王春梅，林 析，張可煜，張麗芳，田玉柱，費陳忠，張曉曉，趙 娟，肖 遂，王霄旸，王 米，鄭文麗，薛飛群

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；2. 齊魯動物保健品有限公司，濟南 250100）

·研究論文·

抗球蟲新藥AC4在SD大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究

王春梅1，林 析1，張可煜1，張麗芳1，田玉柱2，費陳忠1，張曉曉1，趙 娟1，肖 遂1，王霄旸1，王 米1，鄭文麗1，薛飛群1

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；2. 齊魯動物保健品有限公司，濟南 250100）

本研究的目的是建立檢測SD大鼠血漿內(nèi)AC4的分析方法，考察高、中、低3個劑量的AC4在SD大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征，獲得主要的藥代動力學(xué)參數(shù)。采用超高液相色譜法檢測SD大鼠血漿內(nèi)AC4含量，使用乙酸乙酯作為提取溶劑，妥曲珠利亞砜作為內(nèi)標(biāo)。研究表明，建立的方法專屬性良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線定量范圍0.08～80 μg/mL，線性關(guān)系良好；準(zhǔn)確度和精密度均能達到檢測目的，樣品在室溫放置8 h或者反復(fù)凍融3次后穩(wěn)定；該方法靈敏、準(zhǔn)確，可以用于檢測SD大鼠血漿內(nèi)AC4含量。藥時曲線下面積和最大血藥濃度存在劑量正相關(guān)關(guān)系，給藥后4～5 h達到最大血藥濃度，生物消除半衰期在不同性別、不同劑量組之間存在較大差異，AC4在SD大鼠的藥動學(xué)存在較為明顯的性別差異。本研究結(jié)果為AC4后期研究和臨床合理應(yīng)用提供了參考依據(jù)。關(guān)鍵詞：AC4；SD大鼠；UPLC-UV；藥代動力學(xué)

雞球蟲病對養(yǎng)禽業(yè)危害嚴(yán)重，人們一直在尋求新型、高效、低毒的藥物對雞球蟲病進行防治。AC4是由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸研究醫(yī)所在地克珠利的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上合成并篩選出的一種新型三嗪類抗球蟲化合物。早期研究證實其使用劑量低，抗球蟲活性高，抗蟲譜廣，具有成為新型抗球蟲藥物的潛力［1］。最近研究顯示，AC4劑量為3 mg/kg·BW時，只觀察到少量卵囊和輕微病變，與對照組相比，AC4有顯著的增重作用；3 mg/kg·BW組球蟲活性與1 mg/kg·BW組地克珠利相同或更優(yōu)；AC4與地克珠利或妥曲珠利間沒有交叉耐藥性［2］?？梢?，AC4抗球蟲效果優(yōu)秀，具備廣闊的開發(fā)前景。

藥代動力學(xué)研究在新藥研發(fā)中占有重要地位，是藥物有效性和安全性研究的重要組成部分［3］。本研究擬建立可快速準(zhǔn)確檢測SD大鼠血漿內(nèi)AC4的UPLC-UV方法，對高、中、低3個劑量的AC4在SD大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)進行研究，獲得主要的藥代動力學(xué)參數(shù)，為AC4后續(xù)研究提供理論參考。

1　材料和方法

1.1儀器與試藥 超高效液相色譜儀串聯(lián)紫外檢測器（ACQUITYTMUPLC system）購自Waters公司；渦旋儀（G560E）購自Scientific Industries；數(shù)控超聲波清洗器（KQ-500DE型）購自昆山超聲儀器有限公司；高速離心機（CT15RE）購自Hitachi Koki Co，Ltd；冰箱（BCD-209S/EA）購自海信容聲冰箱有限公司；氮吹儀（N-Evap nitrogen evaporator）購自美國柏林公司；純水機（Direct-Pure Plus Water System）購自Rephile Bioscience，Ltd；電子天平（AE240，Mettler-Toledo）；微孔濾膜（SCAA-104）購自上海安譜科學(xué)儀器有限公司；AC4（純度98%）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸研究醫(yī)所獸用抗感染藥物創(chuàng)新團隊研制，批號：20140301；妥曲珠利亞砜（純度99.4%±0.2%）購自WTTEGA Laboratorien；乙腈、甲醇（HPLC級）購自Fisher；肝素鈉（效價≥130）、乙酸乙酯（分析純）、PEG200（化學(xué)純）均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2實驗動物 6周齡籠養(yǎng)SD大鼠168只，雌雄各半，體重180～220 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，雌雄SD大鼠分開飼養(yǎng)，飼料保證不含任何藥物，飲水充足。

1.3給藥和樣品采集 精確稱定AC4和PEG200，配制成1、2、10 mg/g AC4的PEG200溶液，分別作為低、中、高劑量。將84只雄鼠隨機分成3組，與低、中、高劑量相互對應(yīng)，灌服給藥前精確稱取對應(yīng)組AC4藥液，使給藥劑量為1 mg/kg·BW （低劑量組）、2 mg/kg·BW （中劑量組）、10 mg/kg·BW（高劑量組），給藥前12 h斷料，飲水正常。雌鼠給藥方式同雄鼠。

根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，采血點設(shè)置為0.5、1.5、3、4、5、8、12、24、36、48、72、96、120 h，采血方式為眼眶采血，采血量0.3～0.5 mL。由于采血點較密集，使用眼眶采血頻率太高會使大鼠眼部來不及修復(fù)，造成角膜炎、失明等多種問題，因此，本研究采取每組大鼠交替采血的方式，每個時間點包含7只大鼠的數(shù)據(jù)。在預(yù)定時間點采集血液樣品，放至含有肝素鈉的離心管中，500×g離心10 min，取上層血漿，-20℃保存待測。

1.4溶液配制

1.4.1AC4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 精確稱取50 mg AC4原料藥至25 mL容量瓶，加入約10 mL甲醇后，超聲使其完全溶解，待恢復(fù)至室溫時用甲醇定容，搖勻，配制成2000 μg/mL的貯備液。準(zhǔn)確移取AC4貯備液，用甲醇稀釋成0.4、0.8、2、8、40、40、200、800 μg/mL的AC4標(biāo)準(zhǔn)溶液，封口膜封口后于4℃冰箱保存。

1.4.2TSO標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 精確稱取5 mg TSO標(biāo)準(zhǔn)品至25 mL容量瓶，加入約10 mL甲醇后，超聲使其完全溶解，待恢復(fù)至室溫時用甲醇定容，搖勻，配制成200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4.3肝素鈉溶液配制 稱取肝素鈉40 mg，用去離子水20 mL配制成2 mg/mL的肝素鈉溶液。

1.5色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（Waters，2.1× 100 mm，1.7 μm），預(yù)柱為Van Guard BEH C18，1.7μm；A相為乙腈，B相為水，采用梯度洗脫方式（見表1），流速0.2 mL/min，柱溫30℃，檢測波長251 nm，進樣量10 μL，內(nèi)標(biāo)為妥曲珠利亞砜（TSO）。

表1　檢測SD大鼠血漿內(nèi)AC4含量的UPLC-UV方法梯度洗脫條件Table 1 The elution situation of the UPLC-UV method for the detection of AC4 in SD rat plamsa

1.6樣品前處理 取100 μL血漿樣品至1.5 mL尖頭離心管中，加入10 μL內(nèi)標(biāo)液后渦旋混勻，再加入1 mL乙酸乙酯，渦旋30 s后將離心管放至高速離心機，9600×g離心10 min，將上層有機相轉(zhuǎn)移至2 mL平頭離心管中，氮氣吹干，加入100 μL流動相（乙腈-水，24:76，V/V）復(fù)溶殘渣，渦旋30 s后過0.22 μm濾膜，進樣測定。

1.7方法學(xué)考察

1.7.1專屬性考察 專屬性也稱特異性，是指分析條件下區(qū)分待測物質(zhì)與干擾物質(zhì)的能力。本研究考察了空白樣品及空白樣品加藥的色譜圖，觀察在AC4 和TSO保留時間處有無雜峰干擾，從而判定專屬性是否良好。

1.7.2標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 在100 μL SD大鼠空白血漿中加入AC4標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成血藥濃度為0.08、0.2、0.8、4、20、80 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)樣品，每個濃度設(shè)5個平行，按照1.6中的方法處理這些樣品，按1.5中色譜條件進樣測定，記錄色譜圖中AC4和TSO峰面積，以AC4與TSO的比值作為橫坐標(biāo)，以樣品藥物濃度作縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7.3檢測限和定量限 檢測限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantification，LOQ）屬于靈敏度范疇，反映的是儀器的最小測量能力。

將AC4標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋到合適濃度后加入空白血漿中，按照1.6中的方法對樣品進行處理，按1.5中色譜條件進樣測定。以色譜圖中AC4峰信噪比（s/ n）≥3時的濃度作為檢測限，以信噪比（s/n）≥10時作為定量限。

1.7.4準(zhǔn)確度和精密度 取100 μL空白血漿，添加AC4標(biāo)準(zhǔn)溶液獲得高、中、低3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，低濃度在定量限附近，中濃度選標(biāo)準(zhǔn)曲線的中間濃度，高濃度選擇略低于標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點的濃度，每個濃度設(shè)5個平行。將制備的標(biāo)準(zhǔn)樣品按1.6中的方法處理，以1.5中的色譜條件進樣測定，樣品的相對回收率根據(jù)當(dāng)天制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算。

制備高、中、低三個濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品（濃度選擇同準(zhǔn)確度），每個濃度5個平行，按照1.6中方法處理后進樣測定，根據(jù)當(dāng)天制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算每個濃度實測值之間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，作為日內(nèi)精密度。按照上面所述方法連續(xù)處理檢測3 d，計算日間精密度。

1.7.5樣品穩(wěn)定性 制備兩組含藥濃度為2、20 μg/mL的血漿樣品。第一組血漿樣品經(jīng)室溫放置8 h后按照1.6中的方法處理并進樣測定，記錄AC4和TSO的峰面積；第二組血漿樣品置于-20℃冰箱保存24 h后取出自然解凍，完全解凍后再次將血漿樣品放至-20℃冰箱，如此重復(fù)3次后，將其按照1.6中的方法處理并進樣測定，記錄AC4和TSO的峰面積。將AC4/ TSO的值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，算出相對回收率。

1.8質(zhì)量控制 在低劑量和中劑量組樣品檢測過程中使用的質(zhì)控樣品濃度分別為0.2、2 μg/mL，在高劑量組樣品檢測過程中使用的質(zhì)控樣品濃度分別為0.8、20 μg/mL。

2　結(jié)果

2.1方法的專屬性 由圖1可知，在SD大鼠血漿樣品中，AC4和TSO出峰附近沒有雜峰干擾，專屬性良好。

2.2線性關(guān)系考察 按照1.7.2的方法制備標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。以AC4/TSO比值作為y，以樣品實際濃度作為x，計算得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.091x+0.001，R2=1，測量范圍在0.08～80 μg/mL之間，最低濃度點的相對回收率偏差在20%以內(nèi)，其他濃度點的相對回收率在15%以內(nèi)，該標(biāo)準(zhǔn)曲線合格。

圖1　AC4典型色譜圖Fig. 1 Typical chromatograms of AC4 in rat plasma samples

圖2　檢測大鼠血漿內(nèi)AC4的UPLC-UV分析法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 2 The standard curve of UPLC-UV method for AC4 detection in SD rat plasma

2.3檢測限和定量限 以AC4峰與噪音的比值（s/n）≥3時的濃度為檢測限，由此得到本檢測方法的檢測限為0.04 μg/mL；同理，以s/n≥10的濃度為定量限，得到本檢測方法的定量限為0.08 μg/mL。根據(jù)定量限應(yīng)該小于被測物在3～5個消除半衰期時或者最大血藥濃度的1/20～1/10的濃度，本方法符合要求。

2.4準(zhǔn)確度和精密度 本研究考察了0.2、2、60 μg/ mL3個濃度的準(zhǔn)確度和精密度，準(zhǔn)確度用相對回收率表示，精密度用RSD表示。相關(guān)數(shù)據(jù)如表2所示。

根據(jù)《獸藥化學(xué)藥物非臨床藥代動力學(xué)試驗指導(dǎo)原則》，回收率一般為85%～115%，定量限附近的回收率為80%～120%。對于6次重復(fù)測定的批內(nèi)變異系數(shù)，當(dāng)被測物濃度大于0.1 μg/mL時，應(yīng)小于10%；當(dāng)被測物濃度小于0.1 μg/mL時，應(yīng)小于20%。對于批間變異系數(shù)，定量限附近的濃度應(yīng)小于20%，其他濃度應(yīng)小于10%［4］。本分析方法經(jīng)過測試后，0.2 μg/mL時的回收率為97.56%～101.9%，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于5.51%；2 μg/mL時的回收率為98.63%～106.2%，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于6.36%；60 μg/mL時，回收率為101.8%～106.0%，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于3.00%，均符合指導(dǎo)原則要求。

表2 UPLC-UV法分析大鼠血漿樣品中AC4的準(zhǔn)確度和精密度Table 2 The recovery and precision results of the UPLC-UV method for detecting of AC4 in SD rat plasma

2.5 穩(wěn)定性試驗 2 μg/mL和20 μg/mL血漿樣品分別在室溫放置8 h和經(jīng)過3次凍融后的穩(wěn)定性顯示，在室溫放置8 h的平均相對回收率分別為98.7%和101.3%，表明血漿中的AC4至少在室溫放置8 h內(nèi)穩(wěn)定（表3）；經(jīng)過凍融3次后的平均相對回收率分別為101.4%和95.7%，表明含藥樣品經(jīng)過3次反復(fù)凍融是穩(wěn)定的（表4）。

表3 SD大鼠血漿加標(biāo)樣品室溫放置8 h后的穩(wěn)定性檢測Table 3 Stability of spiked SD rat plasma samples after storage for 8 h at room temperature

表4 SD大鼠血漿加標(biāo)樣品凍融3次后的穩(wěn)定性檢測Table 4 Stability of spiked SD rat plasma samples after three freeze-thaw cycles

2.6 平均血藥濃度-時間曲線 按照前面建立的UPLCUV分析方法，分別對雌雄SD大鼠低、中、高劑量組在給藥后不同時間點采集的樣品進行分析，分析過程中，嚴(yán)格按照1.8中的方法進行質(zhì)量控制，保證檢測數(shù)據(jù)的真實、可靠。低、中、高組的口服給藥劑量分別為1、2、10 mg/kg·BW，獲得的藥時曲線如圖3～5所示。

2.7 藥代動力學(xué)參數(shù) 利用藥動學(xué)數(shù)據(jù)處理軟件DAS3.0對血藥濃度-時間數(shù)據(jù)進行分析。結(jié)果顯示，雌鼠在低（1 mg/kg·BW）、中（2 mg/kg·BW）、高劑量（10 mg/kg·BW）的AUC（0-t）值分別為131.593、305.168、1764.100 mg/L·h，Cmax值為6.03、11.53、53.09 μg/mL（表5），可以看出藥時曲線下面積和最大血藥濃度均與給藥劑量呈正相關(guān)關(guān)系，藥時曲線下面積和最大血藥濃度在雌性SD大鼠體內(nèi)存在劑量依賴關(guān)系，同理得到，藥時曲線下面積和最大血藥濃度在雄性SD大鼠體內(nèi)也存在劑量依賴關(guān)系。

圖3　雌、雄SD大鼠低劑量組血藥濃度-時間曲線Fig. 3 The plasma concentration - time curve of female and male SD rat at a low-dose administration

圖4　雌、雄SD大鼠中劑量組血藥濃度-時間曲線Fig. 4 The plasma concentration - time curve of female and male SD rat at a middle-dose administration

圖5　雌、雄SD大鼠高劑量組血藥濃度-時間曲線Fig. 5 The plasma concentration - time curve of female and male SD rat at a high-dose administration

表5　雌雄SD大鼠高、中、低劑量組非房室模型統(tǒng)計矩參數(shù)Table 5 Non-compartmental model statistical moments parameters for SD rat after different doses administration

3　討論

三嗪類抗球蟲藥物的代表藥物是地克珠利和妥曲珠利，雖然地克珠利和妥曲珠利的抗球蟲機理不盡相同，但都具有廣譜、高效、低毒的特點，防治球蟲病效果優(yōu)異。隨著現(xiàn)代分析和檢測技術(shù)的發(fā)展，快速、簡便、高靈敏度和準(zhǔn)確度的檢測并可量化生物組織內(nèi)藥物的方法得以出現(xiàn)，為藥物在實驗動物體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究打下了基礎(chǔ)［5］。

地克珠利的特點是進入血液循環(huán)后能夠廣泛的分布至禽類或哺乳動物的組織，一般具有較長的半衰期，通過糞便加以消除。地克珠利毒性非常低，沒有遺傳毒性、致癌性、胚胎毒性或致畸性，并且不致突變［5］。

張可煜等［6］對44羽雛雞灌服地克珠利預(yù)混劑，分析實驗數(shù)據(jù)后得知地克珠利在雛雞體內(nèi)代謝符合一級吸收的二室模型，血藥濃度達峰時間為1.64 h，消除半衰期為24.29 h，屬于快吸收、慢消除的藥物。Dirikolu等［7］對口服劑量為2.5g/450 kg地克珠利的馬進行了初步的藥代動力學(xué)研究，結(jié)果顯示給藥后24 h時達到（1.077±0.174）μg/mL的峰濃度，平均半衰期為43 h，在馬體內(nèi)消除較慢。王國永等［8］研究了地克珠利在獺兔體內(nèi)的藥代動力學(xué)，發(fā)現(xiàn)地克珠利的藥時數(shù)據(jù)符合一級吸收的二室模型，但消除半衰期僅有8.8 h，表明藥物在不同種屬動物的藥動學(xué)參數(shù)具有差異性。

妥曲珠利以口服混懸劑的形式，可以對雞、火雞、豬和牛的球蟲病起到防治作用。藥理學(xué)研究表明，妥曲珠利在胃腸道能很好的被吸收［8］，迅速代謝成妥曲珠利砜和妥曲珠利亞砜。妥曲珠利砜在雞、火雞、犢牛的體內(nèi)消除緩慢，被認(rèn)為是妥曲珠利殘留的標(biāo)志［9］。

郭永剛等［10］對妥曲珠利在健康和球蟲感染肉雞體內(nèi)的藥動學(xué)進行了研究，灌服2.5%妥曲珠利溶液后，兩組的主要藥動學(xué)參數(shù)為：分布半衰期為（4.31±0.85）h和（4.29±1.03）h，消除半衰期為（23.81±2.81）h和（23.76±3.31）h，藥時曲線下面積為（174.15±34.09）μg·h/mL和（165.14±23.71）μg·h/mL，妥曲珠利的藥動學(xué)參數(shù)在健康和感染球蟲肉雞間無明顯差異，體內(nèi)代謝都屬于一級吸收二室開放模型。Kim等［11］研究了妥曲珠利和其兩個代謝產(chǎn)物妥曲珠利砜、妥曲珠利亞砜口服后在肉雞體內(nèi)的藥動學(xué)，結(jié)果表明妥曲珠利砜在肉雞體內(nèi)的消除（80.3 h±10.8 h）比妥曲珠利（10.6 h±1.2 h）和妥曲珠利亞砜（14.7 h±2.9 h）的消除要慢的多，這與Lim等［12］在豬體內(nèi)得到的妥曲珠利及其代謝產(chǎn)物的藥動學(xué)結(jié)果類似，妥曲珠利砜的長半衰期可能對妥曲珠利臨床應(yīng)用中持續(xù)的療效有所貢獻。除了對肉雞、豬體內(nèi)妥曲珠利的藥動學(xué)研究以外，在大鼠、家兔［13］、馬［14］、牛體內(nèi)的藥動學(xué)也已有研究報道，不同的藥動學(xué)數(shù)據(jù)表明種屬之間具有差異性。

本研究中藥物AC4也存在不同種屬之間的差異性。檢測到的生物消除半衰期參數(shù)，最短的為雌鼠低劑量組（15.825 h），最長的為雄鼠高劑量組（35.656 h）；AC4在雄鼠體內(nèi)的平均滯留時間要大過雌鼠，雌鼠平均滯留時間為20.279～26.627 h，雄鼠為27.562-33.912 h；達峰時間上，各組之間相差不大，均在4～5 h；高劑量組，雌鼠的藥時曲線下面積和最大血藥濃度均明顯比雄鼠大，表明三嗪類抗球蟲藥物在動物體內(nèi)的藥動學(xué)特征呈現(xiàn)出明顯的性別差異和種屬差異。

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PHARMACOKINETICS OF A NEW COCCIDOISTAT AC4 IN RATS

WANG Chun-mei1， LIN Xi1， ZHANG Ke-yu1， ZHANG Li-fang1， TIAN Yu-zhu2， FEI Chen-zhong1，ZHANG Xiao-xiao1， ZHAO Juan1， XIAO Sui1， WANG Xiao-yang1， WANG Mi1，ZHENG Wen-li1， XUE Fei-qun1

（1. Shanghai Veterinary Research Institute， CAAS， Shanghai 200241， China； 2. Qilu Animal Health Products Co.， Ltd， Jinan 250100，China）

The objective of the present study was to develop a measurement of AC4 within the plasmas of SD rats and examine the pharmacokinetics of AC4 in these animals. In the UPLC-UV method， ethylacetate was used as the extraction solvent and toltrazuril sulphoxide as an internal standard. The limits of detection and quantifi cation were 0.04 and 0.08 μg/mL， respectively. The line arrange of the standard curve was 0.08-80 μg/mL. In addition， the sample was stable after storage for 8 h at room temperature or 3 cycles of freezing and thawing. The method was sensitive， accurate and therefore suitable for detection of AC4 in SD rat plasma samples. In the pharmacokinetic study of AC4 in SD rats， doses of 0.45， 0.9 and 4.5 mg / kg·BW were examined in male and female SD rats. The results showed a dose-dependent manner of AUC and Cmax in both male and female SD rats. The AC4 peaked in the plasmas around 4 h post application. There were signifi cant differences of the biological elimination half-life of AC4 between genders and doses.

AC4； SD rat； UPLC-UV； pharmacokinetic

S859.795

A

1674-6422（2016）04-0064-08

2016-02-02

國家自然科學(xué)基金項目（31272607）；上海自然科學(xué)基金項目（14ZR1449000）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303038）

王春梅，女，博士，助理研究員，主要研究方向為藥物代謝動力學(xué)

薛飛群，E-mail：fqxue@shvri.ac.cn