水稻Kasalath改良品系基因轉(zhuǎn)化效率的初步研究

何行健　曾崇華　劉清波　陳芬　胡文彬　王作平　肖國(guó)櫻

摘要 以親本Kasalath和HD9802S為對(duì)照，Bar基因?yàn)楹Y選標(biāo)記，初步評(píng)價(jià)了Kasalath改良品系9K08-3、9K18-7、9K21-3、9K28-5、9K29-9和9K30-0的基因轉(zhuǎn)化效率。試驗(yàn)共獲得15個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件，9K08-3、9K18-7、9K21-3、9K28-5、9K29-9和9K30-0的基因轉(zhuǎn)化效率分別為0、0.65%、0、0.23%、0.40%和0.22%；初步結(jié)果表明改良品系9K18-7具有較高的基因轉(zhuǎn)化效率。

關(guān)鍵詞 秈稻；基因轉(zhuǎn)化效率；抗除草劑

中圖分類號(hào) S511 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2016）05-0010-03

Abstract The transformation efficiencies of several improved lines from Kasalath（including 9K08-3，9K18-7，9K21-3，9K28-5，9K29-9，and 9K30-0）were preliminary evaluated by using parent Kasalath and HD9802S as check and herbicide resistant gene Bar as selective marker.Fifteen independent transformants were obtained in this study，and the transformation efficiencies of line 9K08-3，9K18-7，9K21-3，9K28-5，9K29-9，and 9K30-0 were 0，0.65%，0，0.23%，0.40% and 0.22%，respectively.It primary indicated that line 9K18-7 had higher transformation efficiency comparatively.

Key words Indica rice；transformation efficiency；herbicide resistance

水稻（Oryza sativa L.）是最重要的糧食作物之一，全世界近50%的人口以稻米為主食，90%的水稻產(chǎn)于亞洲。亞洲栽培稻一般分為秈稻和粳稻2個(gè)亞種，其中秈稻約占全球水稻產(chǎn)量的80%[1]。水稻在組織培養(yǎng)力和基因轉(zhuǎn)化效率方面對(duì)基因型依賴性強(qiáng)，不同基因型水稻的組織織培養(yǎng)力和遺傳轉(zhuǎn)化效率存在顯著差異。由于大多數(shù)秈稻不良的組織培養(yǎng)特性和極低的轉(zhuǎn)化效率，嚴(yán)重限制了轉(zhuǎn)基因技術(shù)在秈稻育種上的應(yīng)用[2]。研究發(fā)現(xiàn)Kasalath是秈稻中易于組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化的品種[3-4]，但是Kasalath農(nóng)藝性狀較差，主要表現(xiàn)為高稈、有芒、株型松散、產(chǎn)量較低、生育期長(zhǎng)等，嚴(yán)重制約了它在轉(zhuǎn)基因育種研究上的廣泛應(yīng)用。水稻轉(zhuǎn)基因育種研究中亟需轉(zhuǎn)化效率高、農(nóng)藝性狀好的秈稻品系。

早秈型溫敏核不育系HD9802S熟期早、農(nóng)藝性狀優(yōu)良[5]。本課題組從HD9802S/Kasalath后代中選出了組織培養(yǎng)力高、矮稈、生育期短、產(chǎn)量性狀較好的Kasalath改良品系[6]，但高培養(yǎng)力品系的基因轉(zhuǎn)化效率尚未檢測(cè)。本文報(bào)道了以農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法評(píng)價(jià)Kasalath改良品系基因轉(zhuǎn)化效率的初步結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 水稻材料

Kasalath改良品系9K08-3、9K18-7、9K21-3、9K28-5、9K29-9和9K30-0由本課題組培育[6]；秈稻品種HD9802S由湖北大學(xué)提供；Kasalath由本所提供、本課題組繁殖。

1.2 組織培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)化

組織培養(yǎng)方法參考文獻(xiàn)[6]，基因轉(zhuǎn)化方法參考文獻(xiàn)[7]。根瘤農(nóng)桿菌菌株EHA105由本課題組購(gòu)買、保存；質(zhì)粒pCAMBIA3300由澳大利亞國(guó)際農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)應(yīng)用中心惠贈(zèng)，本課題組擴(kuò)增、保存。植物組織培養(yǎng)力（%）=愈傷組織誘導(dǎo)率×綠苗分化率×100；基因轉(zhuǎn)化效率（%）=轉(zhuǎn)化事件數(shù)/試驗(yàn)種子數(shù)×100。

1.3 轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)

PCR和Southern檢測(cè)方法參考文獻(xiàn)[8-9]。轉(zhuǎn)基因植株的除草劑抗性檢測(cè)：從T1代植株中選取健康葉片以1 g/L的草銨膦溶液涂抹葉上部標(biāo)記部位，以受體材料為對(duì)照，7 d后觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用Excel 2013和SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)化事件的鑒定

2.1.1 PCR鑒定。轉(zhuǎn)化后獲得的再生植株經(jīng)煉苗移栽共成活18株，其中9株來(lái)源于Kasalath、2株來(lái)源于9K18-7、2株來(lái)源于9K28-5、3株來(lái)源于9K29-9、2株來(lái)源于9K30-0。對(duì)18株再生苗進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果表明，除了9K28-5和9K30-0中各有1株沒有檢測(cè)到Bar基因外，其余16株再生苗均能檢測(cè)到目的基因（圖1）。

2.1.2 Southern鑒定。再生植株基因組DNA經(jīng)酶切后電泳、轉(zhuǎn)膜，以Bar基因片斷為探針進(jìn)行雜交，除PCR鑒定為假陽(yáng)性的2株外，其余16株均得到了雜交信號(hào)（圖2）。其中來(lái)源于Kasalath的有5株為單拷貝（圖2中泳道1、2、6、8和16）、4株為多拷貝（圖2中泳道3、4、5和7）；來(lái)源于9K18-7的有1株為單拷貝（圖2中泳道9）、1株為多拷貝（圖2中泳道10）；來(lái)源于9K28-5的1株為多拷貝（圖2中泳道11），1株無(wú)雜交信號(hào)（圖2中泳道17）；來(lái)源于9K29-9的有1株為單拷貝（圖2中泳道13）、2株為多拷貝且為同一轉(zhuǎn)化事件（圖2中泳道12、14）；來(lái)源于9K30-0的1株為單拷貝（圖2中泳道15），1株無(wú)雜交信號(hào)（圖2中泳道18）。結(jié)果表明本試驗(yàn)共獲得15個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件。

2.1.3 草銨膦抗性鑒定。除草劑草銨膦涂抹葉片試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，非轉(zhuǎn)基因植株葉片明顯變黃（CK），假陽(yáng)性的再生植株表現(xiàn)與對(duì)照相似（11和12號(hào)），其余再生植株葉片傷害較弱或無(wú)明顯傷害（圖3）。結(jié)果表明分子檢測(cè)為陽(yáng)性的再生植株對(duì)草銨膦有明顯的抗性。

2.2 基因轉(zhuǎn)化效率的評(píng)價(jià)

研究結(jié)果表明（表1）：親本Kasalath和HD9802S的組織培養(yǎng)力分別為28.17%和24.36%；改良品系9K18-7和9K28-5的組織培養(yǎng)力分別為38.96%和46.80%，高于2個(gè)親本；9K30-0和9K21-3分別為24.79%和25.24%，介于2個(gè)親本之間；9K08-3和9K29-9分別為4.10%和22.97%，低于2個(gè)親本。Kasalath和HD9802S的基因轉(zhuǎn)化效率分別為4.21%和0；改良品系9K08-3、9K18-7、9K21-3、9K28-5、9K29-9和9K30-0的基因轉(zhuǎn)化效率分別為0、0.65%、0、0.23%、0.40%和0.22%。改良品系9K18-7具有較高的基因轉(zhuǎn)化效率，達(dá)到0.65%，基因轉(zhuǎn)化效率介于高值親本Kasalath和低值親本HD9802S之間。

進(jìn)一步分析了Kasalath改良品系中基因轉(zhuǎn)化效率與組織培養(yǎng)特性之間的相關(guān)性。結(jié)果表明（表2）：基因轉(zhuǎn)化效率與愈傷組織誘導(dǎo)率、綠苗分化率和成熟胚培養(yǎng)力之間的Pearson相關(guān)系數(shù)分別為0.692、0.375和0.547，相關(guān)性均不顯著；成熟胚培養(yǎng)力與愈傷組織誘導(dǎo)率和綠苗分化率之間的Pearson相關(guān)系數(shù)分別為0.871和0.966，相關(guān)性分別達(dá)到顯著和極顯著水平；綠苗分化率和愈傷組織誘導(dǎo)率之間的Pearson相關(guān)系數(shù)為0.754，相關(guān)性不顯著。

3 結(jié)論與討論

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是一種快速、定向改良水稻的有效手段。自從1994年Hiei等[10]建立粳稻的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法高效轉(zhuǎn)化體系以來(lái)，粳稻的遺傳轉(zhuǎn)化工作迅速展開，取得了很多進(jìn)展[11-16]。由于基因型不同，秈稻的基因轉(zhuǎn)化效率不高，研究進(jìn)展較慢[17]，且主要集中于轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化上。Rashid等[18]通過(guò)調(diào)整乙酰丁香酮用量、愈傷組織類型和共培養(yǎng)時(shí)間等因素，改變激素配比，建立了一種高效轉(zhuǎn)化中秈型水稻品種印度香米385的體系；Hiei等[19]研究了不同凝膠劑和共培養(yǎng)基對(duì)秈稻轉(zhuǎn)化效率的影響；葉松青等[20]主要針對(duì)秈稻轉(zhuǎn)化過(guò)程中涉及的愈傷組織的誘導(dǎo)、篩選、分化等進(jìn)行了研究，還研究了脯氨酸、二甲基亞砜對(duì)分化的影響。但是，秈稻轉(zhuǎn)基因受體品種的改良方面研究較少。馬炳田[21]從優(yōu)良三系雜交稻恢復(fù)系（SH527和SH163）、保持系（D62B、D297B和D702B）、兩系恢復(fù)系W2008、兩系不育系612S等材料中篩選，并建立了一套轉(zhuǎn)基因中間受體系統(tǒng)。秈稻轉(zhuǎn)基因優(yōu)良受體品種的缺乏，在一定程度上制約了秈稻轉(zhuǎn)基因研究的發(fā)展。

本課題組從受體品種改良方面入手，利用培養(yǎng)力較好且易于轉(zhuǎn)化的秈稻品種Kasalath與農(nóng)藝性狀較好、培養(yǎng)力高的不育系HD9802S雜交，結(jié)合分子標(biāo)記方法，得到了291個(gè)優(yōu)良品系，并篩選出培養(yǎng)力極顯著高于親本HD9802S和Kasalath的家系9K18和9K19，為水稻轉(zhuǎn)基因育種研究提供了較好的高培養(yǎng)力受體材料[6]。

水稻的組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化是一個(gè)極為復(fù)雜的過(guò)程，在此過(guò)程中，組織培養(yǎng)特性被認(rèn)為與轉(zhuǎn)化效率密切相關(guān)。李素娟等[22]通過(guò)16個(gè)秈稻品種和5個(gè)粳稻品種的遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，認(rèn)為較好的組織培養(yǎng)力是獲得轉(zhuǎn)基因植株的前提。樊秀霞[23]通過(guò)對(duì)21個(gè)水稻品種的成熟胚組織培養(yǎng)特性以及轉(zhuǎn)基因效率的考察，發(fā)現(xiàn)這些水稻品種間組織培養(yǎng)特性和轉(zhuǎn)基因效率均存在顯著差異，認(rèn)為水稻品種間組織培養(yǎng)特性和轉(zhuǎn)基因效率有關(guān)。Zhao等[2]認(rèn)為一個(gè)水稻品種的遺傳轉(zhuǎn)化效率在很大程度上取決于它的組織培養(yǎng)力。但他們均沒有對(duì)組織培養(yǎng)力和轉(zhuǎn)化效率之間的關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)研究，這可能與秈稻遺傳轉(zhuǎn)化的低成功率和難重復(fù)性有關(guān)。

本試驗(yàn)對(duì)6個(gè)Kasalath改良品系進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了6個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化體，相關(guān)分析表明Kasalath改良品系的基因轉(zhuǎn)化效率和組織培養(yǎng)特性之間的相關(guān)性并不顯著。Kasalath和HD9802S的組織培養(yǎng)力并沒有顯著差異[6]，但本研究中HD9802S的轉(zhuǎn)化效率為0，Kasalath的基因轉(zhuǎn)化效率4.21%。雖然劉風(fēng)珍等[24]在花生的遺傳轉(zhuǎn)化研究上也獲得了類似結(jié)果，但由于本試驗(yàn)獲得的轉(zhuǎn)化事件數(shù)少，還不具有普遍意義。因此，在后續(xù)篩選試驗(yàn)中，一方面要加大試驗(yàn)工作量，探索基因轉(zhuǎn)化效率和組織培養(yǎng)特性之間的內(nèi)在關(guān)系，另一方面也要以基因轉(zhuǎn)化效率為最終衡量標(biāo)準(zhǔn)，篩選組織培養(yǎng)力和基因轉(zhuǎn)化效率都高的改良品系，為秈稻的轉(zhuǎn)基因育種研究提供理想的受體材料。

4 參考文獻(xiàn)

[1] J L MACLEAN.水稻知識(shí)大全[M].楊仁崔，湯圣祥，譯.福州：福建科學(xué)技術(shù)出版社，2003.

[2] ZHAO L，ZHOU H，LU L，et al.Identification of quantitative trait loci controlling rice mature seed culturability using chromosomal segment substitution lines [J].Plant Cell Reports，2009，28（2）：247-256.

[3] YUKOH H，TOSHIHIKO K.Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed[J].Nature Protocols，2008，3（3）：824-834.

[4] SAIKA H，TOKI S.Mature seed-derived callus of the model indica rice variety Kasalath is highly competent in Agrobacterium-mediated transfo-rmation[J].Plant Cell Reports，2010，29（12）：1351-1364.

[5] 周勇，居超明，徐國(guó)成，等.優(yōu)質(zhì)早秈型水稻溫敏核不育系HD9802S的選育與應(yīng)用[J].雜交水稻，2008（2）：7-10.

[6] 曾崇華.HD9802S/Kasalath選系中高培養(yǎng)力和抗稻瘟病株系的篩選[D].長(zhǎng)沙：中國(guó)科學(xué)院，2015.

[7] SEIICHI T，NAHO H，KAZUKO O，et al.Early infection of scutellum tissue with Agrobacterium allows high-speed transformation of rice[J].The Plant Journal，2006，47（6）：969-976.

[8] 鄧力華，鄧曉湘，魏歲軍，等.抗蟲抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻B1C893的獲得與鑒定[J].雜交水稻，2014，29（1）：67-71.

[9] 肖國(guó)櫻，唐俐，袁定陽(yáng)，等.轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑兩系雜交早稻恢復(fù)系Bar 68-1的培育研究[J].雜交水稻，2007，22（6）：57-61.

[10] HIEI Y，OHTA S，KOMARI T，et al.Efficient transformation of rice（Oryza sativa L.）mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA [J].The Plant Journal，1994，6（2）：271-282.

[11] 鐵韋韋.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的秈粳稻轉(zhuǎn)化差異[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[12] 楊友才，周清明.轉(zhuǎn)基因水稻研究進(jìn)展[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2003，29（1）：85-88.

[13] 朱禎.轉(zhuǎn)基因水稻研發(fā)進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2010，8（2）：9-16.

[14] 陳文岳.轉(zhuǎn)Bt基因水稻“克螟稻”的遺傳改良研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2005.

[15] 沈圣泉，吳殿星，崔海瑞，等.Bt轉(zhuǎn)基因抗蟲粳稻品種選育中若干問(wèn)題研究[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2003，29（5）：31-35.

[16] 王利潤(rùn).抗螟蟲粳稻新材料的創(chuàng)建和抗螟蟲兩系雜交粳稻新組合的選育[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[17] KARABI D，KUMAR D S.Indica rice（Oryza sativa，BR29 and IR64）[J].Methods in Molecular Biology，2006，343（343）：201-212.

[18] RASHID H，YOKOI S，TORIYAMA K，HINATA K.Transgenic plant pro-duction mediated by Agrobacterium in Indica rice[J].Plant Cell Reports，1996，15（10）：727-730.

[19] HIEI Y，KOMARI T.Improved protocols for transformation of indica rice mediated by Agrobacterium tumefaciens[J].Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2006，85（3）：271-283.

[20] 葉松青，儲(chǔ)成才，曹守云，等.提高水稻轉(zhuǎn)化效率幾個(gè)主要因素的研究[J].遺傳學(xué)報(bào)，2001，28（10）：933-938.

[21] 馬炳田.基因工程改良雜交秈稻的抗蟲性[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002.

[22] 李素娟，樊秀霞，王華，等.水稻不同品種組培再生和轉(zhuǎn)基因頻率研究[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2013，27（12）：1817-1827.

[23] 樊秀霞.水稻不同品種組培再生和轉(zhuǎn)基因頻率研究[D].杭州：杭州師范大學(xué)，2013.

[24] 劉風(fēng)珍，萬(wàn)勇善，潘昱名.花生遺傳轉(zhuǎn)化高效基因型的篩選與研究[J].花生學(xué)報(bào)，2009，38（4）：21-25.