兩種藥物誘導(dǎo)小鼠高血糖模型在降糖實(shí)驗(yàn)中的運(yùn)用比較與問(wèn)題探討

首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)與測(cè)試中心（100069）曹麗歌 蔣雪云 田蜜 高麗芳 羅葵 崔淑香

目前常用的糖尿病動(dòng)物模型可分為自發(fā)性、實(shí)驗(yàn)性和轉(zhuǎn)基因模型三種。國(guó)外多采用自發(fā)傾向的糖尿病近交系純種動(dòng)物制作模型，如BB（Bio Breeding）鼠，DB（Diabetes）鼠和NOD（Non-Obestiy Diabetes）鼠[1]。國(guó)內(nèi)一般是使用化學(xué)藥物選擇性地破壞胰島細(xì)胞，形成急性糖尿病模型，最常用的藥物是鏈脲佐菌素（Streptozotocin, STZ）和四氧嘧啶（Alloxan, ALX）。本文結(jié)合國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）頒布保健食品輔助降血糖功能評(píng)價(jià)方法[2]，分別采用STZ和ALX腹腔注射誘導(dǎo)小鼠高血糖模型，通過(guò)比較兩者在降血糖實(shí)驗(yàn)中的效果差異，探討建模和血糖測(cè)定的最佳方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康ICR雄性小鼠（6周齡），體重為24±2g，由維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK（京）2012－0001。動(dòng)物飼養(yǎng)場(chǎng)所由首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供，合格證號(hào)：SYXK（京）2010－0020，室內(nèi)溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度（50±20）%。喂飼真空包裝無(wú)菌飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK（京）2014-0010。

1.2 主要儀器和試劑

1.2.1 儀器，ACCU-AHEK卓越型血糖儀（羅氏公司生產(chǎn)）。

1.2.2 試劑 STZ和ALX（Sigma公司生產(chǎn)）；注射用生理鹽水（山東華魯制藥有限公司生產(chǎn)）；葡萄糖（北京現(xiàn)代東方精細(xì)化學(xué)品有限公司生產(chǎn)）；干預(yù)用保健食品地黃玉片（由某科技有限公司提供）；血糖試紙（羅氏公司生產(chǎn)）。

附表1 兩種藥物誘導(dǎo)小鼠高血糖模型體重變化（x±s，n=10）

附表2 兩種藥物造模結(jié)果的比較（x±s，n=10）

附表3 糖耐量實(shí)驗(yàn)血糖儀測(cè)定出現(xiàn)HI值情況（n=10）

附表4 糖耐量實(shí)驗(yàn)血糖值測(cè)定結(jié)果推測(cè)（x±s，n=10）

1.3 試劑配制

1.3.1 按照禁食24h后空腹體重計(jì)算稱(chēng)取STZ和ALX試劑，分別溶于注射用生理鹽水中，配制成濃度為1.2%和1.3%的溶液，由于兩種水溶液不穩(wěn)定，配制后需立即進(jìn)行腹腔注射。

1.3.2 干預(yù)用保健食品按其推薦劑量，加純凈水配制成16%的水溶液。

1.3.3 葡萄糖溶液配制濃度為10%，純凈水溶解。

1.4 方法

1.4.1 高血糖模型的建立 動(dòng)物購(gòu)入后，適應(yīng)環(huán)境3天，按體重隨機(jī)分為兩組，每組45只小鼠。將兩組動(dòng)物禁食（不禁水）4h后，尾部末梢血測(cè)定空腹血糖，作為兩組動(dòng)物的基礎(chǔ)血糖，即造模前血糖。隨后，禁食24h（自由飲水），分別腹腔注射劑量為120mg/kgBW的STZ溶液和130mg/kgBW的ALX溶液造模。6天后動(dòng)物禁食4h，血糖儀測(cè)血糖，血糖值10～25mmol/L為高血糖模型成功動(dòng)物。比較兩組的成模率和死亡率。

1.4.2 糖耐量實(shí)驗(yàn) 選高血糖模型動(dòng)物按禁食4h的血糖水平隨機(jī)分成4個(gè)組，分別是STZ模型組、STZ干預(yù)組、ALX模型組和ALX干預(yù)組（組間差不大于1.1mmol/L）。干預(yù)組經(jīng)口給予保健食品，模型組給予純凈水，連續(xù)30天。各組動(dòng)物禁食4h小時(shí)，血糖儀測(cè)定給葡萄糖前（即0小時(shí)）血糖值，干預(yù)組最后一次給予保健食品，模型組給予同體純凈水，20分鐘后各組經(jīng)口給予葡萄糖2.0g/kg BW，剪尾測(cè)定給予葡萄糖后各組0.5h、2h的血糖值。

1.5 觀(guān)察指標(biāo)

1.5.1 體重 動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境后稱(chēng)量體重即實(shí)驗(yàn)前體重；成模分組后體重及糖耐量實(shí)驗(yàn)（實(shí)驗(yàn)結(jié)束前）禁食前體重。

1.5.2 血糖值 造模前基礎(chǔ)血糖值；造模后血糖值；糖耐量實(shí)驗(yàn)中0h、0.5h和2h血糖值及血糖儀HI值的出現(xiàn)頻率比較；比較生化儀和血糖儀測(cè)定血糖值。

1.5.3 觀(guān)察造模后比較STZ和ALX的成模率和死亡率以及分組后的死亡率。

1.5.4 觀(guān)察實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物的精神狀態(tài)、進(jìn)食量、飲水量及排尿量。

1.6 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)用均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，體重和血糖值采用單因素方差分析，HI值的出現(xiàn)頻率、成模率和死亡率采用卡方檢驗(yàn)，儀器比對(duì)血糖值采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 建模后動(dòng)物的大體觀(guān)察 建模后小鼠飲水及排尿量明顯增加，進(jìn)食量正常，皮毛蓬松，精神尚可。1只出現(xiàn)尾部潰爛，2只出現(xiàn)前肢潰爛。尾部潰爛可能與多次取血有關(guān)，而前肢潰爛可能為高血糖的并發(fā)癥所致。

2.2 體重變化 兩種藥物誘導(dǎo)小鼠高血糖模型體重變化見(jiàn)附表1。兩種藥物誘導(dǎo)在造模前、造模后6天和36天時(shí)的體重均無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但是ALX干預(yù)組在造模后6天體重出現(xiàn)略微下降，ALX兩個(gè)組的體重標(biāo)準(zhǔn)差（4.75；3.49）均大于STZ誘導(dǎo)的兩個(gè)組（1.45；1.93）。

2.3 血糖值的變化、成模率和死亡率兩種藥物造模結(jié)果的比較見(jiàn)附表2。造模前與造模6天血糖值均無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但ALX組6天血糖值（16.08；16.22）高于STZ組（13.85；13.90），存在生物學(xué)意義；成模率和成模前后的死亡率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異（P＞0.05）。ALX組成模率稍低于STZ組，死亡率出現(xiàn)在ALX組成模期間和STZ干預(yù)組成模后。

2.4 糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果

附圖 STZ組與ALX誘導(dǎo)小鼠高血糖模型血糖水平變化

2.4.1 HI值的出現(xiàn) 在糖耐量實(shí)驗(yàn)中，用血糖儀測(cè)定尾部末梢血糖值時(shí)出現(xiàn)了“HI”值情況，提示測(cè)定結(jié)果超過(guò)了儀器的檢測(cè)上限，通過(guò)統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)的這種情況（見(jiàn)附表3），發(fā)現(xiàn)兩種藥物誘導(dǎo)模型在0.5h時(shí)存在明顯的差異，具體表現(xiàn)在ALX模型組出現(xiàn)HI值數(shù)量明顯少于STZ模型組（P＜0.01）；ALX干預(yù)組出現(xiàn)HI值數(shù)量少于STZ干預(yù)組（（P＜0.05）；綜合兩者出現(xiàn)情況統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)率，ALX組出現(xiàn)HI值頻率明顯少于STZ組（P＜0.01）。在0h和2h時(shí)，兩組HI值出現(xiàn)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但總體上在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)ALX組也有少于STZ組的趨勢(shì)。

2.4.2 血糖值測(cè)定結(jié)果推測(cè) 由于HI值的出現(xiàn)，血糖值無(wú)法準(zhǔn)確到數(shù)值，根據(jù)血糖儀檢測(cè)限值（0.6～33.3mmol/L），假設(shè)HI值均為≥33.4mmol/L，得到下面的結(jié)果（見(jiàn)附表4），與造模結(jié)果不同，ALX誘導(dǎo)的兩個(gè)組別血糖值在3個(gè)時(shí)點(diǎn)均低于STZ誘導(dǎo)的組別，且ALX模型組在0h和2h由于沒(méi)有出現(xiàn)HI值情況所得數(shù)值為真實(shí)血糖值（x ±s）。

通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)可以得出兩種藥物誘導(dǎo)血糖值變化曲線(xiàn)見(jiàn)附圖（排除保健食品影響，只顯示STZ模型組和ALX模型組的血糖變化）。

附圖顯示，STZ組與ALX組在造模前血糖值幾乎沒(méi)有差異，隨著造模開(kāi)始，ALX組（16.08±4.01）在第6天的血糖已經(jīng)超過(guò)了STZ組（13.85±4.27），而在36天時(shí)，STZ組（22.22±8.43）的血糖因?yàn)槌掷m(xù)升高反而高于ALX組（16.44±8.58）。

3 討論

采用藥物建立糖尿病動(dòng)物模型受多種因素影響，包括動(dòng)物種屬、性別、體重、藥物種類(lèi)、給藥次數(shù)、給藥途徑、溶媒及劑量等。本研究所選擇的藥物STZ和ALX誘導(dǎo)高血糖動(dòng)物模型的機(jī)制都是選擇性地破壞β細(xì)胞，使胰島細(xì)胞分泌功能喪失，造成胰島素缺乏，引起內(nèi)分泌功能及三大物質(zhì)代謝紊亂，從而使血糖升高。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種藥物誘導(dǎo)的小鼠沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的“三多一少”的癥狀，與相關(guān)學(xué)者的研究結(jié)果相同。但造模后6天時(shí)，體重上升并不明顯，說(shuō)明兩種藥物對(duì)于小鼠造模后短期體重存在一定的影響，ALX模型組還出現(xiàn)了微降的現(xiàn)象，ALX組體重標(biāo)準(zhǔn)差大于STZ組，ALX的誘導(dǎo)可能對(duì)于體重的影響更大。ALX組出現(xiàn)動(dòng)物死亡的情況，是由于造模后動(dòng)物一度處于低血糖期，血糖過(guò)低可致驚厥死亡[3]。而STZ組在糖尿病期出現(xiàn)的死亡，可能與個(gè)別動(dòng)物的胰島β細(xì)胞呈現(xiàn)較持續(xù)的、嚴(yán)重的損傷與破壞導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降有關(guān)。從6天血糖值可以看出，ALX較STZ在ICR小鼠體內(nèi)更為敏感，存在生物學(xué)意義。而成模率則STZ組略高于ALX，是由于ALX誘導(dǎo)產(chǎn)生的低血糖相較為嚴(yán)重，出現(xiàn)動(dòng)物死亡，如果能在造模后及時(shí)給予一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的葡萄糖就可以降低死亡率，同時(shí)有助于提高成模率。

血糖儀由于其采血便捷、方便攜帶、檢測(cè)快速等優(yōu)勢(shì)成為測(cè)定血糖的常用儀器，糖尿病的研究也多采用血糖儀。在糖耐量實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)使用血糖儀測(cè)定會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)缺失的現(xiàn)象，并且ALX和STZ誘導(dǎo)產(chǎn)生的結(jié)果存在顯著性差異，這種差異主要體現(xiàn)在血糖儀HI值（超過(guò)儀器檢測(cè)上限值）的出現(xiàn)頻率上。為了更真實(shí)的反映結(jié)果，我們采用了一種保健品進(jìn)行干預(yù)，模擬保健食品輔助降血糖功能評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)的某個(gè)劑量組給藥30天，發(fā)現(xiàn)干預(yù)組在0h就會(huì)出現(xiàn)HI值，0.5h出現(xiàn)數(shù)量達(dá)到高峰，并且ALX干預(yù)組少于STZ干預(yù)組（P＜0.05），而在模型組產(chǎn)生的差異更為明顯（P＜0.01），評(píng)價(jià)總的HI值出現(xiàn)率，ALX組同樣明顯少于STZ組（P＜0.01）。在2h時(shí)ALX模型組恢復(fù)到0h的情況，沒(méi)有出現(xiàn)HI值，而其他組別雖然數(shù)量均有下降，仍然有HI值出現(xiàn)。上述現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能與參與干預(yù)的保健品有關(guān)，此次使用的為含輔料樣品，因此在最后一次空腹給藥會(huì)使血糖值升高，隨后在給予葡萄糖時(shí)產(chǎn)生蓄積作用，使血糖值濃度太高而超過(guò)血糖儀的檢測(cè)上限?？傮w來(lái)看，STZ對(duì)葡萄糖過(guò)于敏感，ALX對(duì)于血糖蓄積升高的影響較小。繼續(xù)分析糖耐量實(shí)驗(yàn)的血糖值變化，經(jīng)假設(shè)推測(cè)可以得出ALX組在3個(gè)時(shí)點(diǎn)的血糖值都要低于STZ組的結(jié)論，這也與上面HI值出現(xiàn)的結(jié)果統(tǒng)計(jì)有相輔相成的關(guān)系，同時(shí)也對(duì)STZ模型組在0小時(shí)出現(xiàn)HI值的現(xiàn)象提供了依據(jù)。并且，根據(jù)各期血糖值，我們繪制出STZ和ALX誘導(dǎo)小鼠高血糖模型血糖值變化圖，ALX組在造模后血糖升高迅速，36天血糖值與6天基本相當(dāng)，血糖濃度仍然保持較高水平，沒(méi)有出現(xiàn)自發(fā)緩解現(xiàn)象；STZ組血糖升高比ALX組有延遲，36天血糖與6天時(shí)比較上升明顯，出現(xiàn)HI值的風(fēng)險(xiǎn)加大。兩者比較，ALX在不超過(guò)5周給藥周期的降血糖實(shí)驗(yàn)中能夠獲得相對(duì)理想的結(jié)果。

綜上所述，通過(guò)比較兩種藥物誘導(dǎo)小鼠高血糖模型在降糖實(shí)驗(yàn)中的效果，盡管ALX毒性大，對(duì)造模動(dòng)物的體重等指標(biāo)存在影響，但由于其造模速度快，動(dòng)物的高血糖濃度較穩(wěn)定且維持時(shí)間較長(zhǎng)，并且價(jià)格低廉，仍然是建立高血糖動(dòng)物模型的首選藥物。同時(shí)在采用ICR小鼠進(jìn)行保健食品降血糖功能實(shí)驗(yàn)時(shí)，受試物應(yīng)該去除輔料以避免對(duì)糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。