卡拉干斯齒線蟲的形態(tài)及ITS和COⅠ序列分析

張淑熠，吳　杰，鄭劉夢，卜艷珍

(河南師范大學生命科學學院，河南新鄉(xiāng) 453007)

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卡拉干斯齒線蟲的形態(tài)及ITS和COⅠ序列分析

張淑熠，吳杰，鄭劉夢，卜艷珍*

(河南師范大學生命科學學院，河南新鄉(xiāng) 453007)

利用光學顯微鏡和PCR擴增技術(shù)，對采自河南省馬腸道內(nèi)的卡拉干斯齒線蟲(Skrjabinodentuscaragandicus)進行形態(tài)學觀察和分子序列測定。結(jié)果表明，卡拉干斯齒線蟲中等大小，口囊壁呈“S”狀，前端極度膨大，厚度10 μm～12 μm，后端稍薄，約4 μm～6 μm，外葉冠由8個長而寬的小葉組成，內(nèi)葉冠由16個～18個短而寬的小葉組成，食道漏斗發(fā)達；雄蟲生殖錐長337 μm，引器長245 μm；所測核糖體DNA(rDNA)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)及5.8S片段長度為853 bp，其中ITS1長369 bp，ITS2長331 bp，ITS1區(qū)的GC含量(47.2%)明顯高于ITS2區(qū)(40.7%)；線粒體細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)基因長度為393 bp，A、T、G、C堿基含量分別為25.2%、42.7%、21.4%、10.7%?？ɡ伤过X線蟲在河南省屬首次報道，為河南省新記錄種。

馬；卡拉干斯齒線蟲；形態(tài)特征；rDNA-ITS；COⅠ基因

卡拉干斯齒線蟲(Skrjabinodentuscaragandicus)隸屬于圓線目(Strongylida)圓線科(Strongylidae)斯齒屬(Skrjabinodentus)，主要寄生于馬屬動物(馬、驢、騾等)消化道內(nèi)，是一種罕見的寄生線蟲[1-3]。Funikova S V首次在馬腸道內(nèi)發(fā)現(xiàn)該線蟲，命名為卡拉干毛線蟲(Trichonemacaragandicus)，并做了詳細描述[4]。1957年，Tshoijo U[5]根據(jù)卡拉干毛線蟲交合傘背肋的形狀，為其建立了斯齒屬。隨后，孔繁瑤[6]采納了Tshoijo U的觀點，將卡拉干毛線蟲更名為卡拉干斯齒線蟲。Lichtenfels J R[7]認為，Tshoijo U所建立的斯齒屬是依據(jù)一些極其特別的鑒別特征，故不予考慮，將卡拉干斯齒線蟲作為待考種論。而德國學者Hartwich G[8]將卡拉干斯齒線蟲作為待考種放入杯冠屬(Cylicostephanus)，把斯齒屬作為杯冠屬的同屬異名。但是，Dvojonos G M和Kharchenko V A[9]卻承認斯齒屬為一個有效的屬，這個觀點得到許多分類學者的贊同[3,10]。

卡拉干斯齒線蟲曾記載于亞洲和前蘇聯(lián)[2]，一些學者也給出了詳細的形態(tài)描述[3-4]。雖然在我國的蒙古、新疆和陜西等地也有該線蟲的記錄[11]，但未見相關(guān)的描述和繪圖。而且，迄今國內(nèi)外仍然缺乏關(guān)于卡拉干斯齒線蟲分子學方面的報道。本研究首次在河南省發(fā)現(xiàn)卡拉干斯齒線蟲，并對其進行形態(tài)特征描述以及分子序列的測定與分析，以期為今后的相關(guān)研究提供基礎(chǔ)資料。

1　材料與方法

1.1材料

從河南省驢的腸道內(nèi)得到2條雄性卡拉干斯齒線蟲，固定保存于700 mL/L酒精中。經(jīng)固定的標本先用乳酸苯酚溶液(2份甘油、1份苯酚飽和溶液、1份乳酸、1份水)透明，然后在光學顯微鏡下進行形態(tài)觀察、測量和顯微拍照。標本保存于河南師范大學生命科學學院。

1.2方法

1.2.1蟲體總DNA的提取 從固定液中取出單個蟲體，先用去離子水反復沖洗2 h～3 h，然后將頭尾切掉重新放回原液中，以便與分子鑒定結(jié)果核對。剩余部分置于一新的1.5 mL Eppendorf管中，用滅菌的剪刀將蟲體剪碎，然后加入含蛋白酶K的消化液，放于37℃恒溫水浴鍋內(nèi)消化過夜。消化好的蟲體懸液采用UNIQ-10柱式基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司生產(chǎn))提取基因組DNA，于-20℃保存。

1.2.2PCR擴增和純化用于擴增核糖體DNA (rDNA)內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)的一對保守引物為：NC5(正向)5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′,NC2(反向)5′-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3′。用于擴增線粒體細胞色素C氧化酶Ⅰ(COⅠ)基因的一對保守引物為：JB3(正向)5′-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3′和JB4.5(反向)5′-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3′。引物由蘇州金維智生物科技有限公司合成。

ITS的擴增體系為30 μL，2×TaqMaster Mix 15 μL，ddH2O 10.5 μL，正向引物NC5(1 pmol/μL)1 μL，反向引物NC2(1 pmol/μL)1 μL，模版DNA 2.5 μL。PCR反應條件為：94℃ 5 min;94℃ 45 s，56℃ 1 min，72℃ 1.5 min，35個循環(huán);最后72℃ 7 min。

COⅠ的擴增體系為30 μL，包括2×TaqMaster Mix 15 μL，ddH2O 7.5 μL，正向引物JB3(1 pmol/μL)1.5 μL，反向引物JB4.5(1 pmol/μL)1.5 μL，模板DNA 4.5 μL。PCR反應條件為：94℃ 5 min;94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，35個循環(huán);最后72℃ 10 min。

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，于紫外透射儀中觀察，并于凝膠成像系統(tǒng)中拍照。然后在紫外燈下將含有目的DNA片段的凝膠切下來，用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒純化回收。

1.2.3序列測定和分析純化后的PCR產(chǎn)物送往上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司進行測序。測序結(jié)果用DNA Star 7.1軟件進行拼接，所得序列采用Clustal X1.83和MEGA5軟件比對分析。序列提交至GenBank，獲得序列注冊號，并用Blast軟件進行同源性檢測。

2　結(jié)果

2.1蟲體形態(tài)特征

蟲體中等大小。口領(lǐng)顯著，口領(lǐng)的后緣位于口囊前緣之前。口領(lǐng)的兩側(cè)各有1個頭感器，頭感器小，稍微隆起。2個頭感器之間對稱排列著4個較發(fā)達的亞中乳突，乳突呈子彈形，突出于口領(lǐng)之上。口孔周圍具2圈葉冠，外葉冠由8個長而寬的小葉組成，內(nèi)葉冠小葉較短，約16片～18片?？谀医茍A柱形，寬度大于深度，口囊壁呈“S”狀，前端極度膨大，后端較薄。背溝發(fā)達，約為口囊深的1/3～2/3。食道漏斗發(fā)達，具有1個大的背食道齒和2個亞腹食道齒。食道短而粗壯，呈花瓶狀。神經(jīng)環(huán)位于食道約1/2處，排泄孔位于神經(jīng)環(huán)后端(圖1A～圖1C)。

A.蟲體前部腹面觀；B，C.蟲體前部側(cè)面觀；D.雄蟲尾部腹側(cè)面觀；E，F(xiàn). 雄蟲尾部側(cè)面觀(圖中比例尺：A，B，D～F=200 μm；C=100 μm )

A.Anterior end,ventral view;B，C.Anterior end,lateral view;D.Posterior end of male,ventral-lateral view;E，F(xiàn).Posterior end of male,lateral view(Scale-bars:A，B, D-F=200 μm;C=100 μm )

圖1卡拉干斯齒線蟲光鏡圖

Fig.1Light microscopic graphs ofSkrjabinodentuscaragandicus

雄蟲(n=2)：體長9.85 mm～9.90 mm，最大體寬543 μm?？陬I(lǐng)高10 μm～13 μm，口領(lǐng)和體部交界處寬60 μm。口囊壁前端厚10 μm～12 μm，后端較薄，約4 μm～6 μm；口囊內(nèi)徑前端寬 34 μm～39 μm，后端寬44 μm～52 μm；深18 μm～26 μm。食道長337 μm～358 μm，前端部寬85 μm～98 μm，后端膨大部寬 108 μm～122 μm。神經(jīng)環(huán)距頭端185 μm～188 μm；頸乳突距頭端247 μm～256 μm。雄蟲尾部交合傘短闊，背葉稍長于側(cè)葉，背葉和側(cè)葉分界不明顯。交合傘自外背肋基部至背肋末端的長度為454 μm～469 μm。交合刺1對，等長，末端有鉤，長1.06 mm～1.08 mm。引器粗壯，柄部退化，遠端具翼，長245 μm。生殖錐發(fā)達，呈圓錐形，長337 μm，延伸超過交合傘側(cè)葉(圖1D～圖1F)。

2.2ITS序列分析

將所測的1條ITS序列(包含5.8 S)提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號為KT984870。ITS序列總長853 bp，其中ITS1長369 bp，5.8 S長153 bp，ITS2長331 bp； ITS1區(qū)的GC含量(47.2%)明顯高于ITS2區(qū)(40.7%)(圖2)。在GenBank檢索中，尚未發(fā)現(xiàn)卡拉干斯齒線蟲或斯齒屬內(nèi)其他蟲種的序列。經(jīng)過Blast同源比對，與伊氏雙齒口線蟲(Bidentostomumivashkini)(登錄號：KP693440)的同源性最高，達到94%；而與杯冠屬內(nèi)小杯杯冠線蟲(C.calicatus)(登錄號：KM085356)、微小杯冠線蟲(C.minutus)(登錄號：KM085360)、長傘杯冠線蟲(C.longiburs)(登錄號：KM085358)和高氏杯冠線蟲(C.goldi)(登錄號：KM085357)的同源性較低，為74.45%～85.20%。

2.3COⅠ序列分析

本研究共測出1條COⅠ序列，提交至GenBank數(shù)據(jù)庫獲得登錄號為KP693430。COⅠ序列長393 bp，A、T、G、C堿基含量分別為25.2%、42.7%、21.4%、10.7%。(圖3)。在GenBank上經(jīng)過Blast搜索，也未收錄卡拉干斯齒線蟲或斯齒屬內(nèi)其他蟲種的COⅠ序列。與所測序列同源性最高的是綿羊夏柏特線蟲(Chabertiaovina)(登錄號：KF279334)，同源性為90%；而與杯冠屬內(nèi)小杯杯冠線蟲(C.calicatus)(登錄號：KM085347)、微小杯冠線蟲(C.minutus)(登錄號：KM085353)、長傘杯冠線蟲(C.longiburs)(登錄號：KM085351)和高氏杯冠線蟲(C.goldi)(登錄號：KM085349)的同源性僅有85.75%～88.04%。

圖2　卡拉干斯齒線蟲的ITS序列

圖3　卡拉干斯齒線蟲的COⅠ序列

3　討論

1957年，Tshoijoji U[5]建立了斯齒屬。1997年8月11日，在南非太陽城舉辦的馬屬動物寄生線蟲國際研討會上，斯齒屬的有效性得到了承認[3]。斯齒屬的主要鑒別特征如下：①雄蟲交合傘背肋分為兩個主支，每個主支僅分出一個側(cè)支；②生殖錐特別長，延伸超出交合傘；③引器柄部退化，遠端具翼。目前，該屬共包括3種線蟲：卡拉干斯齒線蟲、陶氏斯齒線蟲(S.tshoijoi)和長錐斯齒線蟲(S.longiconus)。雖然前2種線蟲在我國均有記載，但是卻缺乏卡拉干斯齒線蟲的形態(tài)描述。本研究首次在河南省發(fā)現(xiàn)該線蟲并給出了詳細描述和圖片。本次所采標本的形態(tài)特征與Funikova S V[4]和Lichtenfels J R等[3]的報道基本一致，只是食道較長而粗壯，其他未發(fā)現(xiàn)明顯差異。

隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，基于基因組DNA和線粒體DNA(mtDNA)的各種分子標記開始應用于線蟲的分類研究中[12-17]。本文首次對卡拉干斯齒線蟲的rDNA-ITS和COⅠ序列進行了測定和分析。在卡拉干斯齒線蟲的分類史上，Hartwich G[8]曾將該線蟲作為待考種放入杯冠屬，把斯齒屬作為杯冠屬的同屬異名。但是，將所測的ITS和COⅠ序列在GenBank中經(jīng)過Blast搜索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該線蟲分別與伊氏雙齒口線蟲(94%)和綿羊夏柏特線蟲(90%)的同源性較高，而與杯冠屬內(nèi)蟲種的同源性卻比較低，同源性分別為74.45%～85.20%和85.75%～88.04%。由此可知，將卡拉干斯齒線蟲歸入杯冠屬是不合理的，也進一步證實了斯齒屬的有效性。本研究填補了國內(nèi)卡拉干斯齒線蟲形態(tài)描述的缺失，并且首次提供了ITS和COⅠ序列數(shù)據(jù)，為今后該線蟲的進一步研究奠定了基礎(chǔ)。

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Morphological Descriptionand Sequence Analysis of ITS and COⅠ ofSkrjabinodentuscaragandicus

ZHANG Shu-yi,WU Jie,ZHENG Liu-meng,BU Yan-zhen

(CollegeofLifeScience,HenanNormalUniversity,Xinxiang,Henan,453007,China)

Skrjabinodentuscaragandicus, obtained from the large intestines of horses in Henan province, was observed using light microscopy.ITS and COⅠ sequences ofS.caragandicuswere amplified and sequenced using PCR techniques.The results showed thatS.caragandicusis medium-sized, walls of buccal capsule is S-shaped,much thicker anteriorly,the thickness of the front end is 10 μm-12 μm and the thickness of the posterior part is 4 μm-6 μm.The external leaf crown consists of 8 long and broad elements,and the internal leaf crown consists of 16-18 short and broad elements.S.caragandicuswith a well-developed esophagus funnel,the genital cone length of male is 337 μm,and the gubernaculums length is 245 μm;total length of rDNA-ITS is 853 bp, including 369 bp in ITS1,153 bp in 5.8 S and 331 bp in ITS2,and the content of G+C of ITS1 (47.2%) is significantly higher than that of the ITS2 (40.7%);the length of COⅠ is 393 bp,and A,T,G and C contents are 25.2%,42.7%,21.4%,10.7%,respectively.In the present study,S.caragandicuswas reported for the first time in Henan province.

horse;Skrjabinodentuscaragandicus; morphological characteristics; rDNA-ITS; COⅠ

2016-02-27

國家自然科學基金項目(31372163)；河南省重點科技攻關(guān)項目(112102110032，142102310121)

張淑熠(1991-)，女，河南登封人，碩士研究生，主要從事動物寄生線蟲研究。*通訊作者

S852.731

A

1007-5038(2016)10-0053-04