孫京海，潘晴，李凌軍，馬魯豫

(1.濟(jì)南市婦幼保健院，山東 濟(jì)南 250001；2.山東省皮膚病性病防治研究所,山東 濟(jì)南 250022；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；4.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250001)

女貞子中齊墩果酸含量測(cè)定及促進(jìn)葡萄糖消耗體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究△

孫京海1，潘晴2，李凌軍3，馬魯豫4*

(1.濟(jì)南市婦幼保健院，山東 濟(jì)南250001；2.山東省皮膚病性病防治研究所,山東 濟(jì)南250022；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南250355；4.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南250001)

目的：測(cè)定10批不同批次女貞子中齊墩果酸含量，并對(duì)女貞子醇提物的降血糖作用進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究。方法：用10倍量70%乙醇水溶液提取1h，提取多次，直至最后一次提取液中檢測(cè)不到齊墩果酸含量，合并多次提取液，濃縮，通過(guò)HPLC法測(cè)定10批次不同產(chǎn)地女貞子中齊墩果酸的含量；用人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞來(lái)研究女貞子醇提物的降糖作用。結(jié)果：不同批次女貞子中齊墩果酸的含量有一定差異，含量不得低于0.50%；不同濃度的女貞子醇提液均有促進(jìn)細(xì)胞消耗葡萄糖的作用，且在一定范圍內(nèi)隨濃度升高而增強(qiáng)。結(jié)論：女貞子藥材的醇提物具有促進(jìn)葡萄糖消耗的作用，值得進(jìn)一步研究推廣。

女貞子；齊墩果酸；葡萄糖消耗

女貞子為木犀科植物女貞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果實(shí)，其味甘、苦，性涼，歸肝、腎經(jīng)。其用藥歷史悠久，被《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品，有滋補(bǔ)肝腎、明目烏發(fā)的功能?，F(xiàn)代藥理研究表明女貞子具有保肝、增強(qiáng)免疫、抗氧化、抗衰老、抗癌、抗炎抑菌、降血糖、血脂等藥理作用[1-4]。

近年來(lái)，隨著人們生活水平的不斷提高，高血糖的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，且逐漸有年輕化趨勢(shì)[5]。當(dāng)血糖值高過(guò)規(guī)定的水平時(shí)就會(huì)形成高血糖癥。女貞子具有降血糖的功效，據(jù)報(bào)道，其藥效成分主要為齊墩果酸[6]。本研究用HPLC測(cè)定了10批女貞子中齊墩果酸的含量，用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的方法研究女貞子提取物的降糖作用。

1 儀器與材料

1.1儀器

D2000日立高效液相色譜儀，KQ-250E型超聲波清洗儀(江蘇省昆山市超聲儀器有限公司)，AE240型電子分析天平(上海市安亭電子儀器廠)，細(xì)胞培養(yǎng)板、CO2培養(yǎng)箱(無(wú)錫久平儀器有限公司)，超凈工作臺(tái)，倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀。

1.2材料

10批女貞子(濟(jì)南漱玉平民大藥房)，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李寶國(guó)副教授鑒定為木犀科植物女貞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果實(shí)。

齊墩果酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：20130416)，甲醇(色譜純)，乙腈(色譜純)，乙醇(95%分析純)，磷酸(分析純)，娃哈哈純凈水，HepG2細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)研究所)，DMEM低糖培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基(上海創(chuàng)賽科學(xué)儀器有限公司)，胎牛血清FBS、PBS洗液、胰酶(TrypsinEDTA)、葡萄糖測(cè)定試劑盒(南京建成科技有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1含水量與雜質(zhì)含量測(cè)定

按《中華人民共和國(guó)藥典》2010版方法測(cè)定10批女貞子藥材的含水量與雜質(zhì)含量。結(jié)果如表1所示。其中山東濟(jì)寧產(chǎn)女貞子的含水量最高為8.7%，

表1 10批不同產(chǎn)地女貞子雜質(zhì)含量與含水量

高于《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的8%，為排除含水量對(duì)齊墩果酸含量測(cè)定的影響，提取前均將藥材烘干至恒重。雜質(zhì)含量符合《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的不超過(guò)3%。

2.2含量測(cè)定

2.2.1色譜條件 色譜柱為DiamonsilC18(250mm×4.6mm，5μm)；以甲醇-乙腈-水-磷酸(50∶40∶10∶0.03)為流動(dòng)相；紫外檢測(cè)器檢測(cè)；檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm；柱溫：30℃；流速：1.0mL·min-1。齊墩果酸對(duì)照品及女貞子樣品色譜圖見(jiàn)圖1。

注：A.齊墩果酸對(duì)照品；B.女貞子樣品。圖1 齊墩果酸對(duì)照品及女貞子樣品色譜圖

2.2.2繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱定干燥至恒重的齊墩果酸對(duì)照品16.33mg，加入乙醇(分析純)定容至10mL容量瓶中，分別進(jìn)樣1、5、10、15、20、30μL，按照2.2.1中色譜條件測(cè)定，以峰面積A(Y)對(duì)齊墩果酸質(zhì)量m(X)進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程Y=5×108X+2.9×105，r=0.9996(n=6)，線性范圍為1.633～48.99μg。

2.2.3供試品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的女貞子藥材粉末(過(guò)40目篩)5g，用70%乙醇水溶液浸泡30min后，10倍量70%乙醇水溶液提取1h，提取多次，直至提取液中檢測(cè)不出齊墩果酸，合并提取液濃縮，蒸干，用乙醇(95%分析純)定容至100mL容量瓶。

2.2.4精密度試驗(yàn) 分別精密吸取線性范圍內(nèi)高、中、低3種不同濃度的對(duì)照品溶液20μL，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得峰面積的RSD值，分別為0.07%、0.40%、0.43%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.2.5重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次供試品6份，按相同的方法制備供試品溶液，分別吸取20μL進(jìn)樣，測(cè)定齊墩果酸的含量，計(jì)算RSD=4.027%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

2.2.6回收率試驗(yàn) 取線性范圍內(nèi)已知含量的供試品6份，每份分別精密加入高、中、低3種劑量的對(duì)照品，按供試液制備方法制備，測(cè)定女貞子中齊墩果酸的含量，計(jì)算平均回收率以及RSD值。結(jié)果如表2所示。

表2 女貞子中齊墩果酸回收率試驗(yàn)

2.2.7 樣品的測(cè)定 取上述10批女貞子藥材，按2.2.3項(xiàng)下制備供試品溶液，精密吸取各供試品溶液10 μL，進(jìn)樣測(cè)定樣品中齊墩果酸含量，每批藥材平行試驗(yàn)2次，結(jié)果取均值，見(jiàn)表3。

表3 10批女貞子中齊墩果酸含量(n=2)

3 齊墩果酸促進(jìn)葡萄糖消耗作用研究

肝臟是人體內(nèi)物質(zhì)的代謝中心，在糖代謝的過(guò)程中也起著至關(guān)重要的作用，它既是利用葡萄糖又是產(chǎn)生葡萄糖的主要器官。人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞雖然是一種癌細(xì)胞，但它起源于肝臟并且基本具有正常肝細(xì)胞的生物特性，所含的生物轉(zhuǎn)化代謝酶與人正常肝細(xì)胞具有同源性，分化程度較高，并且保留了較完整且活性穩(wěn)定的生物轉(zhuǎn)化代謝酶[7-8]。故本研究用人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞來(lái)研究齊墩果酸的促進(jìn)葡萄糖消耗作用。

3.1細(xì)胞培養(yǎng)

將經(jīng)復(fù)蘇的HepG2細(xì)胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，于5%CO2、37℃環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，48h更換一次培養(yǎng)液。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)達(dá)80%后開(kāi)始傳代培養(yǎng)，每隔2d傳代1次，用于實(shí)驗(yàn)。

3.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及結(jié)果

當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至一定濃度后，將DMEM低糖培養(yǎng)基換成DMEM高糖培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h以后，取生長(zhǎng)狀況較好的細(xì)胞，用PBS洗液清洗，經(jīng)胰酶消化懸浮后接種于96孔板中，每孔加入細(xì)胞懸液100μL，先用移液槍將吹打均勻的細(xì)胞吸起來(lái)，然后槍頭緊貼孔的一側(cè)壁(槍頭勿接觸孔底)，緩緩地把細(xì)胞注入，每孔復(fù)6孔，MTT法測(cè)定細(xì)胞數(shù)量。待細(xì)胞充分貼壁后，棄去原來(lái)的培養(yǎng)基，每孔加入200μL高糖的DMEM培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)設(shè)置7組，5個(gè)加藥組，藥物質(zhì)量濃度分別為100、200、300、400、500μg·mL-1，1個(gè)空白對(duì)照組，1個(gè)含1μg·mL-1二甲雙胍的陽(yáng)性藥對(duì)照組。培養(yǎng)24h后，用葡萄糖試劑盒測(cè)定培養(yǎng)液中葡萄糖含量?？瞻卓椎暮橇繙p去接種細(xì)胞孔的含糖量，即各孔細(xì)胞的葡萄糖消耗量(GC)。各組細(xì)胞的葡萄糖攝取率情況如圖2所示。

圖2 各組細(xì)胞葡萄糖攝取率

由結(jié)果可知，不同質(zhì)量濃度的女貞子提取液均有促進(jìn)細(xì)胞消耗葡萄糖的作用，300μg·mL-1組的降糖效果接近二甲雙胍組，加藥組開(kāi)始隨著加藥量的增加，降糖效果增強(qiáng)，增加到一定程度后，降糖效果增加的不顯著，反倒開(kāi)始減弱。

HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗試驗(yàn)結(jié)束后，加入20μL5g·L-1的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)液，加入DMSO與細(xì)胞混勻，震蕩5～10min，用酶標(biāo)儀于570nm處測(cè)光密度度值，用光密度值來(lái)反映細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。結(jié)果顯示，空白對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)速度最快；女貞子粗提物加藥組，起初隨著濃度增加細(xì)胞增長(zhǎng)速度加快，直至濃度300μg·mL-1，此后隨著加藥濃度增加，細(xì)胞增殖速度減緩，但是不明顯，由此可知女貞子粗提物并沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性；二甲雙胍組的細(xì)胞生長(zhǎng)情況與400μg·mL-1女貞子粗提物加藥組相似。

4 討論

女貞子的醇提物具有一定的降糖功效，其主要藥效成分為齊墩果酸，本研究探討了10批不同產(chǎn)地女貞子的齊墩果酸的含量情況，可將齊墩果酸含量作為女貞子藥材新的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)充，并通過(guò)人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證女貞子醇提物的降糖功效。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)是體外藥理學(xué)一種理想的研究方法，具有周期短、易操作、便于檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。本研究采用的人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞，具有正常肝細(xì)胞的生物學(xué)特性，廣泛地用于藥理實(shí)驗(yàn)研究，也是研究降血糖作用的常用菌株。當(dāng)前，隨著人們生活水平提高，高血糖患者逐年增加，開(kāi)發(fā)降糖、不良反應(yīng)小的新藥變得尤為重要。

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DeterminationofContentOleanolicAcidinLigustriLucidiFructusbyHPLCandItsEffectonPromotingtheGlucoseConsumptioninvitro

SUNJinghai1，PANQing2，LILingjun3，MALuyu4*

(1.JinanMaternalandChildCareHospital，Jinan250001，China;2.ShandongProvincialInstituteofDermtovenereology,Jinan250022，China；3.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jinan250355，China；4.Shandongacademyofmedicalsciences，Jinan250001，China)

Objective：To measure the content of oleanolic acid in10different batches of Ligustri lucidi Fructus and study the hypoglycemic effect of the ethanol extract of Ligustri lucidi Fructusinvitro.Methods：Ligustri lucidi Fructus were extracted by10folds of70% ethanol,1h a time, and extracted several times until oleanolic acid was undetectable, the extracts were then merged and enriched. The content of oleanolic acid was determined by HPLC. The hypoglycemic effect of the ethanol extract of Ligustri lucidi Fructus was studied by human liver cancer cell HepG2cells.Results：The content of oleanolic acid of the different batches of Ligustri lucidi Fructus varied and was above0.50%. Different concentrations of extract showed the effect of promoting cells to use glucose, and the effect increased with the concentration within a certain scope.Conclusion：The ethanol extract of Ligustri lucidi Fructus has the effect of promoting the glucose consumption, it deserves for further study .

Ligustri lucidi Fructus; Oleanolic acid; glucose consumption

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.7.013

2015-04-19)

“十二五”重大新藥創(chuàng)制國(guó)家科技重大專項(xiàng)(2013ZX09103002-005)

*

馬魯豫，副研究員，研究方向：中藥新藥開(kāi)發(fā)；E-mail：maluyuyky@126.com