劉麗娜，鐘乃鳳，王 赟，周 靜，張 潔

（貴州醫(yī)科大學(xué)生物與工程學(xué)院，貴陽(yáng) 550025）

·研究論文·

金黃色葡萄球菌疫苗候選抗原SirH和StbA及其抗血清的免疫保護(hù)作用研究

劉麗娜，鐘乃鳳，王 赟，周 靜，張 潔

（貴州醫(yī)科大學(xué)生物與工程學(xué)院，貴陽(yáng) 550025）

為研究金黃色葡萄球菌疫苗候選抗原SirH和StbA及其抗血清的免疫保護(hù)作用，分別用純化蛋白StbA、SirH以及甲醛滅活的金黃色葡萄球菌為免疫原免疫小鼠，收集抗血清，測(cè)定血清效價(jià)，然后用致死劑量的金黃色葡萄球菌攻擊，評(píng)價(jià)兩種抗原的免疫保護(hù)作用。分別用SirH和StbA抗血清免疫小鼠，4 h后用致死劑量的金黃色葡萄球菌攻擊，評(píng)價(jià)抗血清的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，StbA和SirH抗血清效價(jià)均為1：1 638 400。金黃色葡萄球菌攻擊主動(dòng)免疫小鼠，SirH純化蛋白免疫組（60%）和StbA純化蛋白免疫組（70%）存活率均明顯高于對(duì)照組（0%）（P＜0.05），金黃色葡萄球菌全菌免疫組（20%）存活率與對(duì)照組（0%）差異不具備顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。SirH純化蛋白免疫組（60%）和StbA純化蛋白免疫組（70%）存活率均高于金黃色葡萄球菌全菌免疫組（20%）。將抗血清免疫小鼠后，用金黃色葡萄球菌腹腔內(nèi)注射攻擊小鼠，免疫組小鼠16～18 h內(nèi)全部死亡，而對(duì)照組小鼠在攻毒后12～14 h內(nèi)全部死亡。結(jié)果表明，SirH和StbA是具有潛力的保護(hù)性抗原，但其抗血清都不具有保護(hù)作用。

金黃色葡萄球菌；疫苗抗原；抗血清；免疫保護(hù)

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA），是一種重要的人獸共患病原菌，也是奶牛乳腺炎最主要的致病菌之一［1］。奶牛乳腺炎是造成奶牛養(yǎng)殖業(yè)主要經(jīng)濟(jì)損失的疾病之一，患病奶?？沙霈F(xiàn)產(chǎn)奶量和奶質(zhì)量下降［2］。同時(shí)，攜帶毒素基因的金黃色葡萄球菌在適當(dāng)環(huán)境溫度、pH、介質(zhì)下可產(chǎn)生毒素，影響乳產(chǎn)品安全，危害人體健康［3］。曾有學(xué)者開展過金黃色葡萄球菌全菌滅活苗和減毒活菌苗研究，盡管這兩種疫苗能使免疫宿主的相應(yīng)抗體水平顯著升高，但是抗體的存在并不能起到有效的保護(hù)作用［4］，而且全菌苗抗原成份多，除保護(hù)性抗原外，還有許多不相關(guān)和有毒的成份，毒副反應(yīng)較大。DNA 疫苗和亞單位疫苗聯(lián)合使用可引起奶牛明顯的細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)［5］，但是導(dǎo)入的外源DNA 有整合到宿主基因組DNA的潛在危險(xiǎn)［6，7］?；蚬こ虂唵挝灰呙缇哂薪M分清楚、安全性好、技術(shù)成熟、便于產(chǎn)業(yè)化等優(yōu)點(diǎn)，已有較多以莢膜多糖或毒力因子作為抗原開展單組份疫苗研究的報(bào)道，但這些疫苗保護(hù)力有限［8］，而且不同金黃色葡萄球菌菌株間缺乏保守的抗原，因此，迫切需要尋找保守且保護(hù)性好的疫苗抗原。

SirH和StbA均為細(xì)胞壁錨定蛋白，位于金黃色葡萄球菌表面，被認(rèn)為是有潛力的疫苗候選抗原。筆者前期在大腸桿菌中成功表達(dá)了這兩個(gè)蛋白的主要抗原表位區(qū)，且純化的重組蛋白免疫家兔能獲得高效價(jià)的抗血清［9，10］。本研究開展純化SirH和StbA的主動(dòng)免疫以及其抗血清的被動(dòng)免疫實(shí)驗(yàn)，探討候選抗原及其抗血清的免疫保護(hù)作用，為研制具有廣泛保護(hù)力的多價(jià)疫苗奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1菌種、動(dòng)物及試劑 金黃色葡萄球菌臨床分離株由貴州醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)教研室培養(yǎng)和保存；SirH 和StbA重組蛋白為本實(shí)驗(yàn)室原核表達(dá)；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；4周齡、9周齡雌性BALB/c小鼠，SPF級(jí)，購(gòu)于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購(gòu)自北京中杉公司。

1.2SirH和StbA重組蛋白的制備 sirH和stbA基因的克隆、表達(dá)以及表達(dá)產(chǎn)物的純化參見文獻(xiàn)［9，10］。

1.3主動(dòng)免疫和細(xì)菌攻擊 將4周齡小鼠分為4組，分別是PBS對(duì)照組、SirH純化蛋白免疫組、StbA純化蛋白免疫組和金黃色葡萄球菌全菌免疫組，每組10只。分別用純化蛋白StbA、SirH以及甲醛滅活的金黃色葡萄球菌為免疫原，純化蛋白按50 μg/只免疫小鼠，滅活金黃色葡萄球菌按0.5×105CFU/只免疫小鼠。首次采用免疫原與等量的弗氏完全佐劑充分乳化后皮下多點(diǎn)注射，每只100 μL。d14、21改為弗氏不完全佐劑充分乳化后以同樣的劑量皮下多點(diǎn)免疫，對(duì)照組免疫PBS。d25斷尾采血，收集抗血清。分別用純化蛋白StbA、SirH包被96孔板，抗血清和免疫前陰性血清分別從1:400開始倍比稀釋，酶標(biāo)儀檢測(cè)不同稀釋度抗血清和陰性血清孔OD450值，以P/N＞2.1的最高血清稀釋倍數(shù)作為抗血清效價(jià)。d 28用2×108CFU/mL的金黃色葡萄球菌進(jìn)行攻擊，1 mL/只，次日起觀察小鼠死亡情況，共10 d。

1.4被動(dòng)免疫和細(xì)菌攻擊 按1.2.2方法免疫小鼠制備StbA和SirH抗血清。被動(dòng)免疫實(shí)驗(yàn)：將9周齡小鼠分為3組，分別是陰性血清對(duì)照組、StbA抗血清免疫組和SirH抗血清免疫組，每組10只，血清按100 μL/只免疫小鼠。4 h后，用2×108CFU/mL的金黃色葡萄球菌腹腔注射小鼠，1mL/只，次日起觀察小鼠死亡情況，共10 d。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用單側(cè)Fisher精確檢驗(yàn)方法分析對(duì)照組與免疫組小鼠存活率間的差異，P＜0.05為差異具備顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1SirH和StbA純化重組蛋白的制備 表達(dá)的SirH 和StbA重組蛋白經(jīng)GST親和層析純化后，用SDSPAGE電泳分析蛋白純化情況。

2.2SirH和StbA抗血清的效價(jià)檢測(cè) 間接ELISA檢測(cè)抗血清效價(jià)，結(jié)果顯示，SirH抗血清稀釋倍數(shù)為1:3 276 800時(shí)，P/N＜2.1，故SirH抗血清效價(jià)為1:1 638 400（圖1）。StbA抗血清稀釋倍數(shù)為1:3 276 800時(shí)，P/N＜2.1，故StbA抗血清效價(jià)為1:1 638 400（圖2）。

圖1　SirH多抗血清的效價(jià)測(cè)定Fig. 1 Titer detection of mouse antibody against recombinant protein SirH

圖2　StbA多抗血清的效價(jià)測(cè)定Fig. 2 Titer detection of mouse antibody against recombinant protein StbA

2.3主動(dòng)免疫的保護(hù)作用 金黃色葡萄球菌攻擊PBS對(duì)照組、金黃色葡萄球菌全菌免疫組、SirH純化蛋白免疫組和StbA純化蛋白免疫組小鼠后，觀察各組小鼠的存活情況。結(jié)果顯示，10只對(duì)照組小鼠，全部死于細(xì)菌攻擊后24 h之內(nèi)，存活率為0（0/10）；而免疫組小鼠死亡主要分布于細(xì)菌攻擊后24 h內(nèi)，之后小鼠死亡趨于穩(wěn)定，金黃色葡萄球菌全菌免疫組存活率為20%（2/10），SirH純化蛋白免疫組存活率為60%（6/10），StbA純化蛋白免疫組存活率為70%（7/10）（圖3）。SirH純化蛋白免疫組和StbA純化蛋白免疫組存活率均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），金黃色葡萄球菌全菌免疫組存活率與對(duì)照組差異不具備顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），SirH純化蛋白免疫組存活率（60%）和StbA純化蛋白免疫組存活率（70%）均高于金黃色葡萄球菌全菌免疫組（20%）。

圖3　主動(dòng)免疫保護(hù)試驗(yàn)中小鼠的存活情況Fig. 3 Survival time of actively immunized mice after lethal challenge with S.aureus

2.4SirH和StbA抗血清的免疫保護(hù)作用 抗血清免疫后4 h，用2×108CFU/mL的金黃色葡萄球菌腹腔內(nèi)注射攻擊小鼠，1 mL/只。攻毒后24 h內(nèi)，免疫組和對(duì)照組小鼠全部死亡，其中免疫組小鼠16～18 h內(nèi)全部死亡，對(duì)照組小鼠攻毒后12～14 h內(nèi)全部死亡。

3　討論

奶牛乳腺炎不僅對(duì)奶牛乳腺組織造成損傷，嚴(yán)重影響奶牛的使用年限，而且還使奶產(chǎn)量降低，影響牛奶的品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的主要病原，不僅給乳品工業(yè)帶來(lái)巨大損失，而且還危害到公共衛(wèi)生和人類健康，疫苗防治是控制該病的首選。

SirH和StbA都是金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁錨定蛋白，位于細(xì)菌表面，容易接觸宿主的免疫系統(tǒng)，被免疫活性細(xì)胞識(shí)別，從而刺激免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。SirH蛋白N端存在信號(hào)肽序列，C端含有細(xì)胞壁錨定基序LPQTG；StbA蛋白N端存在信號(hào)肽序列，C端含有細(xì)胞壁錨定基序LPKTG。通常含有細(xì)胞壁錨定基序如LPXTG、LPQTG、LPKTG等的細(xì)胞壁錨定蛋白都是有潛力的疫苗靶標(biāo)［11-13］。主動(dòng)免疫保護(hù)試驗(yàn)證實(shí)免疫SirH或StbA誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答能保護(hù)小鼠免受致死劑量的金黃色葡萄球菌攻擊，重組蛋白免疫組小鼠存活率均高于金黃色葡萄球菌全菌免疫組，表明SirH和StbA是有潛力的保護(hù)性抗原。

SirH和StbA都能誘導(dǎo)小鼠機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)的抗血清，但抗血清不具有保護(hù)作用，由此推測(cè)SirH 和StbA誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫應(yīng)答可能是由細(xì)胞免疫介導(dǎo)。對(duì)金黃色葡萄球菌感染的免疫保護(hù)機(jī)制研究表明，機(jī)體的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞反應(yīng)對(duì)金黃色葡萄球菌感染的免疫保護(hù)是必需的［14］。另有研究報(bào)道，金黃色葡萄球菌乳腺炎的疫苗需要能夠有效誘導(dǎo)CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的免疫反應(yīng)［8］。因此，保護(hù)性疫苗的研究方向是研制能有效刺激細(xì)胞免疫應(yīng)答的疫苗。

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PROTECTION AGAINST LETHAL CHALLENGE WITH STAPHYLOCOCCUS AUREUS BY INJECTION OF RECOMBINANT SIRH， STBA OR THEIR SPECIFIC ANTISERA

LIU Li-na， ZHONG Nai-feng， WANG Yun， ZHOU Jing， ZHANG Jie
（School of Biology & Engineering， Guizhou Medical University， Guiyang 550025， China）

In order to investigate immunoprotection of vaccine antigen candidates SirH and StbA and their specifi c antisera against Staphylococcus aureus infection， mice were respectively immunized with the purifi ed recombinant proteins and antisera of candidate antigens， and then the immunized mice were challenged with the lethal dose of Staphylococcus aureus. The result showed that antibody titers of mouse sera immunized with the recombinant SirH or StbA were both 1：1 638 400. All actively immunized mice were injected with a lethal dose of Staphylococcus aureus. The survival rates in the SirH-immunized group （60%） and the StbA-immunized group （70%）were both signifi cantly higher than that in the control group （0%） （P＜0.05）. The survival rates between the whole-cell bacterial vaccine group （20%） and the control group （0%） have no signifi cant difference （P＞0.05）. The survival rates in the SirH-immunized group （60%）and the StbA-immunized group （70%） were both higher than in the whole-cell bacterial vaccine group （20%）. Mice in the antiserumimmunized group and control groups were challenged with a lethal dose of Staphylococcus aureus. The antiserum-immunized mice were all dead within 16 to 18 hours， whereas mice in control group were dead within 12 to 14 hours after challenge. In conclusion， SirH and StbA are both potential protective antigens， but the SirH- or StbA-specifi c antiserum could not protect mice from lethal challenge with Staphylococcus aureus.

Staphylococcus aureus； vaccine antigens； antisera； immunoprotection

S852.611

A

1674-6422（2016）04-0048-04

2016-04-26

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31360084）；貴州省科技合作計(jì)劃（黔科合LH字［2015］7318）

劉麗娜，女，博士，主要從事微生物學(xué)方面研究

劉麗娜，E-mail：strawberry2@126.com