豬流行性腹瀉病毒SC-2014株的分離鑒定及繁殖條件的優(yōu)化

王 飛，陳小芬，焦臣鵬，蘇丹萍，宋亞兵，陳瑞愛，2，賀東生，2

（1.華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院 ，廣東　廣州　510642；2.廣東溫氏大華農生物科技有限公司，廣東　新興　527400）

豬流行性腹瀉病毒SC-2014株的分離鑒定及繁殖條件的優(yōu)化

王 飛1，陳小芬1，焦臣鵬1，蘇丹萍1，宋亞兵1，陳瑞愛1，2，賀東生1，2

（1.華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院 ，廣東廣州510642；2.廣東溫氏大華農生物科技有限公司，廣東新興527400）

從四川省某豬場疑似病毒性腹瀉的發(fā)病豬采集部分小腸內容物樣品，應用RT-PCR檢測得到該病料呈PEDV陽性，命名為SC-2014株，將其在Vero細胞上進行連續(xù)盲傳，傳至第8代觀察到CPE，傳至30代基本能夠在Vero細胞上穩(wěn)定增殖。并通過分別不同胰酶濃度、不同吸附時間、不同PAPN濃度到培養(yǎng)體系中，將分離的病毒繼續(xù)繁殖8代，然后分別測定不同條件下病毒的TCID50，結果表明：在胰酶濃度為15 μg/mL，吸附時間為1.5 h，添加的PAPN濃度為5 μg/mL時，PEDV SC-2014株的病毒滴度為10-5.22，達到最大值，使PEDV SC-2014株的繁殖條件得到一定程度的優(yōu)化。

豬流行性腹瀉；病毒分離；繁殖條件

流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）由豬流行性腹瀉病毒引起的高度接觸性腸道傳染病，臨床上以腹瀉，脫水，嘔吐和對哺乳仔豬高死亡率為特征［1］。它對哺乳仔豬危害嚴重，感染后死亡率高達95%～100%，自2010年至今，在我國各省豬場發(fā)病率高居不下，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失。

國內外關于PEDV的致病機理、適應細胞的分子基礎等方面研究相對落后，主要是由于PEDV細胞培養(yǎng)比較困難，直到1988年，Hofmann等首次通過在Vero細胞中添加適量胰酶，成功分離培養(yǎng)了PEDV［2］；隨后，日本Kweon CH等［3］、韓國Song DS等［4］也同樣通過在Vero細胞中添加胰酶分離得到細胞適應株，并制成疫苗，近年來也相繼有一些成功分離PEDV的報道，但是PEDV適應細胞難度大，繁殖滴度低仍然是現階段研究中的兩大難題。

本實驗從四川某疑似病毒性腹瀉豬場的發(fā)病仔豬小腸內容物中獲取病料，通過在Vero細胞上連續(xù)盲傳，成功分離一株豬流行性腹瀉病毒，命名為SC-2014株，并不斷摸索最佳繁殖條件，以便更深入地掌握該株病毒的培養(yǎng)特性，為疫苗生產提供指導。

1　材料與方法

1.1病料及細胞系

病料來源于四川某病毒性腹瀉豬場哺乳仔豬小腸內容物，Vero E6傳代細胞系由華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院傳染病教研室保存。

1.2試劑與儀器

胰蛋白酶、DMEM營養(yǎng)液、胎牛血清購自Gibco公司；One step RTPCR試劑盒、DNA Marker-2000購自Takara公司；胰蛋白?磷酸肉湯、APAN購自BI公司；5%CO2細胞培養(yǎng)箱，細胞培養(yǎng)箱購自賽默飛公司，倒置顯微鏡（尼康）。

1.3引物的設計及合成

根據Genbank中登錄的PEDV參考毒株N基因序列，利用Primer5.0軟件涉及合成1對特異性引物，上下游引物分別為P1、P2，擴增產物大小為：引物序列如下P1：5’—TAAGTTGCTAGTGCGTAAT—3’，P2：5’—TTTACAACGAGAGTTACC ATTA—3’。引物由北京睿博生物技術有限公司合成。

1.4病毒RNA的提取和cDNA的合成

將小腸內容物與PBS以1∶4的比例稀釋，充分震蕩后反復凍融3次，6 000 r/min離心10 min，提取上清液中總RNA，按試劑盒說明書合成cDNA，將反轉錄產物置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5病毒的PCR檢測

以cDNA為模板進行PCR擴增， 反 應 體 系 為：One-step RTPCR buffer 12.5μL，上下游引物各1.0μL，RNA模板3μL，滅菌的DEPC水7.5μL。PCR擴增程序為：50 ℃ 30 min；95 ℃預變性1 min；94 ℃變性5 min； 55 ℃復性30 S；72 ℃延伸70 S，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。取5μL PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，用黑馬成像儀拍照觀察。

1.6病毒的分離

取PCR呈陽性的樣品，在8 000 g下離心10 min，取上清液用0.22μm無菌過濾器過濾除菌。將過濾的病毒液加入終濃度為15μg/mL的胰酶，置于37℃溫箱作用30 min；取24 h生長良好的Vero單層細胞的6孔細胞培養(yǎng)板，棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗3遍，將處理好的病毒液以400μL /孔接種5孔，另1孔作對照，置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育2 h后取培養(yǎng)板，棄去液體，每孔中加入2 mL含終濃度為25μg/mL的胰酶，0.3%胰蛋白?磷酸肉湯，0.02%酵母提取物的DMEM培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 d，收獲病毒培養(yǎng)物，于-20 ℃反復凍融3次，繼續(xù)進行下一代盲傳，直至出現穩(wěn)定的CPE。

1.7SC-2014株繁殖條件的優(yōu)化

1.7.1不同胰酶濃度條件

取生長良好的Vero單層細胞，消化后分裝到12孔板中，待細胞長滿時棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞2次，加入病毒液200μL，同時加入胰酶終濃度分別為2.5μg/mL，5μg/mL，10μg/ mL，15μg/mL，20μg/mL，25μg/ mL，50μg/mL，并設置對照組，在37 ℃溫箱中共同吸附1.5 h后棄去毒液，加入含胰酶各終濃度的DMEM營養(yǎng)液1 mL，37 ℃培養(yǎng)，72 h收毒，分別繁殖8代后均進行TCID50測定。

1.7.2不同吸附時間

取生長良好的Vero單層細胞，消化后分裝到12孔板中，待細胞長滿時棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞2次，加入含胰酶濃度為15μg/mL的病毒液200μL，在37 ℃溫箱中分別吸附30 min、1h、1.5h、2 h后棄去毒液，每孔加入1 mL含終濃度15μg/mL胰酶的DMEM營養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)，72 h收毒，分別繁殖8代后均進行TCID50測定。

1.7.3不同可溶性APAN濃度

取生長良好的Vero單層細胞，消化后分裝到12孔板中，待細胞長滿時棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞2次，先分別每孔加入終濃度為 10μg/mL，5μg/mL，2.5μg/ mL，1μg/mL，0.5μg/mL的可溶性APAN200μL，37℃吸附1 h，后每孔加入含胰酶濃度為15μg/mL的病毒液200μL，在37 ℃溫箱中吸附1.5 h棄去毒液，每孔加入1 mL含終濃度15μg/mL胰酶的DMEM營養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)，72 h收毒，分別繁殖8代后均進行TCID50測定。

2　結果

2.1病料RT-PCR檢測結果

將病料和已知陽性PEDV、TGEV、RV提取病毒RNA后，用P1，P2引物進行RT-PCR擴增，結果如圖1，病料和陽性PEDV均擴增出747 bp的目的片段，TGEV、RV均未擴增出目的條帶，說明該病料為PEDV陽性，并未混合感染其他腹瀉類病毒。

圖1　采集糞便樣品RT-PCR鑒定結果

2.2PEDV SC-2014株的分離與鑒定結果

病毒在Vero細胞上傳代前幾代幾乎無病變，盲傳至第8代出現細胞皺縮，變圓，折光性變強，部分細胞脫落等典型病變。隨著傳代代數的增加，細胞病變的時間逐漸變短，傳至30代時基本能在Vero細胞上穩(wěn)定增殖，48 h即出現輕微病變，60 h出現大面積典型病變。每隔5代做PCR檢測均為陽性，由此確定PEDV SC-2014株在Vero細胞上成功分離。

2.3PEDV SC-2014株繁殖條件優(yōu)化結果

2.3.1不同胰酶濃度對病毒滴度的影響

對不同胰酶濃度培養(yǎng)下病毒滴度測定結果如圖3，當胰酶濃度在10μg/ mL以下時，病毒滴度增長幅度較小，當胰酶濃度為15μg/mL時，病毒滴度達到最高值，后隨著胰酶濃度逐漸增大，病毒滴度也在緩慢降低，當胰酶濃度超過50 μg/mL時，細胞會出現脫落情況，表明SC-2014株在Vero細胞中增殖的最佳胰酶濃度為15μg/mL。

圖2　正常Vero細胞和接毒病變細胞的對比

圖3　不同胰酶濃度對病毒滴度的影響

2.3.2不同吸附時間對病毒滴度的影響

不同吸附時間下對病毒滴度測定結果如圖4，當吸附時間為0.5 h時，病毒滴度較低，隨著吸附時間的不斷延長，病毒呈直線增長，當吸附時間為1.5 h時，病毒滴度達到最高值，當吸附時間為2 h時，相比1.5 h病毒滴度也在緩慢降低，表明SC-2014株在Vero細胞中增殖的最佳吸附時間是1.5 h。

圖4　不同吸附時間對病毒滴度的影響

圖5　不同PAPN濃度對病毒滴度的影響

2.3.3不同PAPN濃度對病毒滴度影響不同PAPN濃度作用下對病毒滴度測定結果如圖5，與不加PAPN相比，

明顯發(fā)現病毒滴度稍微有所提升，當PAPN濃度低于2.5μg/mL時，病毒滴度增長很小，隨后隨PAPN濃度逐漸增大，滴度開始有所提升，當濃度達到5μg/mL時，病毒滴度達到最高值，當PAPN濃度超過5μg/mL時，病毒又會快速下降，表明病毒對PAPN濃度比較敏感，且SC-2014株在Vero細胞中增殖時需要的最佳PAPN濃度為5μg/mL。

3　討論

目前，國內外關于PEDV的分離鑒定和培養(yǎng)特性的相關報道越來越豐富。1988年，Hofmann等首次通過在Vero細胞中添加適量胰酶，成功分離培養(yǎng)了PEDV；2000年Shibata等用已適應Vero細胞的PEDV可轉入PK和ST細胞中增殖，并產生病變［5］；2002年，Kadoi K等在豬細胞系KSE6和IBRS2上不添加胰酶成功培養(yǎng)傳代［6］。本實驗通過采用Vero細胞，添加終濃度為10μg/mL的胰酶盲傳至第6代產生細胞病變并能穩(wěn)定傳代，而且傳至40代發(fā)現不添加胰酶也可在Vero細胞上繼續(xù)穩(wěn)定增殖，這可能是胰酶前期已對PEDV纖突蛋白有效切割，使病毒在不斷傳代中已適應細胞，不再需要胰酶的作用。

不同學者在PEDV培養(yǎng)時對于胰酶終濃度選擇也是不同的，李樹根等在維持液中加入60μg/mL胰酶，最終獲得成功［7］；田野等用胰酶終濃度為8μg/mL的維持液也成功培養(yǎng)PEDV［8］。本研究在PEDV SC-2014株進行培養(yǎng)時最終確定胰酶濃度為10μg/mL，病毒滴度達到最高，說明不同的細胞系、不同的毒株、不同的培養(yǎng)條件下對胰酶濃度的敏感性也是有所差異的，需要我們在實驗中不斷探索。

病毒培養(yǎng)中吸附過程是病毒感染的第一步，也是病毒能否成功大量繁殖的關鍵一步。朱文革等研究表明PRRSV NVDC-JXA1吸附30 min病毒增殖效果最佳［9］；Iwata，K等報道PRV在Vero細胞上1 h完成吸附［10］。本實驗PEDV在細胞上吸附達最大量需要1.5 h，表明不同病毒，不同毒株吸附過程所用的時間也是不同的，基本都在25～120 min之間。

Li等證實PAPN為PEDV細胞感染的一種功能性受體［11］，實驗中通過在Vero細胞中添加可溶性的豬氨基肽酶發(fā)現明顯提高了病毒的滴度。2003年，Oh，J S等曾推測外源性受體的加入會增加病毒與細胞結合的機會，為病毒吸附細胞提供良好條件，增加病毒產量［12］，本實驗中也得到較好的印證。

本實驗將分離的PEDV SC-2014株設置不同胰酶濃度，不同吸附時間、不同的培養(yǎng)時間和是否加APAN等條件，探索病毒最佳的繁殖條件，為提高病毒滴度提供途徑，為大量繁殖病毒，生產高效疫苗提供重要參考。

（本實驗是在華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院、人獸共患病防控制劑國家地方聯合工程實驗室、農業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點實驗室、廣東省動物源性人獸共患病預防與控制重點實驗室完成）

［1］ PENSAERT M B，DE BOUCK P，A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine［J］. Arch Virol， 1978，58（3）： 243-247.

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［3］ KWEON C H， KWON B J，Lee J G，et al. Derivation of attenuated porcine epidemic diarrhea virus （PEDV）as vaccine candidate［J］. Vaccine，1999，17（20-21）：2546-2553.

［4］ SONG D S，YANG J S，OH J S，et al.Differentiation of a Vero cell adapted porcine epidemic diarrhea virus from Korean field strains by restriction fragment length polymorphism analysis of ORF 3［J］. Vaccine， 2003，21（17-18）：1833-1842.

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［7］ 李樹根，李力復，李力施，等.豬流行性腹瀉病毒的分離及適應傳代細胞培養(yǎng)病毒株的建立［J］. 中國畜禽傳染病，1993（6）： 1-5.

［8］ 張海明，田野，王艷麗，等， 豬流行性腹瀉病毒CH/GDGZ/2012株免疫原性和動物攻毒實驗［J］. 豬業(yè)科學，2014，31（1）： 98-99.

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2016-03-12）

國家自然科學基金項目

王飛（1991-），男，碩士生，研究方向為動物傳染病，E-mail：1137852078@qq.com

賀東生，博士、教授，獸醫(yī)傳染病研究方向。E-mail：dhe@scau.edu.cn