張穎，郭盛，朱邵晴，嚴輝，王強，徐璐，段金廒

(南京中醫(yī)藥大學 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心 中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇 南京 210023)

不同生長期酸棗葉中多類型資源性化學成分的積累變化與分析評價△

張穎，郭盛*，朱邵晴，嚴輝，王強，徐璐，段金廒*

(南京中醫(yī)藥大學 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心 中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇 南京210023)

目的：研究不同生長期酸棗葉中多類型資源性化學成分的動態(tài)變化規(guī)律，為酸棗葉適宜采收期的確定及資源高效利用提供依據(jù)。方法：采用UPLC-TQ/MS法和HPLC法分別建立酸棗葉中19種核苷類和23種氨基酸類，以及黃酮類成分蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷的分析方法，并比較不同生長期酸棗葉中上述組分的組成及含量變化趨勢。結(jié)果：不同生長期酸棗葉中多類型資源性化學成分含量差異較大。其中，核苷類化學成分隨生長期變化總體含量表現(xiàn)為先升高后降低，再升高后再降低的雙峰變化趨勢；氨基酸類化學成分總量總體表現(xiàn)為先升高后降低的變化趨勢；黃酮類化學成分總體表現(xiàn)為含量由高漸低的變化趨勢。3類化學成分均以6月28日所采集樣品含量相對較高。結(jié)論：綜合分析，酸棗葉以制茶為主要利用目的其適宜采收期應為6月下旬。本研究結(jié)果為酸棗葉適宜采收期的確定提供了科學依據(jù)，也為酸棗葉資源的有效利用提供了數(shù)據(jù)支撐。

酸棗葉；核苷類；氨基酸類；黃酮類；采收期

鼠李科棗屬植物酸棗Ziziphusjujubavar.spinosa(Bunge) Hu ex H.F.Chow為重要的藥用植物資源，廣泛分布于我國北方廣大低山丘陵地區(qū)。其干燥成熟種子為臨床常用養(yǎng)心安神中藥酸棗仁，具養(yǎng)心補肝、寧心安神、斂汗、生津之功效。但除其種子外，在其生長過程中產(chǎn)生的大量枝葉、果肉等資源缺乏有效利用途徑而多被廢棄。本草記載，酸棗葉、花、果肉、棘刺、樹皮及根均可藥用。其中，酸棗葉又名棘葉，《本草綱目》記載其具有“斂瘡解毒，治脛臁瘡”之功，可用于臁瘡的治療[1]。近年來，有利用酸棗葉開發(fā)為具有調(diào)節(jié)神經(jīng)衰弱之心神不安、失眠多夢，改善心肌缺血，降血壓，降血脂等保健作用的功能性茶飲的研究報道[2]；也有文獻記載，酸棗葉及同屬其他植物葉片在伊朗等中東地區(qū)還常作為制備甜味抑制劑的主要原料[2-3]。但以上利用途徑均尚未形成產(chǎn)業(yè)規(guī)模。本課題組前期在進行棗屬藥用植物資源化學研究過程中，為促進棗葉及酸棗葉資源的有效利用，對其化學成分組成進行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)酸棗葉中富含黃酮類、三萜酸及其皂苷類、酚酸類、核苷類、氨基酸類等多種類型活性成分[4-8]，并圍繞不同干燥加工方法對其活性成分的影響進行了研究[9]，為酸棗葉干燥加工工藝的建立提供了依據(jù)。本文在前期研究的基礎(chǔ)上，以酸棗葉中含有的與其營養(yǎng)保健功效密切相關(guān)的核苷類、氨基酸類、黃酮類化學成分為指標，考察其不同生長期化學成分的變化趨勢，以期為酸棗葉適宜采收期的確定及資源高效利用提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器

LabconcoFreeZone2.5L冷凍干燥機(美國Labconco公司)，Waters2695HPLC及WatersACQUITYUPLC系統(tǒng)(包括四元泵溶劑系統(tǒng)，在線脫氣機和自動進樣器；Waters公司，Milford，USA)，XevoTQ檢測器(Waters公司)，MassLynxTM質(zhì)譜工作站軟件(Waters公司)，BT125型電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)，EPED超純水系統(tǒng)(南京易普易達科技發(fā)展有限公司)，KQ-250E型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)，Microfuge22R型離心機(德國Beckman公司)。

1.2材料

氨基酸類化學對照品(亮氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、色氨酸、γ-氨基丁酸、甲硫氨酸、脯氨酸、纈氨酸、?；撬?、酪氨酸、丙氨酸、4-羥基脯氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、天冬酰胺、瓜氨酸、精氨酸、組氨酸、鳥氨酸、天冬氨酸)、核苷類化學對照品(胸腺嘧啶、胸苷、2′-脫氧腺苷、腺嘌呤、尿苷、腺苷、2′-脫氧肌苷、肌苷、胞嘧啶、胞苷、鳥苷、2′-脫氧腺苷-5′-單磷酸、腺苷-5′-單磷酸、鳥苷-5′-單磷酸、胞苷-5′-單磷酸、2′-脫氧尿苷、肌苷-5′-單磷酸、環(huán)磷酸鳥苷、環(huán)磷酸腺苷、次黃嘌呤)均購自Sigma公司；黃酮類化學對照品蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷均購自中國食品藥品檢定研究院；以上化學對照品純度經(jīng)HPLC檢測均大于98%。

乙腈為色譜純(德國默克公司)；超純水(18.2MΩ·cm)為經(jīng)易普易達超純水系統(tǒng)自制；其他化學試劑均為分析純(上海國藥化學試劑公司)。

酸棗葉樣品于2015年6—10月采自南京中醫(yī)藥大學藥用植物園，其基原植物經(jīng)南京中醫(yī)藥大學段金廒教授鑒定為鼠李科植物酸棗Ziziphusjujubavar.spinosa(Bunge) Hu ex H.F.Chow。藥材標本存放于南京中醫(yī)藥大學標本館。樣品采集后，去離子水清洗表面，-70℃密封貯存。樣品采集信息見表1。

表1 酸棗葉樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1樣品預處理

取不同成熟期的新鮮酸棗葉樣品，經(jīng)冷凍干燥至含水量約為10%(見表1)，粉碎過2號篩。

2.2氨基酸及核苷類化學成分的分析

2.2.1色譜及質(zhì)譜條件 色譜柱：AcquityUPLCBEHAmide(100mm×2.1mm，1.7μm)；流動相：A-含5mmol·L-1甲酸銨、乙酸銨和0.2%甲酸的水溶液，B-含1mmol·L-1甲酸銨、乙酸銨和0.2%甲酸的乙腈溶液，梯度洗脫(0～3min，10%A；3～9min，10%→18%A；9～15min，18%→20%A；15～16min，20%→46%A；16～20min，46%A)。流速：0.4mL·min-1，柱溫：35℃，進樣量：1μL。質(zhì)譜檢測條件同文獻[9]。色譜圖見圖1。

圖1 核苷及氨基酸類化學成分UPLC-TQ/MS圖

2.2.2對照品溶液的制備 取干燥至恒重的各核苷與氨基酸對照品適量，精密稱定，以少量10%甲醇溶解，置10mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，配成混合核苷與氨基酸對照品溶液。

2.2.3供試品溶液的制備 取樣品粉末1.0g，精密稱定，置100mL具塞錐形瓶中，精密加入超純水50mL，稱重，靜置30min后，超聲(100Hz，50℃)60min，冷卻后加超純水補足減失重量，搖勻，13000r·min-1離心10min，取上清液過0.22μm濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4線性關(guān)系考察 精密量取對照品母液適量，加水配制成系列濃度的混合對照品溶液，按2.2.1項下色譜及質(zhì)譜條件進樣分析，以峰面積積分值為縱坐標(Y)，以進樣量為橫坐標(X)進行線性回歸，計算其相關(guān)系數(shù)(r)。結(jié)果顯示，所測定的19種核苷類、23種氨基酸類化學成分在其相應的線性范圍內(nèi)r為0.9954～0.9997，表明該方法線性關(guān)系均良好。

2.2.5精密度試驗 取混合對照品溶液，按2.2.1項下色譜條件連續(xù)進樣6次測定，結(jié)果顯示所測定成分峰面積的RSD在1.51%～4.49%，表明本方法的精密度良好。

2.2.6重復性試驗 取同一樣品(編號：S2)6份，精密稱定，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，進樣測定，所測定成分質(zhì)量分數(shù)的RSD在2.33%～4.85%，表明本方法的重復性良好。

2.2.7穩(wěn)定性試驗 取供試品(編號：S2)溶液12h內(nèi)每隔2h進樣測定，結(jié)果顯示所測定成分峰面積的RSD在2.15%～4.33%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8加樣回收率試驗 取已測定的樣品(編號：S2)6份，精密稱定，分別加入各對照品適量，制備供試品溶液，進樣測定，結(jié)果顯示所測定成分的平均回收率在95.28%～103.71%，RSD<4.5%，表明該方法準確可靠。

2.2.9樣品測定 取樣品適量，精密稱定，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，按外標一點法計算質(zhì)量分數(shù)，分析結(jié)果見表2。

2.3黃酮類化學成分的分析

2.3.1色譜條件 GRACE Apollo C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，柱溫：28℃，流動相A：乙腈，流動相B：水(含0.1%甲酸)；梯度洗脫程序：0～5min，10%～15% A；5～15min，15% A；15～15.2min，15%～18% A；15.2～40min，18% A；40～41min，18%～22% A；41～55min，22% A；55～58min，22%～95% A；58～60min，95% A；流速：0.8mL·min-1，進樣體積：10μL，檢測波長：360nm。色譜圖見圖2。

注：A.對照品溶液；B.樣品溶液；1.蘆?。?.金絲桃苷；3.異槲皮苷。圖2 酸棗葉中黃酮類化學成分HPLC圖

2.3.2對照品溶液的制備 取蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成質(zhì)量濃度為0.187、0.039、0.068mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3.3供試品溶液的制備 取樣品粉末1.0g，精密稱定，置50mL具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇水溶液20mL，稱重，靜置30min后，超聲(100Hz，50℃)30min，冷卻后加70%甲醇水溶液補足減失重量，搖勻，13000r·min-1離心10min，取上清液過0.45μm濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4線性關(guān)系考察 精密量取對照品母液適量，加甲醇配制成系列濃度的混合對照品溶液，按2.3.1項下色譜條件進樣分析，以峰面積積分值為縱坐標(Y)，以進樣量(μg)為橫坐標(X)進行線性回歸，計算r。結(jié)果顯示，蘆丁線性回歸方程為Y=1.91×106X+1.66×103，線性范圍：0.0374～3.74μg(r=0.9996)；金絲桃苷線性回歸方程為Y=4.44×106X+2.08×104，線性范圍：0.0156～1.56μg(r=0.9999)；異槲皮素苷線性回歸方程為Y=5.06×106X-2.25×104，線性范圍：0.0272～2.72μg(r=0.9999)。以上結(jié)果表明該方法線性關(guān)系均良好。

2.3.5精密度試驗 取混合對照品溶液，按2.3.1項下色譜條件連續(xù)進樣6次測定，結(jié)果顯示蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷峰面積的RSD分別為0.85%、0.56%、1.02%，表明本方法的精密度良好。

2.3.6重復性試驗 取同一樣品(編號：S2)6份，精密稱定，按2.3.3項下方法制備供試品溶液，進樣測定，結(jié)果顯示蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷質(zhì)量分數(shù)的RSD分別為1.52%、1.89%、1.97%，表明本方法的重復性良好。

2.3.7穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液12h內(nèi)每隔2h進樣測定，結(jié)果顯示蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷峰面積的RSD分別為1.10%、0.98%、1.21%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8加樣回收率試驗 取已測定的樣品6份，精密稱定，分別加入各對照品適量，制備供試品溶液，進樣測定，結(jié)果顯示蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷的平均回收率分別為98.19%、97.02%、102.33%，其RSD分別為1.87%、2.04%、2.21%，表明該方法準確可靠。

2.3.9樣品測定 取樣品適量，精密稱定，按2.3.3項下方法制備供試品溶液，按2.3.1項下色譜條件進樣測定，按外標一點法計算質(zhì)量分數(shù)，分析結(jié)果見表2。

表2 不同生長期酸棗中核苷類、氨基酸類及黃酮類成分分析結(jié)果(n=3)

注：a表示未檢測到；b表示低于定量限。

3 分析與討論

3.1核苷類化學成分的動態(tài)變化規(guī)律分析

有研究證實，核苷類化學成分具有廣泛的生理活性，是生物細胞維持生命活動的基本組成元素，參與DNA代謝過程，具有抗腫瘤、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、改善腦細胞代謝、鎮(zhèn)靜中樞神經(jīng)、抗血小板凝集、抗心律失常和抗驚厥等多種生物活性，還有學者認為核苷類化學成分可能是補益中藥的共同物質(zhì)基礎(chǔ)。如表2所示，酸棗葉中富含核苷類資源性化學成分，表明其具有較高的營養(yǎng)及保健價值。所測定的19種核苷類化學成分中，以磷酸化的核苷類化學成分如鳥苷-5′-單磷酸、腺苷-5′-單磷酸、胞苷-5′-單磷酸，以及尿苷、鳥苷含量相對較高。核苷類成分總量總體呈現(xiàn)出先升高后降低，再升高再降低的雙峰變化趨勢，以6月28日采集樣品(S2)和9月18日采集樣品(S6)核苷類成分總量相對較高，分別為0.83、0.82mg·g-1。不同種類核苷類成分呈現(xiàn)出不同的變化趨勢，其中含量相對較高的尿苷、胞苷-5′-單磷酸呈現(xiàn)出與總核苷較為一致的雙峰變化趨勢，而鳥苷、2′-脫氧腺苷-5′-單磷酸、鳥苷-5′-單磷酸則整體呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢。

3.2氨基酸類化學成分的動態(tài)變化規(guī)律分析

由表2可知，不同生長期酸棗葉樣品中均富含氨基酸類化學成分，其氨基酸總量可達1.81mg·g-1以上。8種必需氨基酸中，除甲硫氨酸含量相對較低、難以檢測外，其余均存在于多數(shù)樣品中，表明酸棗葉具有較高的營養(yǎng)保健價值。不同生長期酸棗葉中總氨基酸含量總體表現(xiàn)為先升高后降低的變化趨勢，以6月28日所采集樣品(S2)含量最高，達3.05mg·g-1。不同種類氨基酸呈現(xiàn)出不同的變化趨勢。其中，含量相對較高的氨基酸如谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、γ-氨基丁酸，其含量變化呈現(xiàn)出與總氨基酸較為一致的先升高后降低趨勢，且以6月28日所采集樣品(S2)含量相對較高。據(jù)報道，谷氨酸具有肝臟保護作用，且具有興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用；天冬氨酸能調(diào)節(jié)腦和神經(jīng)的代謝功能，具有改善疲勞作用；γ-氨基丁酸是一種天然存在的非蛋白組成氨基酸，可參與多種代謝活動，具有健腦益智、促進睡眠、延緩腦衰老機能、降血壓等作用；酪氨酸是酪氨酸酶單酚酶功能的催化底物，是最終形成優(yōu)黑素和褐黑素的主要原料，應用于美白化妝品中，可有效地抑制黑素的生成，此外尚具有抗抑郁作用。據(jù)此，如以氨基酸為主要利用目的，以6月下旬采摘較為適宜。

3.3黃酮類化學成分的動態(tài)變化規(guī)律分析

酸棗葉中富含黃酮類化學成分，其中以蘆丁含量相對較高。所測定3種黃酮類成分總量隨酸棗葉的生長整體呈現(xiàn)出由高漸低的變化趨勢，6月8日采集樣品(S1)和6月28日采集樣品(S2)3種黃酮類成分總量相對較高，分別為8.15、8.26mg·g-1，至近落葉時(10月9日)采集樣品(S7)其含量降至4.74mg·g-1，降低了近43%。3種黃酮類成分中，蘆丁整體表現(xiàn)出與總黃酮含量較為一致的變化趨勢，而異槲皮苷表現(xiàn)為在酸棗葉生長后期(8～9月)積累量增大，至近落葉時(10月9日)其含量又急劇下降的變化趨勢。研究顯示，蘆丁具有抗氧化、抗衰老、保護心腦血管等多重生物活性。本研究結(jié)果顯示酸棗葉為富含黃酮類化學成分蘆丁的植物資源，表明其具有重要的營養(yǎng)保健價值，且提示如以蘆丁為主要利用目的，以6月采集較為適宜。

3.4酸棗葉適宜采收期的確定

已有報道顯示，以棗葉制茶時，以5月和6月所采摘的棗葉所制得的茶色澤嫰綠、湯色明亮、滋味鮮醇渾厚，整體品質(zhì)優(yōu)于其他時間所采摘的棗葉[10]。本研究顯示，生長期為6月下旬的酸棗葉其核苷類、氨基酸類及黃酮類化學成分的含量均相對較高。因此，綜合考慮所制茶的品質(zhì)、活性成分組成與含量，以6月下旬采摘較為適宜。

此外，在產(chǎn)地為促進酸棗樹花芽分化及增加坐果率和增大果重，摘心抹芽是矮化密植棗園管理的重要環(huán)節(jié)。目前酸棗樹摘心抹芽多在5～7月進行，因此可利用6月下旬摘心抹芽過程中所產(chǎn)生的酸棗葉資源開發(fā)酸棗葉茶等功能性產(chǎn)品，促進酸棗葉資源的有效利用。

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DynamicAnalysisofNucleosides，AminoAcidsandFlavonoidsinLeavesofZiziphusjujubavar.spinosaCollectedinDifferentGrowthPeriod

ZHANGYing，GUOSheng*，ZHUShaoqing，YANHui，WANGQiang，XULu，DUANJinao*

(JiangsuCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization，andNationalandLocalCollaborativeEngineeringCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrializationandFormulaeInnovativeMedicine，NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China)

Objective：To investigate the dynamic changes of multiple ingredients inZiziphusjujubavar.spinosaleaf (ZSL) collected in different growth period，and provide the data for selection of the suitable harvest time of ZSL.Methods：UPLC-TQ MS and HPLC methods were used to determine the contents of19nucleosides and23amino acids as well as rutin，hyperoside and isoquercitrin in ZSL and their contents in the samples collected in different growth periods were compared.Results：The content differences of nucleosides，amino acids and flavonoids in ZSL collected in different growing periods were greatly obvious.Among them，the content of nucleosides generally exhibited two peaks with the leaf growth.Amino acids content showed a trend that increased firstly，then decreased.For flavonoids，a gradually reducing trend from the high level of their whole content was found.The total content of these three types constituents were relatively high in samples collected in June28th.Conclusion：Given the above results，the suitable harvesting time for ZSL should be in late June when it was mainly used to prepare the tea.The results of this study provide a scientific basis for selecting the suitable harvesting period for ZSL as well the data for the efficient utilization of ZSL resource.

Ziziphusjujubavar.spinosaleaf；nucleosides；amino acids；flavonoids；harvesting time

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.7.011

2015-12-31)

國家自然科學基金面上項目(81473538)；教育部霍英東教育基金會高等院校青年教師基金項目(141040)；國家中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(201407002)；江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心重點項目(ZDXM-2-8)；江蘇高校優(yōu)勢學科建設(shè)工程資助項目(ysxk-2014)

*

郭盛，博士，研究方向：中藥資源化學及資源循環(huán)利用，E-mail：guosheng@njucm.edu.cn；段金廒，教授，研究方向：中藥資源化學及資源循環(huán)利用，E-mail：dja@njucm.edu.cn