譚擁軍 陳竹林++陳團(tuán)輝++向勤??

摘要：構(gòu)建FOXA1的原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)并純化后獲得人FOXA1的C端和N端蛋白片段，為尋找FOXA1的互作蛋白提供材料基礎(chǔ).提取人乳腺癌細(xì)胞MCF7的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計(jì)引物PCR克隆FOXA1的cDNA，再以此為模板擴(kuò)增FOXA1的C端、N端cDNA片段，分別并克隆進(jìn)帶有GST標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pGEX4T1，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒.雙酶切及測(cè)序鑒定正確后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 Rosetta DE3，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，Glutathione Sepharose 4B親和純化，通過(guò)SDSPAGE電泳及Western blot確定FOXA1蛋白的表達(dá).與MCF7細(xì)胞裂解液孵育，進(jìn)行GSTPull down試驗(yàn)，檢測(cè)純化蛋白與FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.成功構(gòu)建pGEX4T1FOXA1C和 pGEX4T1FOXA1N的原核表達(dá)載體；在大腸桿菌中誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)；經(jīng)Glutathione Sepharose 4B純化后，獲得了人FOXA1的C端蛋白片段GSTFOXA1C與N端蛋白片段GSTFOXA1N；證實(shí)GSTFOXA1C能與FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)錄因子FOXA1；原核表達(dá)；相互作用蛋白

中圖分類(lèi)號(hào)：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

轉(zhuǎn)錄因子FOXA1屬于叉頭框（Forkhead Box， Fox）轉(zhuǎn)錄因子家族的FOXA亞家族[1].FOX基因廣泛地分布于從酵母到人的各種真核生物中，構(gòu)成一個(gè)龐大的轉(zhuǎn)錄因子家族.其中在哺乳動(dòng)物中就擁有40個(gè)以上成員，分別參與細(xì)胞分化、增殖、代謝及細(xì)胞凋亡等生理過(guò)程的調(diào)節(jié)[2]. FOXA1是該家族最早被克隆的成員[3].

FOXA1蛋白介導(dǎo)許多蛋白的相互作用，調(diào)節(jié)發(fā)育、代謝和腫瘤的發(fā)生.FOXA1的功能區(qū)域由 DNA結(jié)合區(qū)和轉(zhuǎn)錄激活區(qū)構(gòu)成.作為先鋒轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)OXA1的羧基端能與核心組蛋白H3，H4相互作用[4] 加強(qiáng)了FOXA1蛋白與核小體的結(jié)合能力.有研究表明轉(zhuǎn)錄因子FOXA1 羧基端的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)可以招募TLE3/GRG3結(jié)合到染色質(zhì)上[5].而FOXA1 DNA結(jié)合區(qū)可以干擾轉(zhuǎn)錄因子NKX2.1與DNA的結(jié)合功能從而抑制NKX2.1轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的形成，抑制腦肺和甲狀腺的發(fā)育[6].此外，F(xiàn)OXA1的DNA結(jié)合區(qū)還介導(dǎo)FOXA1與雄激素受體（AR）的相互作用[7]，而在乳腺癌細(xì)胞株中，雌激素的應(yīng)答在一定程度上依賴(lài)于FOXA1的表達(dá)[8-9].

為了進(jìn)一步研究FOXA1在細(xì)胞中扮演的角色，本研究通過(guò)基因工程技術(shù)體外構(gòu)建表達(dá)載體，誘導(dǎo)可溶性融合蛋白 GSTFOXA1C和GSTFOXA1N 的高效表達(dá)并親和純化.利用 GSTPull down技術(shù)，在乳腺癌細(xì)胞MCF7中證實(shí)GSTFOXA1C可與已知的FOXA1結(jié)合蛋白TLE3發(fā)生相互作用，證明純化蛋白結(jié)構(gòu)正確且能與其互作蛋白發(fā)生互作，為進(jìn)一步尋找FOXA1的互作蛋白提供材料基礎(chǔ).

1材料與方法

1.1菌種、質(zhì)粒、細(xì)胞系

大腸桿菌DH5α感受（北京鼎國(guó)），大腸桿菌BL21 Rosetta（DE3）感受態(tài)（廣州百恩維），質(zhì)粒pGEX4T1由本實(shí)驗(yàn)室保存，乳腺癌細(xì)胞MCF7為本實(shí)驗(yàn)室凍存.

1.2主要試劑

限制性?xún)?nèi)切酶BamHI，XhoI，T4 DNA連接酶均購(gòu)自Fermentas公司，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)于Promega公司，DNA高保真聚合酶購(gòu)于TOYOBO公司，PCR 引物由上海生工生物公司合成，Glutathione Sepharose 4B購(gòu)于GE，GST抗體購(gòu)于碧云天，V5抗體購(gòu)于Millpore公司.

1.3重組質(zhì)粒pGEX4T1FOXA1N，pGEX4T1FOXA1C的構(gòu)建及其鑒定

根據(jù)NCBI檢索到的人源FOXA1的cDNA序列以及空載體PGEX4T1的多克隆位點(diǎn)確定FOXA1的上下游引物如表1所示.上游引物為CCC GGA TCC ATG TTA GGA ACT GTG AAG，下劃線(xiàn)為BamH I 酶切位點(diǎn)，下游引物為CGC TCT AGA GGA AGT GTT TAG GAC GGG，下劃線(xiàn)為EcoR I 酶切位點(diǎn).以人的乳腺癌細(xì)胞MCF7提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94 ℃ 2 min ；98 ℃ 10 s，68 ℃ 90 s，68 ℃ 10 min，32個(gè)循環(huán).將 PCR產(chǎn)物克隆入pGEX4T1質(zhì)粒中，雙酶切鑒定后送上海生工測(cè)序.以測(cè)序正確的pGEX4T1FOXA1為模板，F(xiàn)OXA1C上游引物GCG CGA ATT CAA CCA CCC GTT CTC CAT CAA，F(xiàn)OXA1C下游引物GCG CCT CGA GTC ATT GGT AGT ACG CCG GCT CCA G；FOXA1N上游引物GCG CGA ATT CAT GTC CTA GGC CAA CCC GG，F(xiàn)OXA1N下游引物GCG CCT CGA GCT AGG CGT GCG GGT AGC TGC GC.分別克隆FOXA1的C端（第397到第461個(gè)氨基酸）、N端（第66到第218個(gè)氨基酸）.

1.4GSTFOXA1C，GSTFOXA1N融合蛋白的純化及其鑒定

將測(cè)序正確的pGEX4T1FOXA1N，pGEX4T1FOXA1C轉(zhuǎn)化入BL21 Rosetta DE3感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性單克隆，加入含有氨芐青霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，培養(yǎng)至OD值在0.6～1.0之間，加入終濃度為0.8 mmol/L IPTG，32 ℃誘導(dǎo)4 h后收集菌液，溶菌酶酶解30 min，超聲破碎，取上清加入GSTbeads室溫孵育30 min后，加入Elution Buffer洗脫，收集洗脫后的蛋白，考染和免疫印跡鑒定.

1.5GST pull down

MCF7細(xì)胞培養(yǎng)至60%～90%時(shí)，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染帶V5標(biāo)簽的TLE3真核表達(dá)質(zhì)粒，48 h后收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，加入500 μL IP裂解液冰上裂解1 h，13 000 r/min，4 ℃，離心15 min，收集上清，即為總的細(xì)胞裂解液.向收集的細(xì)胞裂解液中加入20 μL GSTbeads，4 ℃，孵育2 h，離心收集上清，一分為二，分別加入20 μL GSTbeads和純化后的GSTFOXA1C，GSTFOXA1N蛋白，4 ℃旋轉(zhuǎn)結(jié)合2 h，4 000 r/min離心收集珠子，用預(yù)冷的GST Lysis Buffer漂洗3次，加入Elution Buffer洗脫，收集洗脫后的蛋白，進(jìn)行考染和免疫印跡鑒定.

2結(jié)論

2.1人FOXA1基因全長(zhǎng)的擴(kuò)增

MCF7細(xì)胞 RNA的提取按照Total RNA KitI試劑盒（Omega，USA）進(jìn)行，運(yùn)用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen，USA）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA.通過(guò)NCBI查詢(xún)?nèi)薋OXA1的cDNA序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，再以cDNA為模板PCR擴(kuò)增人的FOXA1全長(zhǎng)（圖1）所示，通過(guò)PCR擴(kuò)增出來(lái)的FOXA1 cDNA大小為1 400 bp左右，與NCBI查詢(xún)的大小基本一致.

2.2重組質(zhì)粒pGEX4T1FOXA1N，pGEX4T1FOXA1C的構(gòu)建

再以此為模板擴(kuò)增FOXA1C/FOXA1N，大小分別為196 kb，459 kb，與預(yù)期大小一致.將PCR克隆獲得的片段克隆至表達(dá)載體PGEX4T1，進(jìn)行雙酶切鑒定如圖2所示.我們已經(jīng)討論了FOXA1的結(jié)構(gòu)域蛋白在生物體內(nèi)發(fā)揮了重要作用，為了進(jìn)一步研究其在生物體內(nèi)的功能，所以克隆出人FOXA1的羧基端和氨基 端蛋白，為后續(xù)試驗(yàn)奠定材料基礎(chǔ).

2.3GSTFOXAC及GSTFOXA1N融合蛋白的表達(dá)及鑒定

將pGEX4T1，pGEX4T1FOXA1N，pGEX4T1FOXA1C 3個(gè)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化進(jìn)BL21 Rosetta DE3感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆大規(guī)模培養(yǎng)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，收集菌液，Western blot法檢測(cè)顯示，GSTFOXAC及GSTFOXA1N融合蛋白均能有效表達(dá)（圖3）.

2.4GSTFOXAC與GSTFOXA1N融合蛋白的純化

將pGEX4T1，pGEX4T1FOXA1N，pGEX4T1FOXA1C 3個(gè)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化進(jìn)BL21 Rosetta DE3感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆大規(guī)模培養(yǎng)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，收集菌液，酶解，超聲破碎.上清用GSTSepharose4B親和珠純化后，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果顯示，雖出現(xiàn)不同程度的降解，但均能有效地獲得較高濃度的目的GSTFOXAC及GSTFOXA1N融合蛋白（圖4）.

2.5GSTpull down結(jié)果分析

將帶有GSTFOXA1C與GSTFOXA1N融合蛋白的珠子與過(guò)表達(dá)的V5TLE3蛋白的MCF7細(xì)胞裂解液孵育后，用V5抗體進(jìn)行Western blot 法檢測(cè)（圖5）結(jié)果顯示，GSTFOXA1C融合蛋白可以與TLE3 蛋白發(fā)生結(jié)合，而GST蛋白和GSTFOXA1N融合蛋白在同一位置無(wú)此條帶，說(shuō)明FOXA1C端蛋白結(jié)構(gòu)域能夠有效的與TLE3 蛋白特異地相互作用，具有與FOXA1全長(zhǎng)蛋白部分相似的生物學(xué)功能.

1：過(guò)表達(dá)V5TLE3蛋白的MCF7細(xì)胞裂解物（Input）；2：GST蛋白與Input孵育后的Pull down產(chǎn)物；3：GSTFOXA1N融合蛋白與Input孵育后的Pull down產(chǎn)物；4：GSTFOXA1C融合蛋白與Input孵育后的Pull down產(chǎn)物

2.6Pull down結(jié)果的考馬斯亮藍(lán)分析

將帶有GSTFOXA1C融合蛋白的珠子與MCF7細(xì)胞裂解液孵育后，同時(shí)用GST蛋白與MCF7細(xì)胞裂解液孵育的結(jié)果作為對(duì)照，再用洗脫液將Pull down產(chǎn)物洗脫下來(lái)，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)，GSTFOXA1C融合蛋白能夠拖下許多與FOXA1C端相結(jié)合的互作蛋白，從而為后面的實(shí)驗(yàn)奠定材料基礎(chǔ)（圖6）.

1：Protein Maker；2：Input：MCF7 cell lysis；3：對(duì)照組GST Pull down 洗脫產(chǎn)物；4：對(duì)照組 GST Pull down 上清；5：實(shí)驗(yàn)組GSTFOXA1C Pull down洗脫產(chǎn)物；6：實(shí)驗(yàn)組GSTFOXA1C洗脫上清；7：GSTFOXA1C蛋白；8：GST蛋白

3討論

GST Pull down技術(shù)是體外確定兩個(gè)已知蛋白是否相互作用以及篩選與已知融合蛋白相互作用的未知蛋白的有效方法. 本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建GSTFOXA1結(jié)構(gòu)域蛋白的表達(dá)載體，這種構(gòu)建基因的某一段的結(jié)構(gòu)域蛋白研究其生物功能并不少見(jiàn)，有文章報(bào)道過(guò)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子FOXO基因的結(jié)構(gòu)域蛋白研究它與目的蛋白的甲基化作用[10].再摸索誘導(dǎo)條件后以比較優(yōu)化的條件誘導(dǎo)出GSTFOXA1C和GSTFOXA1N融合蛋白，作為后續(xù)試驗(yàn)的誘餌蛋白.將高表達(dá)V5TLE3的MCF7細(xì)胞裂解液中與GSTFOXA1C誘餌蛋白以最佳時(shí)間孵育后，成功捕捉與其已知的結(jié)合蛋白TLE3，證實(shí)實(shí)驗(yàn)制備的融合蛋白具有生物活性.隨后再次在MCF7裂解中以GSTFOXA1C為誘餌蛋白進(jìn)行GST Pull down，將產(chǎn)物進(jìn)行SDSPAGE后考馬斯亮藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)成功捕捉到相互作用的蛋白.

FoxA1是Fox轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，該轉(zhuǎn)錄因子屬于“螺旋轉(zhuǎn)角螺旋”類(lèi)蛋白的一個(gè)亞群.Fox家族蛋白功能涉及胚胎發(fā)育、細(xì)胞周期調(diào)控、糖類(lèi)和脂類(lèi)代謝、生物老化、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)過(guò)程， 其突變和表達(dá)異常與發(fā)育畸形、代謝性疾病以及腫瘤發(fā)生有關(guān)[11-12].已有文章得出結(jié)論FOXA1與TLE3在乳腺癌中相互作用，本文通過(guò)進(jìn)行GST Pull down成功驗(yàn)證這一結(jié)論并證實(shí)制備的蛋白具有生物活性.

TLE基因最早在1968年被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已知的家族成員共有19個(gè)[13]，是典型的轉(zhuǎn)錄輔助抑制因子家族蛋白.在哺乳動(dòng)物中，它包括TLE（transducinlike enhancer of split）1～4（人類(lèi)）.Gro / TLE蛋白家族不能直接與DNA結(jié)合，而是被各種不同類(lèi)型的轉(zhuǎn)錄因子所招募[14].有研究證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子FOXA1 羧基端的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)可以招TLE3/GRG3結(jié)合到染色質(zhì)上.本實(shí)驗(yàn)通過(guò)利用GSTFOXA1C與TLE3的體外相互作用驗(yàn)證兩者相互作用.

乳腺癌現(xiàn)已成為人類(lèi)的一大殺手，越來(lái)越多的研究證明FOXA1在乳腺癌中發(fā)揮了重要的作用，使其有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)[15-16].本文成功克隆了人的FOXA1，F(xiàn)OXA1C，F(xiàn)OXA1N基因并獲得有活性的人FOXA1C和FOXA1N蛋白，為后續(xù)進(jìn)一步尋找FOXA1的互作蛋白和制備抗體奠定了良好的基礎(chǔ).

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