馬鈴薯突變體赤霉素代謝關(guān)鍵酶基因差異表達(dá)分析

石建斌楊永智，2王艦，2

（1.青海大學(xué)，西寧 810016；2.青海省農(nóng)林科學(xué)院 教育部青藏高原生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青海省高原作物種質(zhì)資源與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016）

馬鈴薯突變體赤霉素代謝關(guān)鍵酶基因差異表達(dá)分析

石建斌1楊永智1，2王艦1，2

（1.青海大學(xué)，西寧 810016；2.青海省農(nóng)林科學(xué)院 教育部青藏高原生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青海省高原作物種質(zhì)資源與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016）

為揭示馬鈴薯株高突變與赤霉素代謝途徑關(guān)鍵酶基因的關(guān)系，以馬鈴薯株高突變株系4P2-9為材料，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法中的相對(duì)定量RT-PCR建立雙標(biāo)準(zhǔn)曲線，以Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，對(duì)高原4號(hào)及其株高突變材料4P2-9中的赤霉素代謝相關(guān)基因的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，4P2-9的株高及節(jié)間數(shù)顯著低于對(duì)照材料（P＜0.05），節(jié)間長(zhǎng)度顯著高于對(duì)照（P＜0.05），赤霉素代謝的關(guān)鍵酶基因KS、KO和GID1表達(dá)量顯著下調(diào)，分別為對(duì)照材料的0.725倍、0.657倍和0.890倍；GA20ox1和GA2ox1基因的表達(dá)量表現(xiàn)為上調(diào)，分別為對(duì)照材料的1.557倍和1.425倍。結(jié)果表明，赤霉素代謝過程中關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的改變是造成4P2-9材料株高變化的原因之一，而GA20ox1和GA2ox1基因的表達(dá)量的上調(diào)是促使株高降低的主要因素。

馬鈴薯；株高突變；赤霉素；基因表達(dá)量

赤霉素（Gibberellin，簡(jiǎn)稱GA）是一個(gè)較大的萜類化合物家族，在植物的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育周期中起調(diào)節(jié)作用。作為一種重要的植物激素，赤霉素參與控制多種多樣的植物發(fā)育過程，包括種子萌發(fā)、莖的伸長(zhǎng)、根的生長(zhǎng)、葉片伸展、表皮毛發(fā)育、花粉管生長(zhǎng)、花和果實(shí)的發(fā)育等［1，2］。赤霉素生物合成途徑可分為3個(gè)階段，參與其合成的關(guān)鍵酶主要包括古巴焦磷酸合成酶（Copalyl pyrophosphate synthase，CPS）、內(nèi)-貝殼杉烯合成酶（Ent-kaurene synthase，KS）、內(nèi)-貝殼杉烯氧化酶（Ent-kaurene oxidase，KO）、GA-20氧化酶（GA-20 oxidase）、GA-3氧化酶（GA-3 oxidase）以及GA-2氧化酶（GA-2 oxidase）等［3］。

CPS是調(diào)節(jié)GA生物合成途徑一個(gè)重要的酶，決定了GGPP向GA方向合成，同KS一樣位于前質(zhì)體，且具有引導(dǎo)序列。CPS能夠催化生物合成途徑中從牻牛兒焦磷酸（Geranylpyrophosphate，GGPP）形成古巴焦磷酸（Copalyl pyrophosphate，CPP），為催化環(huán)化雙萜形成的第一步。KS則催化CPP形成內(nèi)-貝殼杉烯，即為赤霉素的前身。KO是一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，與膜結(jié)合的依賴細(xì)胞色素P450和NADPH的單加氧化酶，經(jīng)三步反應(yīng)將內(nèi)-貝殼杉烯氧化為內(nèi)-貝殼杉烯酸。GA-20氧化酶和GA-2氧化酶是重要的GA生物合成和調(diào)控酶，為可溶性的雙加氧酶，由小的多基因家族編碼，目前大約有20-30種的GA-20氧化酶基因被克?。?］。GA-20氧化酶是嚴(yán)格調(diào)控的酶，既受反饋調(diào)節(jié)，又受光周期調(diào)控。GA-20氧化酶底物專一性不強(qiáng)，其對(duì)底物的親和力與C-13位的羥基化有關(guān)，形成GA代謝的2個(gè)或多個(gè)平行形成途徑，這與植物中具有生物活性的GAs類型相一致［5］。GA-2氧化酶主要作用于有生物活性的GA1和GA4，使兩者在C-2位羥基化轉(zhuǎn)變成無活性的GA8和GA34，并且維持著植物體內(nèi)具有生物活性的GAs和C19-GAs中間體之間的平衡。赤霉素受體GID1（Gibberellin insensitive dwarf1）是一種可溶性蛋白，與赤霉素結(jié)合形成二聚體，將赤霉素的信號(hào)傳遞給下游元件，在植物體上產(chǎn)生赤霉素效應(yīng)［6］。自20世紀(jì)60年代起，由于水稻sd1基因和小麥Rht1基因在育種中的應(yīng)用，極大地提高了世界主要糧食作物的產(chǎn)量，即“綠色革命”［7，8］。最近的研究表明主要農(nóng)作物的“綠色革命”都與赤霉素密切相關(guān)［9，10］。目前，在分子水平上研究赤霉素的表達(dá)調(diào)控已成為植物激素研究領(lǐng)域中的前沿和熱點(diǎn)［11-13］。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR為目前常用檢測(cè)基因表達(dá)量的方法，具有比Northern blot成本低，操作簡(jiǎn)便，省時(shí)省力，高精確度和高靈敏度等特點(diǎn)，能夠檢測(cè)表達(dá)豐度較低的mRNA，已經(jīng)成為基因表達(dá)分析的首選方法［14，15］。

本研究以馬鈴薯株高突變株系為材料，通過細(xì)胞學(xué)觀察及實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，分析突變系體細(xì)胞特征并檢測(cè)赤霉素代謝途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)情況，旨在為進(jìn)一步了解馬鈴薯中赤霉素作用的分子機(jī)理提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 馬鈴薯材料 高原4號(hào)來源于青海省農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)中心，4P2-9為本實(shí)驗(yàn)室利用RNA干涉沉默馬鈴薯卷葉病毒篩選出的株高變異突變系。1.1.2 儀器和試劑 iQ5 實(shí)時(shí)熒光PCR儀（Bio-Rad），高速冷凍離心機(jī)，PCR儀，水平凝膠電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)，電子顯微鏡，微量移液槍（Eppendorf）。

2×SYBR Green I Mix 購自上海生物工程公司，0.2 mL平蓋八聯(lián)管購自Bio-Rad公司，RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒、Fast Quant cDNA第一鏈合成試劑盒、RNase-Free DNase I、10×buffer、dNTP、Taq聚合酶均購自天根生物公司。

1.2 方法

1.2.1 材料的準(zhǔn)備 從基因庫中分別取高原4號(hào)和突變株系4P2-9的組培苗，切取帶芽莖段于基本培養(yǎng)基MS中，在本實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)間培養(yǎng)30 d（培養(yǎng)溫度為白天25℃、夜間21℃，光照為14 h/d，采用日光燈補(bǔ)光）。

1.2.2 馬鈴薯形態(tài)指標(biāo)測(cè)量與細(xì)胞學(xué)觀察 分別挑取高原4號(hào)和4P2-9組培苗各10株測(cè)量每株組培苗植株高度，并統(tǒng)計(jì)節(jié)間數(shù)。用鑷子小心撕取組培苗中部莖段表皮，用稀碘染色后制作細(xì)胞觀察玻片，并用電子顯微鏡觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

1.2.3 馬鈴薯總RNA提取與質(zhì)量檢測(cè) 稱取馬鈴薯材料葉片0.1 g在液氮中迅速研磨成粉末，用植物總RNA提取試劑盒提取馬鈴薯材料的總RNA，具體步驟按試劑盒說明書操作進(jìn)行。提取的RNA用核酸測(cè)定儀測(cè)定濃度和純度，并用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 RT-PCR合成cDNA鏈 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20 μL，在0.2 mL RNase free的離心管中加入5×gDNABuffer 2 μL、Total RNA 5 μL、RNase-Free ddH2O 3 μL，混勻并簡(jiǎn)短離心，置于42℃孵育3 min，然后置于冰上放置2 min。在上述體系中加入10×Fast RT Buffer 2 μL、RT Enzyme Mix 1 μL、FQ-RT Primer Mix 2 μL、RNase-Free ddH2O 5 μL，充分混勻，42℃孵育15 min，95℃孵育3 min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 引物的設(shè)計(jì) 赤霉素代謝途徑中的關(guān)鍵酶主要有CPS1、KS、KO、GA2ox1、GA20ox1及赤霉素受體基因GID1，參考水稻、葡萄、番茄等植物赤霉素代謝關(guān)鍵酶基因序列［16-18］，用DNA STAR軟件分析其同源性，在保守序列內(nèi)用Primer Premier 5設(shè)計(jì)特異性引物，以馬鈴薯內(nèi)源持家基因Actin作為內(nèi)參基因［19］，所有引物（表1）由上海生物工程公司合成。

表1 引物序列表

1.2.6 相對(duì)定量RT-PCR分析 以高原4號(hào)和4P2-9材料的cDNA為模板，用各基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并以PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行10倍（100、10-1、10-2、10-3和10-4）梯度稀釋，用于建立各目的基因和內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)中，各目的基因分別與內(nèi)參Actin基因兩兩一組，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的同時(shí)擴(kuò)增高原4號(hào)和4P2-9材料中相應(yīng)目的基因和內(nèi)參Actin基因。反應(yīng)體系為20 μL，包含10 μL 2×SYBR Green I，引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 3 min；95℃ 10 s，退火 20 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，內(nèi)參基因、外源基因的熔解曲線的測(cè)定均是從65℃到95℃，每0.2℃/5 s測(cè)定吸光值1次。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，結(jié)果取平均值，參照Pfaffl法［20］，通過目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率（E）和CT值來計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量（C），C=EΔCT/E（目的基因）ΔCT（內(nèi)參基因），ΔCT=CT目的基因-CT內(nèi)參基因，E擴(kuò)增效率=10-1/r，r為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。以此計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，并與株高性狀進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 馬鈴薯株高統(tǒng)計(jì)及細(xì)胞學(xué)觀察

分別統(tǒng)計(jì)馬鈴薯材料4P2-9及對(duì)照材料高原4號(hào)的株高和節(jié)間數(shù)，隨機(jī)挑選10株測(cè)量，做3次重復(fù)，所得數(shù)據(jù)經(jīng)DPS統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果（表2）顯示，對(duì)照組高原4號(hào)材料的平均株高為16.00 cm，4P2-9材料的平均株高為12.45 cm，較對(duì)照偏低，且兩者之間的差異達(dá)到了顯著水平（P＜0.05）。4P2-9材料的平均節(jié)間數(shù)為7.9，較對(duì)照組的13.00顯著偏小，且該差異也達(dá)到了顯著水平（P＜0.05）。4P2-9材料的平均節(jié)長(zhǎng)與對(duì)照組相比，達(dá)到顯著差異水平（P＜0.05）。

通過對(duì)4P2-9材料和高原4號(hào)材料的細(xì)胞學(xué)觀察（圖1）發(fā)現(xiàn)，兩者莖段細(xì)胞狹長(zhǎng)，均呈不規(guī)則狀，細(xì)胞排列緊密且大小不一，兩者在細(xì)胞排列及個(gè)體伸長(zhǎng)方面均無明顯差別。說明4P2-9材料的株高突變性狀主要表現(xiàn)為莖段節(jié)間數(shù)的減少，其次為節(jié)間的增長(zhǎng)，但這種增長(zhǎng)并非是由節(jié)間細(xì)胞拉伸造成的。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

檢測(cè)提取的RNA經(jīng)電泳完整性（圖2），并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈，分別以合成的cDNA為模板，以特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后分別進(jìn)行10倍梯度稀釋（100、10-1、10-2、10-3和10-4），以梯度稀釋的Actin基因PCR產(chǎn)物作為內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)品，以梯度稀釋的各目的基因的PCR產(chǎn)物為外源基因標(biāo)準(zhǔn)品，以CT值為Y軸，以模板起始濃度的對(duì)數(shù)為X軸，建立各目的基因及內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，由圖3可知，模板起始濃度與CT值存在線性關(guān)系，內(nèi)參基因Actin的擴(kuò)增效率為110.90%，R2=0.995，各目的基因的擴(kuò)增效率為82.2%-125.6%，R2為0.995-0.999，所有標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)接近于1，熔解曲線為單峰，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性好，擴(kuò)增曲線中的熒光值能夠準(zhǔn)確反應(yīng)目的產(chǎn)物的擴(kuò)增。

表2 馬鈴薯材料株高性狀統(tǒng)計(jì)

圖1 馬鈴薯材料組培苗株高及節(jié)間細(xì)胞觀察

圖2 RNA檢測(cè)電泳圖

2.3 馬鈴薯赤霉素代謝途徑相關(guān)酶基因的表達(dá)分析

根據(jù)Pfaffl法分別計(jì)算了熒光定量PCR中馬鈴薯材料高原4號(hào)和4P2-9的CPS1、KS、KO、GA2ox1、GA20ox1和GID1基因的擴(kuò)增效率（E）和表達(dá)量，結(jié)果（表3）顯示，以內(nèi)參基因Actin為標(biāo)準(zhǔn)，CPS1、KS、KO、GA2ox1、GA20ox1和GID1基因在4P2-9中的相對(duì)表達(dá)量分別為1.00、0.76、0.53、 1.02、0.87和0.61；在高原4號(hào)中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.99、1.05、0.81、0.66、0.61和0.69。在材料4P2-9中，CPS1和GA20ox1基因的表達(dá)量與內(nèi)參基因基本一致，KS、KO、GA2ox1和GID1基因的表達(dá)量較內(nèi)參偏低；在材料高原4號(hào)中，除KS外，其它基因的表達(dá)量較內(nèi)參基因均偏低。

馬鈴薯CPS1、KS、KO、GA2ox1、GA20ox1和GID1基因在材料4P2-9和高原4號(hào)中的差異表達(dá)結(jié)果（圖4）顯示，與對(duì)照相比，各關(guān)鍵酶基因的相對(duì)表達(dá)量均有不同程度的變化，其中，4P2-9材料中的CPS1基因表達(dá)量變化不大，為正常水平的1.012倍左右，KS、KO和GID1基因表達(dá)量有不同程度的下調(diào)，下調(diào)幅度為對(duì)照材料的0.725倍、0.657倍和0.890倍左右；GA20ox1和GA2ox1基因的表達(dá)量表現(xiàn)為上調(diào)，上調(diào)幅度為對(duì)照材料的1.557倍和1.425倍左右。

圖3 目的基因與內(nèi)參基因雙標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

表3 馬鈴薯材料赤霉素代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)情況

圖4 赤霉素代謝關(guān)鍵酶基因在4P2-9和高原4號(hào)中的相對(duì)表達(dá)結(jié)果

3 討論

赤霉素涉及植物生長(zhǎng)發(fā)育的諸多方面，這必然要求植物對(duì)體內(nèi)的赤霉素水平進(jìn)行精確的調(diào)控。這種調(diào)控主要通過控制GA合成和代謝相關(guān)的酶基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。研究表明，赤霉素在株高生長(zhǎng)發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用［9］。Curtis等［21，22］的研究表明，當(dāng)過量表達(dá)西葫蘆GA20-氧化酶會(huì)產(chǎn)生GA缺失突變體表型，如植株矮化、葉色加深等，轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)源GA含量降低。Lee等［23］克隆了菠菜的GA2-氧化酶基因，編碼含337個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白，能夠在大腸桿菌異源表達(dá)，催化GA9和GA20轉(zhuǎn)變?yōu)镚A51和GA29的反應(yīng)，GA2-氧化酶維持著植物體內(nèi)具有生物活性的GAs和C19-GAs中間體之間的平衡，過量表達(dá)GA2-氧化酶常會(huì)導(dǎo)致植株矮化，GA含量降低。

通過田間及組培苗株高統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，株高突變系4P2-9材料的株高顯著低于對(duì)照材料，主要表現(xiàn)為節(jié)間數(shù)的減少，但節(jié)間長(zhǎng)度卻有所增長(zhǎng)。經(jīng)細(xì)胞學(xué)觀察，并未發(fā)現(xiàn)節(jié)間細(xì)胞的拉伸，說明造成4P2-9材料節(jié)間生長(zhǎng)的原因并非為節(jié)間細(xì)胞的簡(jiǎn)單拉伸。相對(duì)定量檢測(cè)結(jié)果表明，馬鈴薯赤霉素代謝的關(guān)鍵酶基因CPS1、KS、KO、GA2ox1、GA20ox1和GID1在4P2-9材料和高原4號(hào)中發(fā)生變化，其中KS基因和KO基因的表達(dá)量顯著下調(diào)，導(dǎo)致了在赤霉素代謝后期代謝階段GA20ox1基因和GA2ox1基因表達(dá)量的顯著上調(diào)，GA20ox1基因和GA2ox1基因的過量表達(dá)最終導(dǎo)致GA含量的降低，表現(xiàn)為赤霉素受體基因GID1的下降［24］，最終促使4P2-9材料的株高變化，GA20-氧化酶是嚴(yán)格調(diào)控的酶，既受活性GA反饋調(diào)節(jié)，又受光周期調(diào)控，過量表達(dá)GA20-氧化酶，植物通常會(huì)表現(xiàn)為節(jié)間伸長(zhǎng)，葉色變淡等特征［25，26］，表明赤霉素代謝過程中關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的改變是造成馬鈴薯材料株高突變的原因之一，其中GA20ox1和GA2ox1基因的表達(dá)量的上調(diào)是促使4P2-9材料株高降低的主要因素。另外，GA20ox1的過量表達(dá)還導(dǎo)致了突變材料節(jié)間長(zhǎng)度的增長(zhǎng)，而非簡(jiǎn)單的細(xì)胞拉伸。

當(dāng)外源T-DNA 整合進(jìn)入植物基因組，會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞的基因組造成改變，這種變化無論是對(duì)外源的T-DNA的表達(dá)還是植物基因的表達(dá)都會(huì)產(chǎn)生影響［27］。RNA干涉載體在馬鈴薯基因組中的隨機(jī)整合致使基因組發(fā)生了重排，這種重排包括植物基因組整合位點(diǎn)的刪除和重復(fù)，T-DNA 序列的刪除和重復(fù)，以及染色體上的易位和倒位［28］。特定位點(diǎn)基因序列的改變導(dǎo)致了基因表達(dá)量的變化，包括赤霉素代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因，表現(xiàn)為本研究材料的株高突變。

4 結(jié)論

通過細(xì)胞學(xué)方法觀察馬鈴薯材料4P2-9的株高突變性狀主要表現(xiàn)為莖段節(jié)間數(shù)的減少，其次為節(jié)間的增長(zhǎng)，且這種增長(zhǎng)并非是由節(jié)間細(xì)胞拉伸造成的。利用Real-time PCR方法對(duì)赤霉素代謝途徑中關(guān)鍵酶基因的相對(duì)表達(dá)量分析表明，馬鈴薯材料4P2-9的KS和KO基因表達(dá)量顯著降低，GA20ox1和GA2ox1基因表達(dá)量顯著升高，為促使4P2-9材料株高降低的主要因素。

［1］ Carrera E， Bou J， Garcfa-Martinez JL， Prat S. Changes in GA20-oxidase gene expression strongly affect stem length， tuber induction and tuber yield of potato plants［J］. Plant Journal， 2000， 22（3）：247-256.

［2］ Sakamoto T， Miura K， Itoh H， et al. An overview of gibberellin metabolism enzyme genes and their related mutants in rice［J］. Plant Physiol， 2004， 134（4）：1642-1653.

［3］ 虞慧芳， 曹家樹， 王永勤. 植物矮化突變體的激素調(diào)控［J］.生命科學(xué)， 2002， 14（2）：85-88.

［4］ 劉潔， 李潤植. 作物矮化基因與GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［J］. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2005， 21（1）：37-40.

［5］ Toyomasu T， Kawaide H， Sekimoto H， et al. Cloning and characterization of a cDNA encoding gibberellin 20-oxidase from rice（Oryza sativa）seedlings［J］. Physiologia Plantarum， 1997，99（1）：111-118.

［6］ 岳川， 曾建明， 曹紅利， 等. 茶樹赤霉素受體基因CsGID1a的克隆與表達(dá)分析［J］. 作物學(xué)報(bào)， 2013， 39（4）：599-608.

［7］ Peng JR， Richards DE， Hartley NM， et al. “Green revolution” genes encode mutant gibberellin response modulators［J］. Nature， 1999，400（6741）：256-261.

［8］ Monna LN， Kitazawa R， Yoshino J， et al. Positional cloning of rice semi-dwarfing gene， sd-1：Rice “green revolution gene” encodes a mutant enzyme involved in gibberellin synthesis［J］. DNA Res，2002， 9（1）：11-17.

［9］ 王秀莉， 姚穎垠， 彭惠茹， 等. 赤霉素代謝及其調(diào)控相關(guān)基因的差異表達(dá)與小麥株高雜種優(yōu)勢(shì)的關(guān)系研究［J］. 科學(xué)通報(bào)，2009， 54（16）：2320-2324.

［10］ 楊進(jìn)， 楊遠(yuǎn)柱， 林建中， 等. 水稻赤霉素代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)的檢測(cè)分析［J］. 生物技術(shù)通報(bào)， 2009（6）：81-84.

［11］ 李強(qiáng)， 吳建民， 梁和， 等. 高等植物赤霉素生物合成及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［J］. 生物技術(shù)通報(bào)， 2014（10）：16-22.

［12］ Grennan AK. Gibberellin metabolism enzymes in rice［J］. Plant Physiology， 2006， 141（2）：524-526.

［13］ 談心， 馬欣榮. 赤霉素生物合成途徑及其相關(guān)研究進(jìn)展［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)， 2008， 14（4）：571-577.

［14］ 張馳宇， 徐順高， 黃新祥. 一種新穎簡(jiǎn)便的熒光實(shí)時(shí)RT-PCR相對(duì)定量方法的建立［J］. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展， 2005，32（9）：883-888.

［15］ 倪中福， 孫其信， 吳利民， 等. 小麥種間與品種間雜交種及其親本之間基因差異表達(dá)比較研究［J］. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2001， 9（4）：366-370.

［16］ 王西成， 任國慧， 房經(jīng)貴， 等. 葡萄赤霉素合成相關(guān)基因克隆、亞細(xì)胞定位和表達(dá)分析［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012， 45（11）：2224-2231.

［17］ 王西成， 吳偉民， 房經(jīng)貴， 等. 葡萄赤霉素受體基因VvGID1A的分離、亞細(xì)胞定位及表達(dá)分析［J］. 園藝學(xué)報(bào)， 2013， 40（5）：839-848.

［18］ 鐘希瓊， 王惠珍. 高等植物赤霉素生物合成及其調(diào)節(jié)研究進(jìn)展［J］. 植物學(xué)通報(bào)， 2001， 18（3）：303-307.

［19］ 李飛， 徐建飛， 劉杰， 等. 冷馴化前后野生馬鈴薯Solanum acaule內(nèi)參基因的篩選［J］. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2012， 25（5）：1592-1595.

［20］ PfaffI MW. A new mathematical model for relative quantification inreal-time RT-PCR［J］. Nucleic Acids Research， 2001， 29（9）：e45.

［21］ Curtis IS， Ward DA， Thomas SG， et al. Induction of dwarfism in transgenic Solanum dulcamara by over-expression of a gibberellin 20-oxidase cDNA from pumpkin［J］. Plant J， 2000， 23（3）：329-338.

［22］ Niki T， Nishijima T， Nakayama M， et al. Production of dwarf lettuce by overexpressing a Pumpkin Gibberelling 20-oxidasegene［J］. Plant Physiol， 2001， 126（3）：965-972.

［23］ Lee DJ， Zeevaart JAD. Differential regulation of RNA levels of gibberellin dioxygenases by photoperiod in spinach［J］. Plant Physiol， 2002， 130（4）：2085-2094.

［24］ Zhang Y， Ni ZF， Yao Y， et al. Gibberellins and heterosis of plant height in wheat（Triticum aestivum L.）［J］. BMC Genetics， 2007， 8（1）：40-50.

［25］ Huang SS， Raman AS， Ream JE， et al. Overexpression of GA20-oxidase confers a gibberellin-overproduction phenotype in Arabidopsis［J］. Plant Physiol， 1998， 118（3）：773-781.

［26］ 吳建明， 李楊瑞， 王愛勤， 等. 赤霉素誘導(dǎo)甘蔗GA20-Oxidase基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR分析［J］. 分子植物育種， 2009， 7（5）：922-927.

［27］ 楊琳， 付鳳玲， 李晚忱. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因植物T-DNA的整合方式［J］. 遺傳， 2011， 33（12）：1327-1334.

［28］ 楊繼芳， 劉明， 安利佳. T-DNA 整合的研究進(jìn)展［J］. 遺傳，2004， 26（6）：991-996.

（責(zé)任編輯馬鑫）

The Differential Expression of Genes for Key Enzymes in Gibberellin Metabolism in Potato Mutant

SHI Jian-bin1YANG Yong-zhi1，2WANG Jian1，2
（1. Qinghai University，Xining 810016；2. Qinghai Academy of Agricultural and Forestry Sciences，The Key Lab of Qinghai-Tibetan Plateau Biotechnology of Ministry of Education，Key Laboratory of Germplasm Innovation and Utilization of Plateau Crop in Qinghai Province，Xining 810016）

In order to reveal the correlation between the mutation of plant height and genes of key enzymes in gibberellin（GA）metabolic pathway， using the mutant strain 4P2-9 of potato as materials， we established double standard curve by relative quantitative RT-PCR，and tested the expression of GA metabolism-related genes in the “Plateau 4” and its mutant “4P2-9” using Actin gene as reference gene. The results showed that the plant height and the internode number of 4P2-9 significantly were lower than the control material（P＜0.05）；however，the internode length was significantly higher than the control（P＜0.05）， moreover the expressions of gene KS， KO and GID1 for key enzymes in GA metabolism were significantly down-regulated， and were 0.725， 0.657 and 0.890 times the control， respectively. The expressions of GA20ox1 and GA2ox1 genes were increased， and were 1.425 and 1.557 times the control， respectively. The results revealed that the expression changes of genes for key enzymes in the GA metabolism was one reason of the variation of 4P2-9 plant height， and the up-regulation of gene GA20ox1 and GA2ox1 expression was the main factor for the decrease of plant height.

potato；mutation of plant-height；GA；gene expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.021

2015-04-16

青海省科技廳專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（2013-Z-720），現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（CARS-10）

石建斌，男，博士研究生，研究方向：馬鈴薯遺傳育種；E-mail：shijanbin@163.com

王艦，男，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：馬鈴薯種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用改良研究；E-mail：wangjian2197@sohu.com