李林潔， 何　燕， 單可人， 官志忠， 楊　明

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽　550004； 2.貴陽市婦幼保健院 優(yōu)生遺傳科， 貴州 貴陽　550001)

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·專題研究2·

貴州布依族、侗族、苗族TTTY5、TSPY1、TSPY4基因拷貝數(shù)多態(tài)分析*

李林潔1,2， 何燕1**， 單可人1， 官志忠1， 楊明1

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽550004； 2.貴陽市婦幼保健院 優(yōu)生遺傳科， 貴州 貴陽550001)

目的： 研究貴州省布依族、侗族及苗族人群Y染色體的睪丸特異轉(zhuǎn)錄基因(TTTY5)、Y染色體睪丸特異編碼蛋白1(TSPY1)和Y染色體睪丸特異編碼蛋白4(TSPY4)基因的拷貝數(shù)多態(tài)性。方法： 采集292例男性少數(shù)民族(布依族、侗族、苗族)血液，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測TTTY5、TSPY1及TSPY4基因的相對拷貝數(shù)，觀察TTTY5、TSPY1及TSPY4基因拷貝數(shù)在布依族、侗族及苗族人群中的分布。結(jié)果： 在貴州布依族、侗族、苗族的292人中，TTTY5、TSPY1及TSPY4拷貝數(shù)分布范圍分別為1～39拷貝、1～68拷貝及1～39拷貝；除苗族和侗族的TTTY5拷貝數(shù)外，TTTY5、TSPY1及TSPY4拷貝數(shù)在貴州布依族、侗族、苗族間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論：TTTY5、TSPY1及TSPY4基因拷貝數(shù)在貴州布依族、侗族、苗族人群中分布不一，各民族均有各自的拷貝數(shù)分布特點(diǎn)。

少數(shù)民族； Y染色體； 睪丸； 基因； 拷貝數(shù)多態(tài)； 貴州

Y染色體是唯一的父系遺傳染色體，大約95%的Y染色體區(qū)域?yàn)榉侵亟M區(qū)域(nonrecombining region of Y chromosome, NRY)，該區(qū)域不與同源染色體發(fā)生重組，在傳代的過程中不受重組的干擾，使得Y染色體上的遺傳標(biāo)記能夠準(zhǔn)確、清晰地追溯人類群體的人群分化和遷徙[1]。2004年，Iafrate[2]和 Sebat[3]先后報(bào)道了在人類基因組中存在拷貝數(shù)變異(copy number variants, CNV)，即基因組中≥1 000 bp的DNA片段因插入、缺失和/或擴(kuò)增及其相互組合衍生出的復(fù)雜染色體結(jié)構(gòu)變異，當(dāng)CNVs在人群中的頻率>1%，則稱為拷貝數(shù)多態(tài)(copy number polymorphism, CNP)，CNP在進(jìn)化和環(huán)境適應(yīng)以及常見疾病的潛在易感性的研究中扮演了重要的角色[4-9]。貴州是一個多民族省份，境內(nèi)17個世居少數(shù)民族大多在偏遠(yuǎn)地區(qū)聚族而居，由于民族間較少通婚且生活環(huán)境相對封閉，形成了遺傳性上相對隔離的人群[10-11]。近年來，通過對不同人群的Y染色體序列的分析，許多人群特異的單體型已得到確定，而作為繼SNP后的新一代遺傳標(biāo)記CNP，在貴州省少數(shù)民族遺傳多態(tài)性研究中尚未報(bào)道。本文對貴州省布依族、侗族、苗族少數(shù)民族人群Y染色體上睪丸特異轉(zhuǎn)錄基因(testis-specific transcript，TTTY5)、Y染色體睪丸特異編碼蛋白1(testis-specific protein Y-encoded 1，TSPY1)和Y染色體睪丸特異編碼蛋白4(testis-specific protein Y-encoded 4，TSPY4)基因拷貝數(shù)的遺傳多態(tài)性進(jìn)行了調(diào)查研究，報(bào)道如下。

1　材料和方法

1.1標(biāo)本采集及DNA提取

根據(jù)知情同意、隨機(jī)抽樣原則，選取貴州省境內(nèi)3個世居少數(shù)民族——布依族、侗族、苗族男性292例，16～56歲，所選對象間無直系親緣關(guān)系，292例血液標(biāo)本的民族及采集地區(qū)分布見表1。所有被選者于清晨抽取外周靜脈血5 mL，EDTA·Na2抗凝-80 ℃保存。采用酚-氯仿法抽提總DNA，并將樣品DNA統(tǒng)一標(biāo)化為100 mg/L作為模板，-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2TTTY、5TSPY1及TSPY4基因的相對拷貝數(shù)

1.2.1探針及引物序列和循環(huán)條件運(yùn)用ABI 公司TaqMan Copy Number Assays試劑盒在ABI StepOnePlusTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上檢測，以編碼核糖核酸酶P(RNase P)基因?yàn)閮?nèi)參基因，RNase P基因在二倍體生物中為2拷貝。待測基因Taqman探針序列：TTTY5為5′-FAM-GGAGGATAGGAAGCAAGGCACATAA-3′，TSPY1為5′-FAM-ATGTTGTTCTTTC GGAGTAACCC-3′，TSPY4為5′- FAM-AACCCCTACTTCCAGAATAAAG-3′。TTTY5基因的探針及引物為ABI公司預(yù)設(shè)計(jì)產(chǎn)品，TSPY1、TSPY4的探針及引物序列根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)送ABI公司合成，Mix預(yù)混液為ABI公司TaqMan Copy Number Assays試劑盒提供。采用多重PCR在同一反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增目的基因與內(nèi)參RNaseP基因，循環(huán)條件為95℃ 10 min，95 ℃ 15 sec、60 ℃ 60 sec，40個循環(huán)。

表1　292例血液標(biāo)本的民族及采集地區(qū)分布

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線及結(jié)果判定將對照DNA樣本按5倍濃度梯度稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)品，ABI StepOnePlusTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀采集各標(biāo)準(zhǔn)品基因與內(nèi)參RNase P基因擴(kuò)增線性情況，得出各目的基因標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線，RNaseP標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=1.63x+29.07,R2=0.988；TTTY5標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=1.69x+29.44,R2=0.995；TSPY1標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=1.68x+25.12,R2=0.999；TSPY4標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=1.6817x+25.124,R2=0.999。參照文獻(xiàn)[12]目的基因和參照基因的PCR擴(kuò)增效率比值>95%，可通過相對定量法計(jì)算基因的相對拷貝數(shù)，以ABI StepOnePlusTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀附帶軟件Step-one 2.1進(jìn)行熒光收集和CT值分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1TTTY5、TSPY1及TSPY4基因拷貝數(shù)的分布

292例布依族、侗族及苗族男性樣本中，TTTY5拷貝數(shù)變異分布范圍為1～39拷貝，其中布依族為1～34拷貝、侗族為2～39拷貝、苗族為6～36拷貝；TSPY1基因拷貝數(shù)變異分布范圍為1～68拷貝，其中布依族為9～29拷貝、侗族為6～68拷貝、苗族為1～3拷貝；TSPY4基因拷貝數(shù)變異范圍為1～39拷貝，其中布依族為19～39拷貝、侗族為1～7拷貝、苗族為1～2拷貝。見圖1。

圖1　TTTY5、TSPY1及TSPY4基因拷貝數(shù)在布依族、侗族及苗族的分布Fig.1　The frequency distribution of TTTY5, TSPY1 and TSPY4 copy number

2.23個民族的TTTY5、TSPY1及TSPY4基因拷貝數(shù)

TTTY5基因拷貝數(shù)從高到低依次為苗族、侗族及布依族，苗族、侗族與布依族比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，侗族與苗族比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。TSPY1基因拷貝數(shù)從高到低依次為侗族、布依族及苗族，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。TSPY4基因拷貝數(shù)從高到低依次為布依族、侗族及苗族，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2　布依族、侗族及苗族人群中TTTY5、TSPY1及TSPY4基因拷貝數(shù)

(1)與布依族比較，P<0.01，(2)與侗族比較P<0.01

3　討論

Y染色體是人類僅有的單倍遺傳的染色體，除了兩臂末端26 000 bp的擬常染色體區(qū)外，其余大約95%的區(qū)域都為Y染色體非重組區(qū)域，該區(qū)域的DNA序列忠實(shí)記錄著發(fā)生在祖先的突變。CNVs作為一類基因組變異，發(fā)生變異的基因組節(jié)段占整個人類基因組的12%，覆蓋人類基因組中13%的基因及5%以上的編碼序列，是疾病發(fā)生的重要遺傳學(xué)基礎(chǔ)[13-14]。目前的研究認(rèn)為，CNPs具有與SNPs相似程度的人群差異，即不同人群之間可能共享大部分相同的CNPs，而部分CNPs在不同人群中以不同頻率分離并有顯著性差異[15]。TTTY5基因位于Yq11.223，長度為2 079 bp，該基因由DGV于2005年收錄，所在的變異ID號為0833，該基因的拷貝數(shù)變異類型為拷貝數(shù)的缺失。有研究報(bào)道Y染色體AZF區(qū)域上在睪丸中轉(zhuǎn)錄的基因家族的缺失，是造成男性生精障礙的原因之一，而TTTY5和TTTY6、RBMY1、PRY的復(fù)雜回文結(jié)構(gòu)的基因家族可能涉及到由AZFc區(qū)域缺失引起的生精障礙[16]。TSPY1和TSPY4基因?yàn)榫幋a睪丸特異蛋白基因，伴Y染色體遺傳，位于Y染色體短臂。TSPY1是蛋白超家族中的一員，包含有周期蛋白B的結(jié)合域，通過與周期蛋白B共同激活復(fù)制進(jìn)程中的因子，在男性減數(shù)分裂中扮演了重要的角色[17]。

本研究結(jié)果顯示，來自不同地區(qū)的布依族、侗族及苗族的TTTY5、TSPY1及TSPY4拷貝數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(苗族和侗族間的TTTY5拷貝數(shù)差異除外)，其中，TTTY5基因拷貝數(shù)在苗族人群中最高，布依族最低；TSPY1基因拷貝數(shù)在侗族人群中最高，苗族最低；TSPY4基因拷貝數(shù)在布依族人群中最高，苗族最低，提示這3個少數(shù)民族各為遺傳關(guān)系相對獨(dú)立的群體。本研究中的苗族樣本的結(jié)果顯示，來自貴州3個地區(qū)的雍里苗族、沙井苗族及威寧苗族樣本的TSPY1、TSPY4基因拷貝數(shù)均<5拷貝，明顯低于布依族和侗族，提示這3個苗族群體雖然聚居地區(qū)不同，但相同民族間遺傳關(guān)系卻很接近。證實(shí)了貴州苗族雖然在歷史的長河里不斷發(fā)生大幅遷徙和局部遷徙、分布零散、與兄弟民族交錯雜居，但貴州各地苗族可能屬一脈相承，封閉的地理環(huán)境和婚嫁習(xí)俗使得Y染色體特有的遺傳特征得到很好的保留。TTTY5、TSPY1及TSPY4基因拷貝數(shù)在本次研究的布依族、侗族和苗族中呈現(xiàn)出不同的特點(diǎn)。TTTY5拷貝數(shù)在苗族人群中無<5拷貝分布，這與拷貝數(shù)以<5頻率較高的布依族、侗族形成了較大的反差。布依族、侗族起源于百越系統(tǒng)，苗族出自古代苗瑤族系，在本課題組的前期Y-SNP研究中發(fā)現(xiàn)，貴州百越系統(tǒng)中的民族有密切聯(lián)系，且與國內(nèi)其他地域百越系統(tǒng)有較大的遺傳差異，為較獨(dú)立的一個群體[10]。本次拷貝數(shù)多態(tài)研結(jié)果也體現(xiàn)了布依族、侗族相較于苗族有其獨(dú)特性。TSPY4拷貝數(shù)結(jié)果中，苗族拷貝數(shù)最低，布依族最高；2個布依族人群的拷貝數(shù)分布均處于相同的幾個區(qū)域內(nèi)，不同地區(qū)的侗族、苗族人群各自的拷貝數(shù)分布范圍也基本一致，提示3個民族擁有各自獨(dú)特的遺傳特點(diǎn)，且分布于不同地域的同一民族遺傳背景接近。

綜上，本次研究結(jié)果表明，在貴州多個地區(qū)的布依族、侗族、苗族男性人群中TTTY5、TSPY1、TSPY4拷貝數(shù)分布不一，但各民族均有各自的拷貝數(shù)分布特點(diǎn)。

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(2016-05-21收稿，2016-08-22修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 劉華

Analysis of Gene Copy Number Polymorphism forTTTY5,TSPY1 andTSPY4 in Buyi, Dong and Miao Nationality of Guizhou Province

LI Linjie1,2, HE Yan1, SHAN Keren1, GUAN Zhizhong1, YANG Ming1

(1.TheKeyLaboratoryofMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.DepartmentofBirthHealthGenetic,MaternityandChildrenHealthHospitalofGuiyang,Guiyang550001,Guizhou,China)

Objective: To investigate gene copy number polymorphism of testis-specific gene transcript of Y chromosome (TTTY5), testis-specific protein Y-encoded 1 (TSPY1) and testis-specific protein Y-encoded 4 (TSPY4) in Buyi Nationality, Dong nationality and Miao nationality of Guizhou Province. Methods: The blood of 292 cases of male ethnic minorities (Buyi, Dong, Miao) was collected. Real-time fluorescent quantitative PCR was adopted to detect relative copy number ofTTTY5,TSPY1 andTSPY4 genes. Distribution and difference of copy number ofTTTY5,TSPY1 andTSPY4 genes were observed in Buyi, Dong and Miao nationalities. Results: In total 292 cases, the copy number range ofTTTY5,TSYP1 andTSPY4 gene were 1～39 copies, 1～68 copies and 1～39 copies in Buyi, Dong and Miao nationalities, respectively. Except forTTTY5 gene copy numbers of Miao and Dong nationality, there were statistically significant differences in the distribution of copy numbers among Buyi, Dong and Miao nationality (P<0.01).Conclusions：TTTY5,TSPY1 andTSPY4 gene copy number distribution is not consistent in Buyi, Dong and Miao nationality of Guizhou Province, and each nationality has its own copy number distribution characteristics.

ethnic group; Y chromosome; testis; gene； copy number polymorphism; Guizhou province

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.31560306)； 貴州省社會發(fā)展科技攻關(guān)項(xiàng)目[黔科合SY(2012)3135號]; 貴州省“2011協(xié)同創(chuàng)新中心”[黔教合協(xié)同創(chuàng)新中心(2014)06號]

E-mail:annieheyan@gmc.edu.cn

R394; RZ273

A

1000-2707(2016)09-1006-04

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.09.004

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網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-09-13網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160913.2240.028.html