李群，吳和珍，*，田代志，胡志剛，3

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 武漢 430065；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源與中藥復(fù)方省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430065；3.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700)

花粉形態(tài)數(shù)量化分析在忍冬屬花類藥材的鑒別及分類中的應(yīng)用△

李群1，吳和珍1，2*，田代志2，胡志剛1，3

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 武漢430065；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源與中藥復(fù)方省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢430065；3.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京100700)

目的：對(duì)忍冬屬不同產(chǎn)地12個(gè)樣本的花粉形態(tài)進(jìn)行系統(tǒng)觀察，以期在表觀性狀比較的基礎(chǔ)上，為忍冬屬花類藥材的鑒別及分類提供依據(jù)。方法：利用掃描電鏡(SEM)觀察花粉形態(tài)、表面紋理，測(cè)量花粉表面刺突的大小和密度；利用光學(xué)顯微鏡測(cè)量花粉的大小，獲得花粉形態(tài)特征數(shù)據(jù)，并用SPSS20.0軟件進(jìn)行分析。結(jié)果：忍冬屬同種不同產(chǎn)地的花粉形態(tài)數(shù)量化特征大體相近，但種間的花粉特征均有一定差異。結(jié)論：將花粉形態(tài)數(shù)量化并結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可為忍冬屬花類藥材的鑒別和分類提供參考依據(jù)。

忍冬屬；花粉形態(tài)數(shù)量化；SPSS20.0軟件；掃描電鏡；光學(xué)顯微鏡

金銀花為忍冬科忍冬屬植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花[1]，為臨床常用中藥。市場(chǎng)上金銀花的偽品較多，絕大部分為山銀花或同屬其他植物的花蕾。傳統(tǒng)鑒別方法主要依靠形態(tài)分類學(xué)和解剖學(xué)特征進(jìn)行藥材的真?zhèn)舞b別，然而對(duì)于忍冬屬同屬多種花類藥材，其表面特征極其相似，且同種藥材因產(chǎn)地不同也會(huì)發(fā)生變異，使該方法的應(yīng)用存在局限性。

花粉在遺傳學(xué)上具有較強(qiáng)的保守性和穩(wěn)定性，不同植物的花粉形態(tài)獨(dú)特、表面紋理細(xì)微特殊，常被用作植物分類和藥材鑒別的重要依據(jù)。尤其隨著掃描電鏡的出現(xiàn)和推廣，借助花粉形態(tài)研究植物分類和藥材鑒別的報(bào)道日益增多。張?jiān)鱗2]利用花粉形態(tài)結(jié)合統(tǒng)計(jì)分析研究中國檉柳科4屬27種植物，驗(yàn)證傳統(tǒng)分類的可靠性；早期朱雅東等[3]用光學(xué)顯微和掃描電鏡對(duì)忍冬屬19種藥用金銀花的花粉形態(tài)進(jìn)行研究。但迄今為止，未見采用花粉形態(tài)數(shù)量化-聚類分析方法鑒別忍冬屬的花類藥材并為分類提供依據(jù)的報(bào)道。

本文以忍冬屬12個(gè)樣本為代表，運(yùn)用掃描電鏡、光學(xué)顯微鏡對(duì)其花粉形態(tài)特征進(jìn)行觀察比較，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，探討數(shù)量化-聚類分析模式在忍冬屬花類藥材的鑒別及分類中的應(yīng)用。

1 儀器與材料

1.1儀器

ModelUB100iSeries生物顯微鏡(重慶澳浦光電技術(shù)有限公司)，JEOLJFC-1600AUTOFINECOATER離子濺鍍機(jī)(日本電子株式會(huì)社)，JEOLJSM-6510LV掃描電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社)。

1.2材料

12個(gè)樣本由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所提供，由研究所陳士林團(tuán)隊(duì)做過DNABarcoding鑒別研究[4]，見表1。

表1 忍冬屬12個(gè)樣本材料來源

2 方法

2.1光學(xué)顯微法測(cè)定花粉大小

每個(gè)樣本取2～3個(gè)花藥在載玻片上用鑷子輕輕碾碎，水合氯醛透化裝片，Model UB100i Series生物顯微鏡下觀察。隨機(jī)各選取30粒花粉，顯微測(cè)微尺測(cè)量其極軸長(zhǎng)(P)和赤道寬(E)。P×E 表征花粉大小，P/E表征花粉形狀。

2.2掃描電鏡法觀察花粉表面特征

將用于掃描電鏡觀察的花蕾置于干燥器中干燥，輕輕將干燥花粉均勻涂于粘有雙面膠帶的鋁金屬樣品臺(tái)上，用JEOL JFC-1600AUTO FINE COATER 噴金后，在 JEOL JSM-6510LV型掃描電子顯微鏡下觀察花粉的形狀、萌發(fā)孔、表面紋理等特征，并攝像。隨機(jī)選取攝像清晰且是正面的10?；ǚ?，分別測(cè)花粉邊緣直立的刺突的長(zhǎng)度(L)和正面刺突的基部直徑(Dia)，每粒測(cè)2個(gè)數(shù)據(jù)；隨機(jī)選取20?；ǚ?，在放大1500倍情況下，每粒測(cè)熒屏上每(3×3) cm2表面[即花粉粒表面中部每(15×15) μm2)]所分布的刺突數(shù)，衡量花粉表面刺突的密度(D)。

2.3數(shù)據(jù)分析

將極軸長(zhǎng)(P)、赤道寬(E)、P/E、刺突的長(zhǎng)度(L)、刺突的基部直徑(Dia)、刺突的密度(D)作為觀察指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。但由于有的變量之間存在相互關(guān)聯(lián)，用SPSS20.0軟件先對(duì)這些指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，組合出互不關(guān)聯(lián)的綜合指標(biāo)，然后對(duì)綜合指標(biāo)聚類分析，按計(jì)算結(jié)果畫出聚類分析圖。

3 結(jié)果與分析

3.1掃描電鏡觀察結(jié)果

12個(gè)樣本的花粉形狀很相似，近扁球形至近球形；極面觀均近似三角形，赤道面觀橢圓或近圓形；萌發(fā)孔3個(gè)，均為橢圓形；表面具刺狀突起。但花粉粒的大小(極軸長(zhǎng)、赤道面寬)，表面刺突的長(zhǎng)短、粗細(xì)、疏密都存在差異，觀察結(jié)果見表2?；ǚ鄣臉O面、赤道面、表面刺突、萌發(fā)孔的電鏡掃描圖見圖1。

表2 忍冬屬12個(gè)樣本的花粉形態(tài)特征數(shù)據(jù)表

3.2數(shù)據(jù)分析

3.2.1數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理和主成分分析 主成分分析是一種降維或者將多個(gè)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為幾個(gè)綜合指標(biāo)的多元數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法[5-6]。實(shí)驗(yàn)選擇的指標(biāo)之間往往互有影響，需要將這些指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，選出幾個(gè)互不關(guān)聯(lián)的綜合性指標(biāo)來反映原來的指標(biāo)的信息；由于各指標(biāo)具有不同的量綱，因此在主成分分析前先將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，使數(shù)據(jù)具有可比性。表2中的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后如表3所示，主成分分析內(nèi)容見表4～6。

表3 忍冬屬12個(gè)樣本6個(gè)花粉形態(tài)特征指標(biāo)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果

表4 6個(gè)主成分的特征值以及貢獻(xiàn)率

由表4可知前3個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到92.394%，能充分反映原始數(shù)據(jù)的信息，故選取前3個(gè)主成分分析。

表5 主成分載荷矩陣

表6 主成分得分

3.2.2 聚類分析 采用表6中主成分得分代替原始指標(biāo)對(duì)樣本進(jìn)行聚類分析，從而達(dá)到降維和綜合指標(biāo)的作用。聚類分析結(jié)果見圖2。

圖2 12個(gè)樣本聚類分析結(jié)果

從圖2看出，在聚類重新標(biāo)定距離(rescaled distance cluster combine，RDCC)約為3時(shí)，樣本5、6聚成一類A，樣本2、3聚為一類B，樣本8、9聚為一類C，樣本10、12聚為一類D，樣本7自成一類E，大致與DNA Barcoding 結(jié)果相符，但仍存在個(gè)別差異。如：在DNA Barcoding鑒定中被歸于B類的樣本1在RDCC 為3以下時(shí)歸為C類，但其花粉粒大小卻與歸于C類的樣本8、9相差懸殊，在RDCC約為5時(shí)B類、C類又可聚為同一類，可能揭示原植物種間遺傳距離相近；按DNA鑒定結(jié)果，樣本4與樣本5、6同種，樣本11與樣本10、12同種，與此處聚類分析結(jié)果不符，但觀察花的外觀形態(tài)可知，樣本4和樣本11與各自同種的其他樣本的花在外觀上就明顯不同，聚類結(jié)果支持了外觀上的差異，結(jié)合各自的產(chǎn)區(qū)，揭示種內(nèi)花粉的這種形態(tài)上的差異可能與不同生態(tài)環(huán)境下的變異或營養(yǎng)狀況有關(guān)。

基于外觀上的比較分析，花粉特征聚類分析結(jié)果總體上支持形態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)分類的結(jié)果，可用于忍冬屬花類藥材的鑒別及分類。

4 討論

我國忍冬屬植物資源非常豐富，野生和栽培品種繁多[7]。在長(zhǎng)期演化過程中，植物器官的形態(tài)很多產(chǎn)生了變異，使植物的鑒別、分類產(chǎn)生困難。但花粉在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中基因相對(duì)保守，受環(huán)境影響較小[8]，形態(tài)特征較穩(wěn)定，因此可為植物的起源、演化、分類和鑒定提供依據(jù)[9-10]。

本文研究結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的忍冬屬花粉形態(tài)特征很相近，體現(xiàn)忍冬屬植物的共同特征；但不同種或同種不同產(chǎn)地的植株的花粉大小、表面刺突長(zhǎng)短、疏密等存在一定差異，將這些差異特征數(shù)量化分類，分類結(jié)果與形態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)分類結(jié)果大體一致，一定程度上既反映了種內(nèi)花粉的共性，又可體現(xiàn)種間的差異性，對(duì)于鑒別不同種藥材具有重要的價(jià)值。對(duì)于不斷進(jìn)化、不斷變異的忍冬屬植物來說，數(shù)量化分類的方法雖然未能完全地確定其分類學(xué)地位，但該種分類方法必將在今后自然科學(xué)分類和藥材的鑒定中得到完善和發(fā)展。

《中華人民共和國藥典》(《中國藥典》)2005版將金銀花和山銀花分成2種藥材收載，金銀花僅來源于忍冬科植物忍冬一個(gè)品種，山銀花來源于灰氈毛忍冬、紅腺忍冬、華南忍冬[11]，《中國藥典》2010版山銀花品種又新收載黃褐毛忍冬[1]28，而且還有增加趨勢(shì)。本研究中，樣本1與樣本2、3，樣本4與樣本5、6分別被遺傳學(xué)鑒定為同一個(gè)種，但由于產(chǎn)區(qū)不同，同種的花粉形態(tài)地域差異性明顯，引發(fā)了一個(gè)關(guān)于地區(qū)藥材分類的思考：能否依據(jù)這種地域性差異將某物種從傳統(tǒng)分類中劃分出來，歸入他類或自成一類；《中國藥典》上收載的金銀花、山銀花的來源是否要有地區(qū)上的限定；樣本11所代表的一類細(xì)氈毛忍冬的花能否被新收入作山銀花的品種，這類問題都有待進(jìn)一步研究。

[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：28，221.

[2] 張?jiān)?中國檉柳科植物花粉形態(tài)特征聚類分析[J].西北植物學(xué)報(bào)，2004，24(9)：1702-1707.

[3] 朱雅東，濮祖茂，徐國鈞，等.中藥金銀花花粉形態(tài)研究[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1987，18(2)：81-88.

[4]SunZ，GaoT，YaoH，etal.IdentificationofLonicerajaponicaand its related species using the DNA Barcoding method[J].Planta Med，2011，77：301-306.

[5] 張玉榮，張秀華，周顯青，等.主成分分析法綜合評(píng)價(jià)大米的食味品質(zhì)[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，29(5)：1-5.

[6] 宋江峰，李大婧，劉春泉，等.甜糯玉米軟罐頭主要揮發(fā)性物質(zhì)主成分分析和聚類分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43(10)：2122-2131.

[7] 張芳，張永清，周鳳琴，等.忍冬5個(gè)農(nóng)家品種花粉形態(tài)比較觀察[J].中國中藥雜志，2011，36(10)：1266-1268.

[8] 孫崇波，向林，施季森，等.蘭科5屬常見栽培品種花粉塊形態(tài)的掃描電鏡觀察[J].園藝學(xué)報(bào)，2010，37(12)：1969-1974.

[9] 孫佳，曾麗，劉正宇，等.微型月季品種分類的花粉形態(tài)學(xué)[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42(5)：1867-1874.

[10] 顧欣，張延龍，牛立新.中國西部四省15種野生百合花粉形態(tài)研究[J].園藝學(xué)報(bào)，2013，40(7)：1389-1398.

[11] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：21.

ApplicationofNumericalTaxonomyofPollenMorphologyinPharmacognosticIdentificationandClassificationofLoniceraL.

LIQun1，WUHezhen1，2*，TIANDaizhi2，HUZhigang1，3

(1.CollegeofPharmacy，HubeiUniversityofChineseMedicine，Wuhan430065，China；2.KeyLaboratoryofMinistryofeducationofResourcesoftraditionalChinesemedicineandChineseherbalcompound，HubeiUniversityofChineseMedicine，Wuhan430065，China；3.InstituteofChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China)

Objective：To make systemic morphological observation for12pollen samples ofLoniceraL.from different habitats and provide a reference for pharmacognostic identification and classification based on the character comparisons.Methods：The scanning electron microscope (SEM) was applied to observe the morphological characteristics and gauge the size and density of external spine while the pollen size was measured by means of optical microscope，and the data were analyzed by SPSS20.0software.Results：Numerical features of pollens of same species from different habitats were broadly similar in contrast with interspecific differences.Conclusion：Application of Numerical Taxonomy of Pollen Morphology combined with statistical analysis can provide a basis for pharmacognostic identification and classification ofLonicera.

LoniceraL.；numerical taxonomy of pollen morphology；SPSS20.0software；scanning electron microscope(SEM)；optical microscope

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.7.012

2015-11-03)

湖北省教育廳2010年度高校產(chǎn)學(xué)研合作資助項(xiàng)目(C2010042)

*

吳和珍，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥品種、質(zhì)量及其資源開發(fā)研究；E-mail：hezh_wu@163.com