15］BARTEL D P.MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function［J］.Cell，2004，116（2）：281-297.

［16］GUPTA O P，SHARMA P，GUPTA R K，et al.MicroRNA mediated regulation of metal toxicity in plants：present status and future perspectives［J］.Plant Mol Biol，2014，84（1/2）：1-18.

［17］SRIVASTAVA S，SRIVASTAVA A K，SUPRASANNA P，et al.Identification and profiling of arsenic stress-induced microRNAs in Brassica juncea［J］.J Exp Bot，2013，64（1）：303-315.

［18］CAMPO S，PERIS-PERIS C，SIRé C，et al.Identification of a novel microRNA（miRNA）from rice that targets an alternatively spliced transcript of the Nramp6（Natural resistance-associated macrophage protein 6）gene involved in pathogen resistance［J］.New Phytol，2013，199（1）：212-227.

［19］LI Ting，LI Hui，ZHANG Yunxiao，et al.Identification and analysis of seven H2O2-responsive miRNAs and 32 new miRNAs in the seedlings of rice（Oryza sativa L.ssp.indica）［J］.Nucl Acid Res，2011，39（7）：2821-2833.

［20］LIU Q，ZHANG H.Molecular identification and analysis of arsenite stress-responsive miRNAs in rice［J］.J Agric Food Chem，2012，60（26）：6524-6536.

［21］PANDEY C，RAGHURAM B，SINHA A K，et al.miRNA plays a role in the antagonistic effect of selenium on arsenic stress in rice seedlings［J］.Met Int Biom Sci，2015，7（5）：857-866.

［22］SHARMA D，TIWARI M，LAKHWANI D，et al.Differential expression of microRNAs by arsenate and arsenite stress in natural accessions of rice［J］.Metallomics，2015，7（1）：174-187.

［23］YU Lujun，LUO Yingfeng，LIAO Bin，et al.Comparative transcriptome analysis of transporters，phytohormone and lipid metabolism pathways in response to arsenic stress in rice（Oryza sativa）［J］.New Phytol，2012，195（1）：97-112.

［24］張殿忠，汪沛洪，趙會(huì)賢.測(cè)定小麥葉片游離脯氨酸含量的方法［J］.植物生理學(xué)通訊，1990（4）：62-65. ZHANG Dianzhong，WANG Peihong，ZHAO Huixian.Determination of the content of free proline in wheat leaves ［J］.Plant Physiol Commu，1990（4）：62-65.

［25］GIANNOPOTITIS C N，RIES S K.Superoxide dismutase（Ⅰ）occurrence in higher plants［J］.Plant Physiol，1977，59（2）：309-314.

［26］CAKMAK I，MARSCHNER H.Magnesium deficiency and high light intensity enhance activities of superoxide dismutase，ascorbate peroxidase，and glutathione reductase in bean leaves［J］.Plant Physiol，1992，98（4）：1222-1227.

［27］PüTTER J.Peroxidases［G］//BERGRNEYER H U.Methods of Enzymatic Analysis.New York：Academic Press，1974：685-690.

［28］NAKANO Y，ASADA K.Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinach chloroplasts ［J］.Plant Cell Physiol，1981，22（5）：867-880.

［29］HU Haicao，ZHANG Junting，WANG Hong，et al.Effect of silicate supplementation on the alleviation of arsenite toxicity in 93-11（Oryza sativa L.indica）［J］.Environ Sci Pollut Res，2013，20（12）：8579-8589.

［30］KUMAR S，DUBEY R S，TRIPATHI R D，et al.Omics and biotechnology of arsenic stress and detoxification in plants：current updates and prospective［J］.Environ Int，2015，74（74）：221-230.

［31］MOSA K A，KUMAR K，CHHIKARA S，et al.Members of rice plasma membrane intrinsic proteins subfamily are involved in arsenite permeability and tolerance in plants［J］.Transgenic Res，2012，21（6）：1265-1277.

［32］TIWARI M，SHARMA D，DWIVEDI S，et al.Expression in Arabidopsis and cellular localization reveal involvement of rice NRAMP，OsNRAMP1，in arsenic transport and tolerance［J］.Plant Cell Environ，2014，37（1）：140-152.

［33］KOZOMARA A，GRIFFITHS-JONES S.miRBase：annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data ［J］.Nucleic Acid Res，2014，42：D68-D73.

［34］GIT A，DVINGE H，SALMON-DIVON M，et al.Systematic comparison of microarray profiling，real-time PCR，and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression［J］.RNA，2010，16（5）：991 -1006.

［35］LIU Qingpo.Noverl miRNAs in the control of arsenite levels in rice［J］.Funct Integr Genom，2012，12（4）：649-658.

［36］TRIPATHI P，TRIPATHI R D，SINGH R P，et al.Arsenite tolerance in rice（Oryza sativa L.）involves coordinated role of metabolic pathways of thiols and amino acids［J］.Environ Sci Pollut Res，2013，20（2）：884-896.

［37］彭志紅，彭克勤，胡家金，等.滲透脅迫下植物脯氨酸積累的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2002，18（4）：80-83. PENG Zhihong，PENG Keqin，HU Jiajin，et al.Research progress on accumulation of proline under osmotic stress in plants［J］.Chin Agric Sci Bull，2002，18（4）：80-83.

［38］LIU Jiping，ZHU Jiankang.Proline accumulation and salt-stress-induced gene expression in a salt-hypersensitive mutant of Arabidopsis［J］.Plant Physiol，1997，114（2）：591-596.

［39］SRIVASTAVA M，MA L Q，RATHINASABAPATHI B，et al.Effects of selenium on arsenic uptake in arsenic hyperaccumulator Pteris vittata L.［J］.Bioresour Technol，2009，100（3）：1115-1121.

miR3979-mediated arsenite tolerance in rice

ZHANG Liqing，CHEN Xia，HU Haichao，ZHANG Junting，GUAN Huiqian，LIU Qingpo
（School of Agriculture and Food Science，Zhejiang A&F University，Lin'an 311300，Zhejiang，China）

It was reported that miR3979 might be involved in the responses to arsenite and hydrogen peroxide stresses in rice，but its biological function remains unclear.In this study，using transgenic plants overexpressing miR3979 As21-2 and As21-3，and wild-type（WT）Zhonghua 11 as materials，we investigated its physiological functions in response to arsenite stress in rice.The results showed that，compared with WT，transgenic plants were more sensitive to arsenite，which has a greater arsenic absorption and translocation.Under arsenite stress，the proline and soluble protein contents were significantly increased，while the activity of most of the antioxidant enzymes SOD，POD，APX，and CAT was inhibited extensively in roots of transgenic plants.Furthermore，it was found that miR3979 exhibited distinct gene expression profiles in leaves of WT and transgenic plants after exposure to arsenite.These results may be very significative for further investigation the molecular mechanisms of miR3979-mediated arsenic tolerance in rice，and also providing some useful clues for rice stress resistance breeding.［Ch，9 fig.2 tab.39 ref.］

crop genetic and breeding；miR3979；rice；arsenite；transgenic；physiological mechanism

S332

A

2095-0756（2016）04-0571-10

10.11833/j.issn.2095-0756.2016.04.004

2015-07-24；

2015-09-29

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31471431）；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LY14B070015）；浙江農(nóng)林大學(xué) “青年拔尖人才”基金資助項(xiàng)目；浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃（新苗人才計(jì)劃）項(xiàng)目（2014R412001）

張麗清，從事作物逆境分子生物學(xué)研究。E-mail：21854739@qq.com。通信作者：劉慶坡，教授，博士，從事生物信息與作物逆境基因組學(xué)研究。E-mail：liuqp@zafu.edu.cn