楊銘偉，剡根強(qiáng)，王靜梅，王樹(shù)杰，王 學(xué)

（1. 石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832003；2. 新疆西部牧業(yè)股份有限公司中心牛場(chǎng)，石河子 832000）

·研究論文·

牛支原體（新疆株）滅活疫苗的制備及犢牛免疫保護(hù)性評(píng)價(jià)

楊銘偉1，剡根強(qiáng)1，王靜梅1，王樹(shù)杰2，王 學(xué)2

（1. 石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832003；2. 新疆西部牧業(yè)股份有限公司中心牛場(chǎng)，石河子 832000）

為研發(fā)用于預(yù)防犢牛支原體肺炎及關(guān)節(jié)炎滅活油佐劑疫苗并評(píng)價(jià)其免疫效果，本研究采用牛支原體（Mycoplasma bovis，M.bovis）新疆分離株做為制苗菌株，經(jīng)牛支原體專用液體擴(kuò)大培養(yǎng)基培養(yǎng)后進(jìn)行膜分離濃縮、甲醛滅活，加入油佐劑乳化制備牛支原體滅活疫苗，經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安全性檢驗(yàn)及乳化效果檢測(cè)后進(jìn)行犢牛免疫效果測(cè)定。結(jié)果顯示，免疫組犢牛在二免后14 d，血清中M.bovis抗體達(dá)到0.465（OD450），3頭攻毒犢牛均保持良好的精神狀態(tài)且體溫變化不明顯，臨床癥狀綜合評(píng)分為3，肺臟解剖學(xué)及病理組織學(xué)觀察無(wú)異常，肺臟病變指數(shù)為2且肺臟中未分離回收到M.bovis；未免疫對(duì)照組犢牛同期血清M.bovis抗體為0.142（OD450），3頭攻毒犢牛均先后出現(xiàn)體溫升高、輕度咳喘、膿性鼻液、明顯消瘦等癥狀，臨床癥狀綜合評(píng)分為11，肺臟病變指數(shù)為17，肺臟尖葉、心葉及部分膈葉均表現(xiàn)明顯肝變，2頭犢牛表現(xiàn)胸膜與肺臟黏連，1頭犢牛整個(gè)尖葉廣泛分布黃白色蠶豆?fàn)畲笮乃佬越Y(jié)節(jié)，與自然感染病例相同，病理組織學(xué)觀察顯示肺泡腔和支氣管中有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管管壁充血、水腫，肺臟部分壞死灶呈均質(zhì)紅染，為典型的化膿性及壞死性肺炎變化，從病變肺組織中均分離回收到M.bovis。結(jié)果表明，本研究制備的牛支原體滅活疫苗給犢牛免疫后能產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答反應(yīng)，并能抵抗M.bovis感染所致的肺臟病變作用。

牛支原體；疫苗；犢牛；免疫保護(hù)；病理學(xué)

牛支原體（Mycoplasma bovis，M.bovis）是引起犢牛肺炎、關(guān)節(jié)炎和成年牛乳房炎的主要病原體之一。早在1961年牛支原體被鑒定為致乳腺炎的病原體，1976年首次被描述為引起呼吸道疾病的病因［1］，此后在不同國(guó)家與地區(qū)相繼暴發(fā)與流行，給全世界養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［2，3］。目前已經(jīng)證實(shí)M.bovis感染不僅導(dǎo)致牛肺炎、乳腺炎，還可導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎、角膜結(jié)膜炎、耳炎、生殖道炎、流產(chǎn)與不孕等多種疾病，并可引發(fā)免疫抑制［4-6］。由于M.bovis對(duì)多種抗生素已表現(xiàn)出耐藥性，并且與其他病原混合感染時(shí)，抗生素治療難以奏效，因此應(yīng)用疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防成為控制牛支原體病的主要措施之一。但目前除美國(guó)外，其他國(guó)家?guī)缀鯚o(wú)商品化疫苗應(yīng)用于牛支原體病的預(yù)防。美國(guó)雖然將一些商品化疫苗（包括2株預(yù)防牛支原體肺炎的疫苗Pulmo-GuardTMMpB和Myco-BacTMB，1株預(yù)防乳腺炎的疫苗MycomuneTM）應(yīng)用于牛群［7］，但目前還未見(jiàn)到任何文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)這些疫苗是否能有效控制牛支原體病的發(fā)生。

本研究采用課題組分離并鑒定的新疆分離株M.bovis［8］做為制苗菌株，制備牛支原體滅活油佐劑疫苗，通過(guò)對(duì)免疫及未免疫犢牛血清M.bovis抗體水平測(cè)定、攻毒后犢牛臨床癥狀觀察、肺臟病變指數(shù)統(tǒng)計(jì)及病理組織學(xué)觀察和肺臟組織牛支原體帶菌情況來(lái)評(píng)價(jià)疫苗的免疫效果，為疫苗的應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1　材料和方法

1.1試驗(yàn)菌株、培養(yǎng)基及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)室保存的M.bovis新疆分離株，2010年分離自新疆維吾爾自治區(qū)石河子市某牛場(chǎng)因肺炎及關(guān)節(jié)炎死亡的犢牛肺臟組織，經(jīng)特異性PCR鑒定和oppF基因測(cè)序分析鑒定為M.bovis［8］；牛支原體專用液體擴(kuò)大培養(yǎng)基由本課題組自主研發(fā)；牛支原體間接ELISA檢測(cè)試劑盒［9］由本實(shí)驗(yàn)室自主建立；犢牛為新西蘭進(jìn)口荷斯坦奶牛所產(chǎn)10～15日齡健康犢牛，由新疆西部牧業(yè)股份有限公司中心示范牛場(chǎng)提供。

1.2主要試劑及儀器設(shè)備 ISA 206佐劑購(gòu)自法國(guó)Seppic公司；間接ELISA牛支原體抗體檢測(cè)試劑由本實(shí)驗(yàn)室配制；膜分離設(shè)備購(gòu)自成都泓潤(rùn)科技有限公司。

1.3菌液擴(kuò)大培養(yǎng)及濃縮 將-80℃凍存的M.bovis菌株移入5 mL牛支原體專用液體擴(kuò)大培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2箱中培養(yǎng)3 d，按照1:10的體積比傳代3次，待生長(zhǎng)穩(wěn)定后做為種子菌液，按照1:10的體積比接種新鮮培養(yǎng)基置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中擴(kuò)大培養(yǎng)4 d，將培養(yǎng)物進(jìn)行膜分離濃縮，采用活菌計(jì)數(shù)法（colony-forming units，CFU）測(cè)定濃縮菌液濃度，菌落總數(shù)以 CFU/mL計(jì)，濃縮菌液經(jīng)0.4%甲醛滅活并進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)后做為M.bovis抗原懸液。

1.4牛支原體滅活疫苗的制備及檢測(cè) 牛支原體有效含量為108CFU/mL，牛支原體蛋白含量為2 mg/ mL。疫苗配制方法：油相（ISA 206佐劑）:水相（滅活牛支原體菌懸液）= 54:46（V/V）。ISA 206佐劑使用前經(jīng)121℃ 滅菌30 min。配苗前將兩相預(yù)熱至（31±1）℃，然后在攪拌狀態(tài)下（150 r/min）將水相緩慢滴加入油相佐劑中，滴加完畢后置恒溫震蕩培養(yǎng)箱30℃、200 r/min循環(huán)乳化30 min，迅速降溫10 min，4℃保存。疫苗先后經(jīng)無(wú)菌檢測(cè)、黏度檢測(cè)、離心檢測(cè)、穩(wěn)定性試驗(yàn)及小鼠安全性檢驗(yàn)合格后備用。

1.5疫苗免疫程序及抗體檢測(cè) 隨機(jī)選取10～15日齡健康犢牛20頭，其中免疫組10頭，未免疫對(duì)照組10頭。免疫組犢牛肌肉注射牛支原體滅活疫苗3 mL，間隔10 d以相同劑量二免。分別于首免前、二免前及二免后14 d無(wú)菌分離血清，應(yīng)用本課題組已建立的牛支原體間接ELISA方法檢測(cè)免疫犢牛血清抗體［9］。對(duì)照組注射等劑量生理鹽水，與免疫組犢牛在相同時(shí)間點(diǎn)采集血清測(cè)定其血清中M.bovis抗體。全部犢牛飼養(yǎng)于同一犢牛舍中，飼喂方式相同。

1.6攻毒保護(hù)試驗(yàn)與評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.6.1攻毒保護(hù)試驗(yàn) 隨機(jī)選取二免后21 d（42～45日齡）免疫組犢牛3頭和相近日齡未免疫對(duì)照組犢牛3頭，運(yùn)往實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室隔離飼養(yǎng)，所有犢牛飼養(yǎng)于同一室內(nèi)，地面鋪設(shè)清潔墊草。犢牛每天供給煮沸消毒后的鮮奶5～6 kg，同時(shí)補(bǔ)充犢牛全價(jià)顆粒飼料及優(yōu)質(zhì)苜蓿草，供其自由采食。攻毒前3 d每天測(cè)定并記錄每頭犢牛直腸體溫、采食及精神狀況，隨后每頭犢牛氣管注射M.bovis新鮮培養(yǎng)濃縮菌懸液3 mL（濃度為1.8×109CFU/mL），鼻腔滴注2 mL［10］。

1.6.2攻毒保護(hù)試驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.6.2.1臨床癥狀評(píng)分 攻毒后每天測(cè)定每頭犢牛體溫，繪制體溫變化曲線，觀察其精神狀態(tài)、食欲、糞便及呼吸表現(xiàn)，臨床癥狀評(píng)分指標(biāo)見(jiàn)表1。

1.6.2.2血清M.bovis抗體檢測(cè) 攻毒后7、21、28 d測(cè)定所有攻毒犢牛血清M.bovis抗體。

1.6.2.3肺臟病變指數(shù)評(píng)價(jià) 攻毒劑量及評(píng)價(jià)指標(biāo)參考文獻(xiàn)［10］。攻毒28 d后剖檢全部攻毒犢牛，觀察并記錄肺臟病理變化，肺臟病變?cè)u(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

1.6.2.4肺臟病理組織學(xué)觀察 采集每頭攻毒犢牛病變肺臟組織，置于4%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色鏡檢。

1.6.2.5病變肺組織M.bovis分離培養(yǎng)與PCR鑒定 采集每頭攻毒犢牛病變肺臟組織進(jìn)行M.bovis分離培養(yǎng)及PCR鑒定。

表1　攻毒犢牛臨床癥狀評(píng)分指標(biāo)Table 1 The standard of clinical symptoms in challenge experiment

表2　攻毒犢牛肺臟組織病理變化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 The standard of tissual lesion in challenge experiment

2　結(jié)果

2.1牛支原體滅活疫苗免疫犢牛后抗體檢測(cè) M.bovis血清抗體檢測(cè)參照文獻(xiàn)［9］進(jìn)行，結(jié)果顯示，犢牛在經(jīng)免疫免疫后M.bovis血清平均抗體水平（OD450=0.465）顯著高于未免疫組（OD450=0.142），免疫組與對(duì)照組相比差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表3。

表3　牛支原體血清抗體檢測(cè)結(jié)果Table 3 Result of M.bovis antibody in serums of calves

2.2犢牛攻毒后臨床癥狀及體溫變化 整個(gè)攻毒期，免疫組犢牛精神良好、食欲旺盛，未出現(xiàn)流鼻涕、咳喘等明顯呼吸道癥狀（表4），體溫波動(dòng)范圍較小，臨床癥狀綜合評(píng)分為3；未免疫組犢牛在攻毒后d2均表現(xiàn)體溫明顯升高，最高體溫為40.3℃，1周后表現(xiàn)輕度咳嗽、流涕、厭食、腹瀉，2周后被毛凌亂、明顯消瘦，流膿性鼻液，咳嗽頻繁，其中1頭犢牛食欲廢絕，臥地不起，呼吸困難。攻毒期間未免疫組犢牛出現(xiàn)較大范圍的體溫波動(dòng)（圖1），臨床癥狀綜合評(píng)分為11，與免疫組犢牛差異明顯。

表4　攻毒犢牛臨床特征得分Table 4 Clinical assessment of calves vaccinated with M.bovis

圖1　攻毒后犢牛體溫變化Fig. 1 The temperature fl uctuations of the calves vaccinated with M.bovis

2.3攻毒犢牛肺臟病理解剖學(xué)變化 將免疫組犢牛和未免疫組犢牛（共計(jì)6頭）在攻毒28 d后全部放血致死，觀察并統(tǒng)計(jì)兩組犢牛肺臟病變指數(shù)。結(jié)果表明免疫組犢牛肺臟全部正常，呈粉紅色，無(wú)任何病變，見(jiàn)圖2-D。未免疫組3頭犢牛肺臟均出現(xiàn)廣泛的病變區(qū)，1頭犢牛肺臟與胸膜發(fā)生不同程度粘連，有少量液體積聚（見(jiàn)圖2-A、2-B）；2頭犢牛肺尖葉、心葉及部分膈葉的局部紅色肝變（見(jiàn)圖2-A、2-C），其中1頭犢牛整個(gè)尖葉廣泛分布有蠶豆大小的黃白色結(jié)節(jié)狀壞死灶，與自然病例極為相似，如圖2-E所示。未免疫組犢牛的肺臟損傷情況明顯高于免疫組犢牛（表5）。

圖2　攻毒后犢牛肺臟組織病理變化Fig. 2 The pathological change of lung tissue from calves vaccinated with M.bovis

表5　攻毒后犢牛肺臟損傷統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 5 Histological examination of lung damage in calves

2.4攻毒犢牛肺臟病理組織學(xué)變化 肺病理切片觀察顯示，免疫組犢牛肺臟組織結(jié)構(gòu)清晰可辨，肺泡結(jié)構(gòu)完整，且肺泡囊內(nèi)無(wú)異物，如圖3-A、3-B。未免疫對(duì)照組肺臟組織表現(xiàn)出不同程度的病理?yè)p傷：細(xì)支氣管管壁充血、水腫，并有較多的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，管壁增厚；細(xì)支氣管粘膜上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落，官腔內(nèi)聚集多量的漿液性滲出物，如圖3-C、3-D所示；肺泡壁略微增厚，肺泡腔中充滿大量中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、多核巨細(xì)胞及壞死脫落的上皮細(xì)胞（見(jiàn)圖3-E）；在殘存的正常肺泡中，出現(xiàn)大量中性粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞融合成多核巨細(xì)胞并開(kāi)始吞噬壞死的中性粒細(xì)胞（見(jiàn)圖3-F）；肺部出現(xiàn)較大均質(zhì)紅染的壞死灶，壞死灶周圍有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)并由成纖維細(xì)胞、纖維細(xì)胞構(gòu)成的結(jié)締組織包囊，與包囊相鄰的肺泡發(fā)生萎縮（見(jiàn)圖3-G、3-H）。

攻毒后病理解剖與病理組織學(xué)變化表明，免疫組犢牛肺臟組織損傷程度明顯低于未免疫組，證明研制的牛支原體滅活油佐劑疫苗可有效預(yù)防犢牛支原體肺炎的發(fā)生。

圖3　攻毒后犢牛肺臟組織病理組織學(xué)觀察（HE染色）Fig. 3 Histopathological observation of lung tissue from calves vaccinated with M.bovis （HE stain）

2.5攻毒犢牛血清牛支原體抗體水平變化 免疫組犢牛在首免后10 d血清中即可檢測(cè)到抗體，在隨后的二免及攻菌階段一直保持較高水平；未免疫組（對(duì)照組）在攻菌后7 d雖表現(xiàn)出抗體水平上升，但遠(yuǎn)低于免疫組抗體水平。不同階段血清抗體水平變化規(guī)律如圖4所示。

圖4　攻毒后犢牛血清支原體抗體水平變化規(guī)律Fig. 4 Dynamic change of antibody againast M.bovis from calves serum after challenge

2.6攻毒犢牛肺組織牛支原體分離結(jié)果 攻毒28 d后，將6頭犢牛宰殺，無(wú)菌采集肺臟組織，經(jīng)研磨后分別接種于牛支原體液體培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)。結(jié)果顯示免疫組3頭犢牛未分離到M.bovis，而未免疫組均分離到M.bovis，初步揭示免疫犢牛具有抵抗侵入體內(nèi)病原體繁殖及清除病原體的能力。

3　討論

我國(guó)研究者黎濟(jì)申等［11］1983年首次從患乳腺炎的牛乳中分離到牛支原體。2008年辛九慶等［12］在國(guó)內(nèi)首次從患肺炎的肉犢牛肺臟中分離得到牛支原體。自2008年開(kāi)始，我國(guó)部分地區(qū)的肉牛及奶牛場(chǎng)先后暴發(fā)了由M.bovis引起的以壞死性肺炎為主要特征的“傳染性牛支原體肺炎”疫情，隨后相繼在湖北省、貴州省、寧夏省、內(nèi)蒙古自治區(qū)、廣西壯族自治區(qū)、新疆維吾爾自治區(qū)、重慶市等地區(qū)發(fā)現(xiàn)該病，發(fā)病率為50%～100%，病死率高達(dá)10%～50%［13］。李巖等［14］對(duì)新疆9個(gè)地區(qū)15個(gè)規(guī)?；?chǎng)牛支原體感染的調(diào)查表明，陽(yáng)性率為100%，說(shuō)明牛支原體感染已成為影響?zhàn)B殖業(yè)發(fā)展的重要疫病，因此開(kāi)發(fā)有效疫苗和高效藥物已成為行業(yè)關(guān)注的重要課題。

免疫預(yù)防是控制牛支原體病的有效手段之一，但目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)用于該病的商品化疫苗［15］。本研究在開(kāi)展新疆主要規(guī)?；?chǎng)M.bovis感染調(diào)查的基礎(chǔ)上，采用自本地區(qū)M.bovis分離株做為制苗菌株，通過(guò)自主研究建立的擴(kuò)大培養(yǎng)及抗原濃縮工藝制成牛支原體滅活油佐劑苗，免疫懷孕母牛及犢牛后可產(chǎn)生良好的抗體應(yīng)答，無(wú)不良反應(yīng)。免疫犢牛攻毒保護(hù)結(jié)果表明，該疫苗可有效抵抗M.bovis的感染，消除或緩解M.bovis感染后對(duì)犢牛肺臟的損傷作用，可作為防控規(guī)模化牛場(chǎng)牛支原體病的免疫制劑。由于本研究重點(diǎn)針對(duì)新疆地區(qū)規(guī)?；膛?chǎng)牛支原體病的防控，制苗菌株為新疆分離株，該疫苗是否對(duì)其他地區(qū)分離株具有保護(hù)作用目前尚不清楚。

疫苗免疫保護(hù)試驗(yàn)是評(píng)定疫苗免疫效力唯一可信的方法。由于M.bovis引起的犢牛肺炎屬近年來(lái)新發(fā)動(dòng)物傳染病，國(guó)內(nèi)外有關(guān)M.bovis人工感染模型的研究報(bào)道較少，在攻毒保護(hù)試驗(yàn)中，如何選擇動(dòng)物的品種、日齡、感染劑量、途徑以及評(píng)價(jià)指標(biāo)等均缺乏可供參考的依據(jù)。本研究根據(jù)新疆犢牛M.bovis肺炎的流行特點(diǎn)，選擇對(duì)該病易感的40～45日齡荷斯坦奶牛，以生物有效含量明顯高于疫苗抗原含量的M.bovis新鮮培養(yǎng)物（1.8×109CFU/mL）做為感染劑量，仿照M.bovis肺炎呼吸道自然感染的途徑采用鼻黏膜滴注及氣管注射進(jìn)行人工感染，選擇以臨床癥狀、靶器官病變指數(shù)、病理組織學(xué)變化、感染病原體在靶器官的定居及抗體動(dòng)力學(xué)5個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目作為疫苗免疫保護(hù)試驗(yàn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)［7］。結(jié)果表明，選用的評(píng)定指標(biāo)具有一定的借鑒意義，能夠較客觀地反應(yīng)疫苗的免疫效力。由于此次攻毒屬于探索性研究，初衷是在確定疫苗免疫效果的同時(shí)，研究建立較為科學(xué)的牛支原體疫苗免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)的方法。因此，有關(guān)疫苗最終的保護(hù)性評(píng)價(jià)還需進(jìn)行一定規(guī)模的犢牛免疫保護(hù)試驗(yàn)加以確定。

本研究中人工感染未免疫犢牛雖表現(xiàn)體溫變化、典型呼吸道癥狀及較典型的肉眼可見(jiàn)肺部病理變化及病理組織學(xué)變化，但未出現(xiàn)自然死亡，究其原因可能與攻毒后犢牛的飼養(yǎng)環(huán)境及飼養(yǎng)管理有關(guān)。攻毒犢牛飼養(yǎng)室溫度均衡，晝夜溫差小，通風(fēng)良好，人工飼喂鮮牛奶，全價(jià)顆粒料及優(yōu)質(zhì)苜蓿草供其自由采食，每隔2 d更換墊草并進(jìn)行環(huán)境消毒，為犢牛提供了一個(gè)良好的圈舍環(huán)境及足夠的營(yíng)養(yǎng)需求，使其抗病能力增強(qiáng)，繼發(fā)感染的機(jī)會(huì)較少。這一結(jié)果間接說(shuō)明，改善犢牛飼養(yǎng)環(huán)境，提供優(yōu)質(zhì)日糧，可降低犢牛感染M.bovis的發(fā)病率與病死率。而要建立人工感染模型并進(jìn)行疫苗免疫保護(hù)試驗(yàn)需選擇與自然發(fā)病犢牛相似的牛場(chǎng)環(huán)境中，但可能存在抗原擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)。

有關(guān)牛支原體致病與免疫機(jī)制尚未見(jiàn)研究報(bào)道。本研究中，免疫和未免疫組犢牛在人工感染M.bovis后28 d，3頭免疫犢牛肺臟組織中未檢出M.bovis，而未免疫犢牛均檢測(cè)出M.bovis，表明免疫犢牛所產(chǎn)生的特異性抗體發(fā)揮了作用，抗體與支原體結(jié)合后可能激活補(bǔ)體和激活巨噬細(xì)胞，從而發(fā)揮殺滅支原體作用［16］，但免疫犢牛是如何清除牛支原體的明確機(jī)制還需進(jìn)一步研究探明。

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DEVELOPMENT AND EVALUATION OF INACTIVATED MYCOPLASMA BOVIS VACCINE IN CALVES

YANG Ming-wei1， YAN Gen-qiang1， WANG Jing-mei1， WANG Shu-jie2， WANG Xue2

（1. College of Animal Science and Technology， Shihezi University， Shihezi 832003， China； 2. Xinjiang Western Animal Husbandry Co.，Ltd. Shiheizi 832000， China）

The objective of the present study was to prepare Mycoplasma bovis vaccine and evaluate its protective immunity in calves. The inactivated M. bovis vaccine was developed using a series of procedures including massive propagation of the bacterial strain isolated from Xinjiang Province in the home-made artifi cial media， separation and concentration of the cellular membranes， inactivation with formalin and emulsion in oil ajuvant. Then， the vaccine was tested for inactivation， emulsifying effect and safety in calves. The calves were observed for fever and other clinical signs and serological responses for 4 weeks before termination. The vaccine did not cause adverse effects in calves. Post challenge， the vaccinated calves showed few clinical signs while all unvaccinated calves developed pneumonia. There was a signifi cant decrease in body weight in unvaccinated calves as compared to vaccinates but a signifi cant increasein lung lesions and rectal temperatures in unvaccinated calves. In conclusion， the inactivated M. bovis vaccine produced a signifi cant protection against the virulent challenge.

Mycoplasma bovis； vaccine； calf； protective immunity； pathology

S852.62

A

1674-6422（2016）04-0052-07

2015-12-31

國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2012BAD43B02）

楊銘偉，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

剡根強(qiáng)，E-mail：ygq58@shzu.edu.cn