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大腸桿菌O157：H7快速增菌培養(yǎng)基檢測(cè)效果的研究

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為了驗(yàn)證對(duì)于大腸桿菌O157:H7菌株特異性、復(fù)蘇效果以及快速生長(zhǎng)的特點(diǎn)，比較了3種培養(yǎng)基對(duì)于大腸桿菌O157:H7的增菌效果。研究結(jié)果表明，8h培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，MicroFast?快速增菌培養(yǎng)基對(duì)于冷損傷和熱損傷的大腸桿菌O157:H7菌株具有良好的修復(fù)和增殖效果。MicroFast?快速增菌培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)組分適合O157菌株的生長(zhǎng)需求，在MicroFast?快速增菌培養(yǎng)基中，大腸桿菌O157:H7菌株的倍增時(shí)間為13.5min，遠(yuǎn)高于mEC+n的28min，且MicroFast?快速增菌培養(yǎng)基能夠完全抑制部分G+細(xì)菌以及部分G-細(xì)菌的干擾，對(duì)于大腸桿菌O157:H7具有特異性的選擇。故MicroFast?快速增菌培養(yǎng)基對(duì)于大腸桿菌O157:H7菌株具有良好的選擇特異性，能夠短時(shí)間內(nèi)（8h內(nèi)）有效富集培養(yǎng)大腸桿菌O157:H7菌株，是一種能夠?qū)崿F(xiàn)大腸桿菌O157:H7菌株快速高效、特異增殖的培養(yǎng)基，將其結(jié)合檢測(cè)金標(biāo)卡，能夠?qū)崿F(xiàn)8h內(nèi)快速檢測(cè)，結(jié)果可信可靠。

MicroFast?快速增菌培養(yǎng)基 大腸桿菌O157:H7 增菌 效果

目前，病原微生物污染防控是食品安全的剛性需求，微生物污染是食品不合格的主要原因，也是造成食物中毒的主要原因，尤其以細(xì)菌性食物中毒為主，食品中大腸桿菌污染率最高達(dá)到了41.1%，大腸桿菌O157則為3.7%［1］。腸出血性大腸桿菌O157:H7是腸出血性大腸桿菌（EHEC）的一個(gè)血清型，是引起食源性疾病主要血清型［2］，主要臨床癥狀為突發(fā)性腹痛、腹瀉、血便，嚴(yán)重時(shí)并發(fā)腎衰竭，病死率高。大腸桿菌O157:H7主要污染肉類食品［3，4］，蔬菜中也時(shí)有檢出［5］，是食品中潛在危害巨大的食源性致病菌。因此，快速、特性、高效的檢出食品中大腸桿菌O157:H7，對(duì)于其引起的食源性疾病防控以及暴露病例的治療具有重要的意義。本文比較了MicroFast?快速增菌培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱MF培養(yǎng)基）、改良EC肉湯培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱：mEC+n）和FP培養(yǎng)基對(duì)大腸桿菌O157:H7的增菌效果，以期驗(yàn)證不同培養(yǎng)基的增菌優(yōu)勢(shì)和特異性，為探索省時(shí)、高效、特異的快速檢測(cè)方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌種

大腸埃希氏菌O157:H7（ATCC12478/NCTC12900）為實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性菌株。

大腸桿菌FSCC146255/146264、ATCC25922/8739、CMCC44102/44103（Escherichia coli）、腸桿菌ATCC14028/ 43864/49027（Enterobacteria），沙門氏菌CICC21482 CMCC 50333/50220/50115/ 50335（Salmonella），李斯特氏菌ATCC 19115、CMCC54002/ 22260（Listeria），假單胞菌ATCC 27853、CMCC10104（Pseudomonas），枯草芽孢桿菌ATCC 6633、CMCC63501（Bacillus subtilis），為特異性檢測(cè)用菌株。

1.2培養(yǎng)基

MicroFast?快速增菌培養(yǎng)基，簡(jiǎn)稱MF培養(yǎng)基，北京良潤(rùn)生物科技有限公司；改良EC肉湯培養(yǎng)基，簡(jiǎn)稱為mEC+n培養(yǎng)基，按照GB 4789.36-2008規(guī)定步驟配置，備用；FP培養(yǎng)基，國(guó)外某品牌培養(yǎng)基。

1.3儀器設(shè)備

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-2450），日本島津；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（GHP-9270），金壇市城東久久實(shí)驗(yàn)儀器廠；凈化工作臺(tái)（YJ-875），吳江市華都凈化設(shè)備公司；自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器（LDZX-40C1），上海申安醫(yī)療器械廠；電子天平（BSA323S），北京賽多利斯。

1.4 方法

1.4.1培養(yǎng)基的制備

按照說(shuō)明書(shū)或者GB 4789規(guī)定的要求和步驟進(jìn)行，按照需要制作液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。

1.4.2菌株修復(fù)

將陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行制備熱損傷和冷損傷。熱損傷菌體制備：將標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性菌株的菌懸液（108～109cfu/mL）置于55℃水浴鍋、加熱15min后取出，室溫冷卻30min，定義為熱損傷菌體細(xì)胞，備用。冷損傷菌體制備：將菌懸液置于-20℃冰箱、冷凍2h，然后取出室溫預(yù)熱30min，定義為冷損傷菌體細(xì)胞，備用；正常對(duì)照組：未做處理的菌懸液，定義為正常組菌體細(xì)胞。將相同濃度的大腸埃希氏菌O157菌懸液菌，分別按照上述規(guī)定的方法進(jìn)行菌體損傷處理，36±1℃、培養(yǎng)8h后，稀釋進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，每組做5個(gè)平行，取平均值。

1.4.3生長(zhǎng)速度

吸取0.2mL大腸埃希氏菌O157 NCTC12900的菌懸液（108～109cfu/mL），按照2%的接種量，分別接種到盛有10mL MF培養(yǎng)基、mEC+n培養(yǎng)基和FP培養(yǎng)基的18×180mm試管中，每組10支試管，36±1℃培養(yǎng)，每隔1h測(cè)定其OD600吸光度值，每只試管測(cè)3次，取平均值繪制其生長(zhǎng)曲線。同時(shí)通過(guò)平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)對(duì)數(shù)期各時(shí)間點(diǎn)的菌落形成單位數(shù)，計(jì)算倍增時(shí)間。

1.4.4特異性

無(wú)菌吸取0.2mL對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液（108～109cfu/ mL），接種于盛有10mL不同培養(yǎng)基中，36±1℃、培養(yǎng)18h，觀察培養(yǎng)管的渾濁程度，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1MF培養(yǎng)基、mEC+n培養(yǎng)基和FP培養(yǎng)基對(duì)菌株復(fù)蘇效果

熱損傷、冷損傷往往導(dǎo)致細(xì)菌菌體細(xì)胞生理狀態(tài)的破壞，部分成為存活但不能培養(yǎng)的菌體細(xì)胞（viable but noneuhurable state，VBNC），無(wú)法再常規(guī)培養(yǎng)基增殖生長(zhǎng)［6］，具體到食品衛(wèi)生微生物檢測(cè)，由于培養(yǎng)基的差異或者營(yíng)養(yǎng)成分的缺失，往往不適合VBNC菌體細(xì)胞的增殖，從而無(wú)法計(jì)數(shù)檢測(cè)VBNC，增加了假陰性的幾率。圖1表明，熱或冷損傷菌體細(xì)胞在MF培養(yǎng)基上復(fù)蘇效果好于mEC+n培養(yǎng)基和FP培養(yǎng)基，尤其是高于GB 4789.36-2008規(guī)定培養(yǎng)基計(jì)數(shù)值的3個(gè)數(shù)量級(jí)，說(shuō)明MF培養(yǎng)基成分能夠利于O157菌株的復(fù)蘇和增殖，促進(jìn)損傷細(xì)胞的復(fù)蘇，特別是8h培養(yǎng)時(shí)間，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于GB常規(guī)檢測(cè)規(guī)定的時(shí)間，具有耗時(shí)短，增殖復(fù)蘇效果好的特點(diǎn)，適合快速檢測(cè)的前期培養(yǎng)和目的菌株的初分離。

圖1　3種培養(yǎng)基對(duì)不同損傷處理組的標(biāo)準(zhǔn)菌株36±1℃、8h培養(yǎng)計(jì)數(shù)

圖2　3種培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸埃希氏菌O157：H7的生長(zhǎng)曲線

圖3　3種培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸埃希氏菌O157：H7的倍增時(shí)間

2.2MF培養(yǎng)基、mEC+n培養(yǎng)基和FP培養(yǎng)基對(duì)菌株生長(zhǎng)影響

大腸埃希氏O157:H7標(biāo)準(zhǔn)菌株在3種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度存在差異（如圖2），盡管菌體在3種培養(yǎng)基上進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間接近，但對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體生長(zhǎng)速度各異，MF培養(yǎng)基、FP培養(yǎng)基均優(yōu)于GB 4789.36-2008規(guī)定的mEC+n培養(yǎng)基，MF培養(yǎng)基生長(zhǎng)速度最快，其倍增時(shí)間最短，尤其是對(duì)于冷損傷菌體（如圖3），表現(xiàn)出良好的修復(fù)和增殖功效，說(shuō)明MF培養(yǎng)基組分適合大腸埃希氏菌O157:H7的生長(zhǎng)，提供生長(zhǎng)因子滿足其增殖的要求。

表1?。?種培養(yǎng)基對(duì)部分G+、G-細(xì)菌特異性選擇情況

2.3MF培養(yǎng)基、mEC+n培養(yǎng)基和FP培養(yǎng)基抑菌情況

特異性驗(yàn)證結(jié)果表明（見(jiàn)表1），MF培養(yǎng)基、mEC+n培養(yǎng)基和FP培養(yǎng)基均能夠較好的抑制G+細(xì)菌，李斯特氏菌、枯草芽孢桿菌在3種培養(yǎng)基上均檢測(cè)不到菌落的形成，說(shuō)明培養(yǎng)基能夠有效抑制G+生長(zhǎng)，減少了假陽(yáng)性結(jié)果，提高了可信度。對(duì)于G-細(xì)菌，MF培養(yǎng)基均能抑制沙門氏菌、腸桿菌、假單胞菌和大腸桿菌，尤其對(duì)于大腸桿菌的抑制，說(shuō)明MF培養(yǎng)基對(duì)于O157:H7特異性強(qiáng)，具有良好的選擇性。mEC+n培養(yǎng)基抑制效果相對(duì)較弱，不能夠很好地抑制大腸桿菌、腸桿菌和假單胞菌。3種培養(yǎng)基均能選擇性地培養(yǎng)O157:H7菌株，MF培養(yǎng)基特異性要優(yōu)于其他2種培養(yǎng)基，mEC+n培養(yǎng)基選擇性最弱。食品衛(wèi)生微生物檢測(cè)中選擇性培養(yǎng)基的特異性是檢測(cè)結(jié)果的基石，其選擇性高低決定著結(jié)果的可靠、可信程度，尤其快速檢驗(yàn)逐漸將成為主流檢測(cè)方法，因此選擇性培養(yǎng)基特異性更加重要。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，MF培養(yǎng)基對(duì)于O157的檢測(cè)具有優(yōu)良的特異性，其選擇性培養(yǎng)結(jié)果可信可靠，優(yōu)于同類培養(yǎng)基產(chǎn)品。

3.討論

微生物污染是食品不合格的主要原因，也是造成食物中毒的主要病因，尤其細(xì)菌性污染往往是食源性疾病暴發(fā)的主要誘因。大腸桿菌O157:H7作為腸出血性大腸桿菌的一種，其往往侵染肉類及其制品，蔬菜及其制品中也時(shí)有報(bào)道。目前，常規(guī)方法檢測(cè)O157需要18～24初分離培養(yǎng)，生化鑒定、血清分型等步驟，往往耗時(shí)、費(fèi)力，不利于食源性疾病病例的對(duì)癥治療，也不利于污染食品的后期處理，因此快速高效、特異可靠的快檢方法逐漸成為食品衛(wèi)生檢驗(yàn)微生物檢驗(yàn)以及食源性疾病病因檢測(cè)的理想方法。實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)可以從三方面考慮［7］：其一，實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡(jiǎn)化；其二，前處理方法簡(jiǎn)單快速；其三，簡(jiǎn)單、快速和準(zhǔn)確地判定分析方法。由此可知，微生物檢測(cè)中提高選擇性培養(yǎng)基的特異性、快速性以及可信度，可以大大縮短檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)快速性。針對(duì)大腸桿菌O157的MicroFast?快速增菌培養(yǎng)基具有修復(fù)性好，特異性強(qiáng)以及適合O157生長(zhǎng)的組分。驗(yàn)證試驗(yàn)證明MF培養(yǎng)基對(duì)O157具有良好的選擇特異性，選擇性優(yōu)于FP培養(yǎng)基和mEC+n培養(yǎng)基，并且能夠有效的抑制部分G+、G-細(xì)菌。MicroFast?快速增菌培養(yǎng)基能夠8h內(nèi)特異性初分離到O157，結(jié)合金標(biāo)準(zhǔn)卡法，完全能夠?qū)崿F(xiàn)8h內(nèi)檢測(cè)O157，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于GB 4789.36-2008的18～24h要求，其檢測(cè)限值（1cfu/25g）、快速性以及特異性可與生物芯片技術(shù)（8h）和Lateral Flow（8.4h）技術(shù)媲美，而檢測(cè)成本則較低。因此，MicroFast?快速增菌培養(yǎng)基及其快速檢測(cè)組合方法能夠滿足食品中O157快檢以及食源性疾病病因快速檢測(cè)的要求。

［1］安靜.你吃的食品安全嗎？現(xiàn)階段的食品安全風(fēng)險(xiǎn)EB/OL：摘編自旭日干、龐國(guó)芳主編《中國(guó)食品安全現(xiàn)狀、問(wèn)題及對(duì)策戰(zhàn)略研》. http://blog.sciencenet.cn/blog-528739-957755. html，2016-1-6.

［2］李凡，劉晶晶，徐志凱.醫(yī)學(xué)微生物（第7版）［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008，120.

［3］ 鄭冬冬，畢旺來(lái)，王宏勛，等. 武漢肉類食品中大腸桿菌O157∶H7分離株stx亞型和毒力特征分析［J］.食品科學(xué)，2014，135（8）:94-98.

［4］ 崔山，張萬(wàn)吉. 山東省零售肉類樣品中分離，鑒定攜帶志賀毒素基因（stx）的0157和非O157大腸桿菌［J］.科技與企業(yè)，2013，（18）:280，283.

［5］ 邱慶超，胡傳壽，周良彬，等.蔬菜中大腸桿菌O157的分離與鑒定［J］.中國(guó)釀造，2013，31（9）:85-87.

［6］ 郭瀟，雷曉凌.活的不可培養(yǎng)的細(xì)菌的研究進(jìn)展［J］. 微生物學(xué)雜志，2010，30（3）:82-86.

［7］ 王晶，王林，黃曉蓉，主編.食品安全快速檢測(cè)技術(shù)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.