鄭夏生，賴智填，成金樂

(國家中醫(yī)藥管理局中藥破壁飲片技術(shù)與應(yīng)用重點(diǎn)研究室 中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司，廣東 中山 528437)

DNA條形碼在中藥破壁飲片物種鑒定的應(yīng)用

鄭夏生，賴智填，成金樂*

(國家中醫(yī)藥管理局中藥破壁飲片技術(shù)與應(yīng)用重點(diǎn)研究室 中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司，廣東 中山528437)

目的：建立中藥破壁飲片的DNA條形碼鑒定方法。方法：通過提取15個(gè)品種的中藥破壁飲片的基因組DNA，并利用DNA條形碼鑒定技術(shù)中的ITS2和psbA-trnH兩個(gè)片段進(jìn)行物種鑒定。結(jié)果：ITS2可以成功地對(duì)這15個(gè)品種進(jìn)行鑒定；psbA-trnH也可對(duì)大部分的樣品進(jìn)行鑒定。結(jié)論：說明DNA條形碼技術(shù)在中藥破壁飲片的物種鑒定上可以得到很好的應(yīng)用；同時(shí)也驗(yàn)證了以ITS2為主，psbA-trnH為輔助的藥用植物DNA條形碼鑒定思路的正確性和可行性。另外，psbA-trnH的數(shù)據(jù)庫也可能存在不足，需補(bǔ)充完善更全面的物種序列信息，以供日后的物種鑒定提供更全面的基因模板信息作為參考和對(duì)照。

破壁飲片；物種鑒定；DNA條形碼；ITS2；psbA-trnH

中藥破壁飲片是通過現(xiàn)代粉碎技術(shù)將傳統(tǒng)中藥飲片加工至D90< 45 μm(300目以上)的破壁粉末，進(jìn)而通過無固體添加成型技術(shù)制成的30～100目的干燥顆粒狀飲片[1]。藥材經(jīng)過細(xì)胞破壁處理后，其中所含的有效物質(zhì)獲得更好的溶出[2-3]，加上生產(chǎn)過程中無高溫提取，可以有效避免有效物質(zhì)的變性。但與此同時(shí)，破壁后的藥材失去了絕大多數(shù)的顯微特征，增加了其物種鑒定的難度。DNA條形碼為中藥破壁飲片的物種鑒定提供了很好的解決方案。

DNA條形碼是近年來發(fā)展迅速的可用于動(dòng)植物物種快速鑒定的技術(shù)[4]。該技術(shù)系通過基因組中一段公認(rèn)的、相對(duì)較短的DNA序列來進(jìn)行物種鑒定，具有快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)[5-8]。陳士林課題組對(duì)6000余份藥用植物樣本進(jìn)行DNA條形碼序列篩選，提出以ITS2(Internal Transcribed Spacer 2)作為藥用植物標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼[9]，以psbA-trnH作為輔助的藥用植物鑒定技術(shù)的思路[10]；并創(chuàng)建了“中草藥DNA條形碼生物鑒定體系”，實(shí)現(xiàn)中藥資源信息檢索、查詢以及基因序列的比對(duì)鑒定，從基因水平解決中藥材與混偽品的物種識(shí)別問題。他們還將DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用于中藥材流通監(jiān)管領(lǐng)域，建立中藥材二維DNA條形碼流通監(jiān)管體系[11]，進(jìn)而為中藥材流通監(jiān)管提供更有力的技術(shù)支持。

近年來，DNA條形碼技術(shù)在中藥基原植物和中藥材的物種鑒定上得到了廣泛的應(yīng)用。然而，該技術(shù)尚未在中藥產(chǎn)業(yè)中得到實(shí)際應(yīng)用?！吨腥A人民共和國藥典》(2010年版第三增補(bǔ)版)收錄了DNA條形碼技術(shù)，作為中藥材質(zhì)量控制的新方法[12]。因此，DNA條形碼在中藥產(chǎn)業(yè)化中的實(shí)際應(yīng)用將成為未來若干年發(fā)展的潮流。本研究報(bào)道了利用DNA條形碼對(duì)15個(gè)品種的中藥破壁飲片進(jìn)行物種鑒定的工作，是DNA條形碼在中藥產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的重要探索。

1 儀器與材料

1.1儀器

生物均質(zhì)儀(愛施德，Bioprep-24)；低溫冰箱(Eppendorf，5430R)；多功能PCR儀(Biometra，F(xiàn)lexCycler 2)；水平電泳儀(Bio-Rad)；凝膠成像儀(Biometra，BDAdigital)。

1.2材料

本研究中使用的中藥破壁飲片均由中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供,共涉及15個(gè)中藥品種，詳細(xì)信息見表1、圖1。

表1 15個(gè)破壁飲片品種樣品信息

注：樣品序號(hào)同表1。圖1 15個(gè)品種的中藥破壁飲片

各品種中藥破壁飲片的原料藥材經(jīng)過中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司賈世清中藥師鑒定，憑證標(biāo)本保留于國家中醫(yī)藥管理局中藥破壁飲片技術(shù)與應(yīng)用重點(diǎn)研究室留樣室。

植物基因組DNA提取試劑盒(百泰克，DP3111)；2×Power Taq PCR MasterMix(百泰克，PR1701)。

2 方法

2.1DNA提取和PCR擴(kuò)增

分別稱取各類中藥破壁飲片50 mg，置于2.0 mL離心管中，加入2顆Φ 5 mm的滅菌鋼珠，用生物均質(zhì)儀(愛施德，Bioprep-24)以5.0 m·s-1震蕩30 s，重復(fù)震蕩2次，中間停頓30 s。DNA提取按照植物基因組DNA提取試劑盒(百泰克，DP3111)說明書進(jìn)行。以所得的DNA作為模板建立PCR體系：2×Power Taq PCR MasterMix(百泰克，PR1701)12.5 μL，正反向引物(ITS2引物：ITS2_2F,ATGCGATACTTGGTGTGAAT;ITS2_3R,GACGCTTCTCCAGACTACAAT。psbA-trnH引物：psbA_F，GTTATGCATGAACGTAATGCTC；trnH_R，CGCGCATGGTGGATTCACAATCC。)各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O補(bǔ)足體積至25.0 μL。溫度程序(ITS2)：94 ℃，4 min；94 ℃，30 s，52 ℃，30 s，72 ℃，45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃，5 min。溫度程序(psbA-trnH)：94 ℃，2 min；94 ℃，30 s，52 ℃，20 s，72 ℃，50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃，5 min。

反應(yīng)完成后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測各PCR產(chǎn)物，在目的區(qū)域出現(xiàn)清晰條帶的樣品則送樣測序。

2.2數(shù)據(jù)處理

將測序所得的原始峰圖導(dǎo)入CodonCode Aligner(Version 5.1.5.0)，拼接后去除低質(zhì)量區(qū)和引物區(qū)，并采用基于隱馬爾科夫模型的HMMer注釋方法分別去除5.8S rRNA和28S rRNA區(qū)以獲得ITS2序列；psbA-trnH片段則僅進(jìn)行引物區(qū)域裁切。將各樣品的ITS2序列和psbA-trnH序列作為Quary分別在NCBI上進(jìn)行序列比對(duì)；在中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)(http：//www.tcmbarcode.cn/china/index.php?optionid=174)上做比對(duì)，取同源性最高的比對(duì)結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

15個(gè)品種的中藥破壁飲片均能成功提取出基因組DNA，并可成功獲得ITS2片段(見圖2)；其中有13個(gè)品種可以擴(kuò)增得到psbA-trnH片段(見圖3)。

圖2 15個(gè)品種的中藥破壁飲片的ITS2片段PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖3 15個(gè)品種的中藥破壁飲片的psbA-trnH片段PCR擴(kuò)增結(jié)果

3.1ITS2鑒定結(jié)果

各樣品的ITS2序列比對(duì)結(jié)果見表2。利用ITS2片段可以成功鑒定出本研究的15個(gè)品種的中藥破壁飲片。決明子的ITS2序列中202位點(diǎn)為A-G變異；玫瑰花ITS2序列中20位點(diǎn)為C-A變異；其余各樣品的ITS2序列均與公共數(shù)據(jù)庫中已有序列的同源性達(dá)到100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ITS2可以用于本研究的15個(gè)品種的中藥破壁飲片的物種鑒定。

表2 15種中藥破壁飲片的ITS2序列比對(duì)結(jié)果

3.2psbA-trnH鑒定結(jié)果

本研究的15個(gè)品種的中藥破壁飲片中，紅參與玫瑰花均無法擴(kuò)增得到psbA-trnH片段；另外13個(gè)品種的psbA-trnH序列比對(duì)結(jié)果見表3。北沙參的psbA-trnH序列比對(duì)結(jié)果為傘形科植物白芷Angelicadahurica(同源性99.5%)；但目前尚未有關(guān)于北沙參psbA-trnH的鑒別報(bào)道，且NCBI數(shù)據(jù)庫中尚未有關(guān)于北沙參原植物珊瑚菜Glehnialittoralis的psbA-trnH序列信息。因此，本研究獲得的序列應(yīng)為北沙參原植物珊瑚菜G.littoralis的psbA-trnH序列，但與白芷的psbA-trnH序列相似度接近100%，無法相互區(qū)別，說明psbA-trnH不適合用于北沙參及其混偽品的鑒定。羅布麻葉的psbA-trnH序列比對(duì)結(jié)果為同屬植物Apocynumandrosaemifolium(分布于北美洲)，目前亦未有羅布麻葉的psbA-trnH鑒定報(bào)道，NCBI數(shù)據(jù)庫中尚未有關(guān)于羅布麻A.venetum的psbA-trnH序列信息。因此，本研究獲得的序列應(yīng)為羅布麻A.venetum的psbA-trnH序列。另外，三七的psbA-trnH序列在中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)比對(duì)結(jié)果為羽葉三七Panaxjaponicasvar.bipinnatifidus(同源性97.3%)；而在NCBI的比對(duì)結(jié)果則為三七P.notoginseng(同源性100%)，說明中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)中可能沒有三七的psbA-trnH序列。

表3 13種中藥破壁飲片的psbA-trnH序列比對(duì)結(jié)果

4 討論

本研究的15個(gè)品種中藥破壁飲片均可利用ITS2進(jìn)行物種鑒定；而psbA-trnH則有部分品種不適用的情況。這說明了ITS2作為通用性較好的主要DNA條形碼，對(duì)于本研究的這些大宗常用藥材的鑒定可行性很高。

許多中藥材的炮制過程涉及高溫處理。而高溫處理常常會(huì)造成DNA的進(jìn)一步降解，進(jìn)而影響DNA條形碼鑒定的實(shí)驗(yàn)成功率。本研究的實(shí)驗(yàn)材料中，有部分品種的炮制過程包含了高溫處理，如北沙參需用沸水燙，當(dāng)歸和菊花經(jīng)過烘干，而紅參需蒸透。但是從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，這些品種的ITS2鑒別并不存在問題。因此，高溫處理對(duì)于DNA鑒別是否造成必然影響，需視具體情況而定。

中藥破壁飲片是一類創(chuàng)新型的中藥飲片。藥材的細(xì)胞壁被打破后，使得藥材失去細(xì)胞和組織特征；但卻在另外三個(gè)方面獲得優(yōu)勢：1)增加有效物質(zhì)的溶出；2)提高藥材的均勻性；3)有利于DNA的提取。近年來，越來越多的藥理藥效學(xué)研究結(jié)果表明中藥破壁飲片相對(duì)于傳統(tǒng)飲片具有更好的安全性和有效性[13-16]。本文的研究則是從質(zhì)量控制方面做出一次有意義的探索——利用DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行中藥破壁飲片的物種鑒定，進(jìn)一步為中藥破壁飲片的臨床安全使用提供有力的保障。

中藥材的DNA條形碼鑒別是一項(xiàng)非常有意義的技術(shù)，本研究是DNA條形碼在中藥破壁飲片物種鑒定中的初步應(yīng)用探索。DNA條形碼在中藥產(chǎn)業(yè)化的普及應(yīng)用前，盡可能多地完善中藥材不同DNA條形碼片段的序列信息，是一項(xiàng)不可避免且亟待解決的問題。

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ApplicationofDNABarcodingTechnologyinSpeciesIdentificationofUltrafineGranularPowderofHerbalMedicine

ZHENGXiasheng，LAIZhitian，CHENGJinle*

(TheKeyLaboratoryofTechnologyofBreakingCellWallandApplicationinChineseMedicineDecoctionPieces，ZhongshanZhongzhiPharmaceuticalGroup，Zhongshan528437，China)

Objective：To establish a species identification method for Ultrafine Granular Powder of Herbal Medicine by DNA barcode.Methods：The genome DNA of15different kinds of Ultrafine Granular Powder of Herbal Medicine were extracted，and then applied to species identification by DNA barcode with two DNA fragments，ITS2andpsbA-trnH.Results：ITS2could successfully identify all the15samples，whilepsbA-trnHfailed to identify several samples.Conclusion：The results indicate that the technology of DNA barcoding is suitable for species identification of Ultrafine Granular Powder of Herbal Medicine.In addition，the strategy of identifying species using ITS2fragment，with thepsbA-trnHfragment as a supplement，was proved to be correct and feasible.Moreover，sequences information ofpsbA-trnHfragments of the datasets might be insufficient.It needs to be supplemented with more species sequences，so as to provide more comprehensive references for species identification work.

Ultrafine Granular Powder of Herbal Medicine；species identification;DNA Barcoding;ITS2;psbA-trnH

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.7.010

2015-09-25)

*

成金樂，教授，研究方向：創(chuàng)新中藥研究與開發(fā)；Tel：(0760)85312928，E-mail：gdcjl9@126.com