王一帆 李臻 潘教文 王慶國 劉煒

摘要：本研究以“豫谷1號”cDNA為模板，通過PCR技術獲得類受體蛋白激酶基因SiRLK35（NCBI登錄號：XM_004956247.2 ）的全長序列。生物信息學分析顯示，該基因編碼蛋白由392個氨基酸殘基構成，包含一個S_TKc保守結構域以及一個TFS2N結構域，含3個跨膜結構域，N端有信號肽。 SiRLK35基因經(jīng)BamHⅠ、SalⅠ雙酶切后，利用pET-28a構建原核表達載體，轉化大腸桿菌菌株BL21（DE3），經(jīng)0.5 mmol/L IPTG于25℃誘導12 h后，在44.6 kD處得到一明顯誘導表達蛋白條帶，表達產物與預期相符，證明SiRLK35基因可在大腸桿菌中誘導表達。該結果為進一步研究SiRLK35基因功能奠定基礎。

關鍵詞：谷子；類受體蛋白激酶；SiRLK35；原核表達

中圖分類號：S515+Q78文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）09-0001-05

Cloning of Receptor-Like Protein Kinase Gene SiRLK35

from Foxtail Millet and Its Prokaryotic Expression

Wang Yifan1， 2，Li Zhen1，Pan Jiaowen1，Wang Qingguo1，Liu Wei1*

（1. Biotechnology Research Center， Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Provincial Key Laboratory of

Crop Genetic Improvement， Ecology and Physiology， Jinan 250100， China；

2. College of Life Sciences， Qingdao Agricultural University， Qingdao 266109， China）

AbstractIn this research， the full-length sequence of receptor-like protein kinase gene SiRLK35 （NCBI accession number： XM_004956247.2） was amplified by PCR technique with the cDNA of Yugu 1 as template. Bioinformatics analysis showed that the protein product of SiRLK35 was composed of 392 amino acids. It contained one S_TKc conserved domain， one TFS2N domain， three transmembrane domains and a N terminal signal peptide. The sequence of SiRLK35 was digested with BamHⅠ and SalⅠ， and then the recombined prokaryotic expression vector pET-28a-SiRLK35 was constructed successfully through connecting the fragment with pET-28a. The recombinant was further transformed into E.coli strain BL21 （DE3）. Induced with 0.5 mmol/L IPTG， a 44.6 kD fusion protein was obtained， which proved that the SiRLK35 could be induced to express in E.coli. This research layed a good foundation for further study of the function of SiRLK35 gene.

KeywordsFoxtail millet； Receptor-like protein kinase； SiRLK35； Prokaryotic expression

谷子[Setaria italica （L.） Beauv.]又稱為粟，是起源于我國的古老作物，具有抗旱耐貧瘠的特點，是旱作生態(tài)農業(yè)的重要組成部分。近年來，其營養(yǎng)保健價值、國際競爭力和產量潛力受到研究者的普遍關注[1]。對谷子進行有目的、有針對性的品質、性狀研究及抗逆機制的解析是現(xiàn)代谷子基因組學研究發(fā)展的重要方向。

前期研究中，通過同位素標記相對與絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術，以自然干旱處理的“豫谷1號”幼苗為材料，篩選到一個響應干旱、蛋白表達量明顯下調的類受體蛋白激酶（編號K3ZRC5），對其編碼基因序列分析顯示，其屬于S-類受體蛋白激酶亞家族，命名為SiRLK35，推測其可能參與谷子干旱響應過程，并在谷子抗旱過程中發(fā)揮作用。

類受體蛋白激酶（receptor-like protein kinases， RLKs）在植物中廣泛存在，數(shù)量眾多，具有較廣泛的生物學功能[2]。動物、植物中的RLKs具有較高的同源性，結構上主要包括胞外受體結構域、跨膜結構域、胞內激酶域三部分[3]，作為信號分子受體，它們能夠感知胞外信號并將信號傳遞至胞內。植物RLKs廣泛參與植物的生長發(fā)育、自交不親和、生物與非生物脅迫及激素響應等諸多過程[4，5]。

根據(jù)胞外氨基端序列的不同，植物RLKs主要分為包含S-類受體蛋白激酶在內的10個亞家族，Walker等[6]在1990年首次從玉米中鑒定到S-類受體蛋白激酶Zmpk1，之后在其它物種中該類RLKs也相繼被發(fā)現(xiàn)。

本研究擬圍繞SiRLK35基因進行較為系統(tǒng)的生物信息學分析，并通過構建原核表達載體pET-28a-SiRLK35，轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，對基因的誘導表達及蛋白產物做進一步研究，為將該基因應用于谷子抗旱研究提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

研究所用材料為“豫谷1號”。

TransTaq DNA Polymerase High Fidelity（HiFi）試劑盒、T4 DNA Ligaes試劑盒、2×EasyTaq SuperMix及Trans2K Plus DNA Marker均購于Transgen公司（山東濟南雨同生物科技有限公司），PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒、pMD18-T Vector試劑盒、pET-28a載體及DL5000 DNA Marker均購于TaKaRa公司，純質粒小量制備試劑盒購于BioTeke公司（濟南承森貿易有限公司），薄型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購于GENERAY Biotechnology，引物由上海英濰捷基公司合成，其余試劑為進口或國產分析純。

1.2谷子幼苗RNA的提取及單鏈cDNA的獲得

取培養(yǎng)3周的“豫谷1號”幼苗，按TransZol Plant試劑盒說明書提供的方法提取谷子RNA，并參照PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書將所得到谷子RNA反轉錄成單鏈cDNA。

1.3SiRLK35基因的克隆

根據(jù)SiRLK35基因序列，使用Primer Premier 5設計引物SiRLK35S12：5′-CGGGATCCATGGAAGCCTTCATGGGCATC-3′，SiRLK35A12：5′-CGGTCGACTAAATTTGACTTCATTTCAGCCAGCTG-3′（下劃線分別為BamHⅠ、SalⅠ酶切位點），以谷子幼苗cDNA為模板，PCR反應體系為：2×EasyTaq SuperMix 10 μL、引物SiRLK35S12及引物SiRLK35A12各0.5 μL、cDNA 1 μL、ddH2O補齊到20 μL。反應程序設置如下：94℃ 5 min；94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 1 min 20 s，35個循環(huán)；72℃ 10 min。

1.4SiRLK35基因編碼蛋白的生物信息學分析

使用ExPASy （http：//www.expasy.org/#）網(wǎng)站預測SiRLK35基因編碼蛋白分子量、等電點，使用SMART（http：//smart.embl- heidelberg.de/）網(wǎng)站預測SiRLK35蛋白結構域，使用SignalP4.1 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）網(wǎng)站對其進行信號肽分析，使用TMPred （http：//www.ch.embnet.org/software/ TMPRED_form.html）網(wǎng)站分析其跨膜結構域。

1.5SiRLK35原核表達載體的構建

將經(jīng)PCR擴增得到的SiRLK35基因回收純化，與pMD18-T載體用T4 DNA連接酶于22℃連接5 min，轉化大腸桿菌Trans 5α感受態(tài)細胞，均勻涂于100 mg/L Amp抗性LB平板，于37℃倒置過夜培養(yǎng)。對構建的中間表達載體，挑取單克隆經(jīng)菌落PCR鑒定后，送至山東省農業(yè)科學院生物技術研究中心測序室測序。

使用BamHⅠ、SalⅠ分別酶切測序正確的pMD18-T-SiRLK35質粒及原核表達載體pET-28a，回收純化酶切片段，用T4 DNA連接酶22℃連接5 min，轉化大腸桿菌Trans 5α感受態(tài)細胞，酶切檢測。選擇鑒定正確的pET-28a-SiRLK35質粒轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，均勻涂于100 mg/L Kan抗性LB平板37℃倒置過夜培養(yǎng)，挑取單克隆經(jīng)菌落菌液PCR鑒定，獲得陽性菌株。

用pET-28a質粒轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，均勻涂于100 mg/L Kan抗性LB平板，于37℃倒置過夜培養(yǎng)，挑取單克隆經(jīng)菌落PCR鑒定，獲得陰性對照。

1.6SiRLK35融合蛋白的誘導表達及SDS-PAGE鑒定

分別將含有重組質粒pET-28a-SiRLK35的BL21（DE3）菌株及陰性對照菌株于37℃振蕩培養(yǎng)，菌液按1∶50比例用液體LB培養(yǎng)基稀釋，培養(yǎng)至OD600≈0.6，加入IPTG（終濃度為0.5 mmol/L）于25℃、200 r/min誘導12 h。收集菌液經(jīng)超聲波破碎后，5 000 r/min離心10 min，分別取破碎菌液、上清、沉淀進行12%SDS-PAGE電泳，經(jīng)染色、脫色后觀察并拍照。

2結果與分析

2.1SiRLK35基因的克隆

2.2SiRLK35基因編碼蛋白的生物信息學分析

通過ExPASy網(wǎng)站預測SiRLK35基因編碼蛋白包含392個氨基酸殘基，分子量為44.6 kD，等電點為6.88。使用SMART網(wǎng)站分析SiRLK35蛋白結構域，結果顯示，在1～200氨基酸之間含有一個S_TKc保守結構域，為Ser/Thr蛋白激酶區(qū)，在311～386氨基酸之間有一個TFS2N結構域（圖2）。通過SignalP4.1網(wǎng)站對其進行信號肽分析，結果顯示，代表C值的線段在第30個氨基酸處分值較高，顯示該處為信號肽剪切位點，1～28個氨基酸殘基屬信號肽，第29和第30個氨基酸殘基之間為信號肽裂解點（圖3）。使用TMPred網(wǎng)站分析顯示SiRLK35蛋白有3個跨膜結構域。

使用BamHⅠ、SalⅠ雙酶切pMD18-T-SiRLK35質粒，回收純化SiRLK35片段，定向連入原核表達載體pET-28a中，轉化大腸桿菌Trans 5α菌株，酶切驗證，得到預期大小片段（圖5）。轉化大腸桿菌BL21（DE3）菌株，進一步進行菌落PCR鑒定，篩選到陽性克隆，獲得SiRLK35的原核表達載體pET-28a-SiRLK35 。

M：Trans2K Plus DNA Marker；1：酶切片段。

圖5pET-28a-SiRLK35酶切驗證

M：DL5000 DNA Marker；H2O：空白對照；-：陰性對照，空載體

pET-28a；+：陽性對照，質粒pET-28a-SiRLK35；1～7：陽性克隆。

圖M：Blue Plus Ⅱ Protein Marker；1、2、3分別為含pET-28a-SiRLK35菌株誘導12 h后的上清、破碎菌液和沉淀；4、5、6分別為含pET-28a菌株誘導12 h后的上清、菌體上清混合物和沉淀。

圖8SiRLK35融合蛋白誘導表達

3討論與結論

谷子是起源于我國的傳統(tǒng)作物，在我國北方地區(qū)種植廣泛。谷子根系發(fā)達，蒸騰系數(shù)低，具有突出的抗旱性能[7]。近期，谷子基因組測序工作的完成為從分子水平揭示谷子抗旱機制奠定了基礎[8]。

本課題組通過iTRAQ技術，以干旱處理的“豫谷1號”幼苗為材料，篩選到一個S-類受體蛋白激酶基因，命名為SiRLK35，檢索其序列并設計特異性引物，以谷子cDNA為模板，利用PCR技術成功克隆到基因全長。生物信息學分析顯示，SiRLK35基因編碼蛋白由392個氨基酸殘基構成，等電點為6.88；結構分析顯示，SiRLK35蛋白包含一個S_TKc保守結構域，為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶區(qū)，帶有磷酸化位點，是信號級聯(lián)反應中心[9]，此外還含有一個TFS2N結構域；信號肽分析顯示，該蛋白N端有信號肽，推測屬于分泌型蛋白；跨膜結構域分析顯示，該蛋白含3個跨膜結構域，符合類受體蛋白激酶結構特征。

外源基因表達系統(tǒng)在生物學研究中應用普遍，其中大腸桿菌表達系統(tǒng)是蛋白表達技術中發(fā)展最早的一項[10]。盡管大腸桿菌表達系統(tǒng)無法進行翻譯后加工（肽鏈折疊、氨基酸的修飾等），表達的蛋白多以無生物活性的包涵體形式存在，但其憑借培養(yǎng)方便、價格低廉、可大規(guī)模生產、遺傳背景清楚、能夠高水平表達外源基因、寄主菌株及載體較多以及安全性好等諸多優(yōu)點[11]，依然是目前應用最普遍、最成熟的外源基因表達系統(tǒng)[12]。pET系統(tǒng)能阻止影響宿主細胞生長速度的毒性基因的克隆且能優(yōu)化靶蛋白表達，廣泛應用于大腸桿菌表達系統(tǒng)[13]，BL21（DE3）是pET系統(tǒng)最常用的表達宿主菌。IPTG是在誘導表達系統(tǒng)中最常使用的誘導劑，穩(wěn)定且不被細菌代謝。大腸桿菌表達系統(tǒng)廣泛應用在多個物種的基因外源表達中，楊書玲等[14]克隆了小麥TaPDK基因，通過大腸桿菌實現(xiàn)了表達并將蛋白純化；宋楊等[15]克隆了短枝型蘋果MdRGL基因，并通過pEGX-4T表達載體在大腸桿菌中實現(xiàn)了該基因的表達；趙麗等[16]在大腸桿菌中實現(xiàn)了水稻類受體蛋白激酶OsESG1的原核表達。

本研究利用pET系統(tǒng)構建了SiRLK35基因的原核表達載體pET-28a-SiRLK35，轉入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，經(jīng)0.5 mmol/L IPTG于25℃、200 r/min誘導12 h，實現(xiàn)了SiRLK35基因在大腸桿菌中的表達，且誘導表達的蛋白在沉淀中含量較多，推測其主要以包涵體的形式存在，為進一步研究該基因功能以及抗體制備奠定了基礎。下一步將在該工作的基礎上，擬通過分離、純化目的蛋白，進而制備蛋白特異性抗體，檢測SiRLK35蛋白在植物中的表達情況，為進一步解析SiRLK35基因功能奠定基礎。

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