植物組織培養(yǎng)中褐變的影響因素及防止措施

周亞輝

摘要 褐變問題在植物組織培養(yǎng)過程中普遍存在，嚴重影響了外植體的生長與分化，結(jié)合國內(nèi)外研究褐變的相關(guān)報道，綜述了植物組織培養(yǎng)中褐變的影響因素和防止措施。

關(guān)鍵詞 植物組織培養(yǎng)；褐變；影響因素；防止措施

中圖分類號 Q813.1+2 文獻標識碼 B 文章編號 1007-5739（2016）05-0117-02

近年來，隨著科學技術(shù)的迅猛發(fā)展，植物組織培養(yǎng)已成為生物學科中的重要研究技術(shù)和手段之一，其被廣泛應用于科研和生產(chǎn)，在農(nóng)學、花卉、林業(yè)、醫(yī)藥業(yè)等領(lǐng)域中取得了巨大的經(jīng)濟、社會效益。但是，植物組織培養(yǎng)過程中褐變問題普遍存在，褐變的發(fā)生會嚴重影響外植體的生長與分化，甚至導致培養(yǎng)材料的死亡，褐變問題已成為組織培養(yǎng)中的一大難題。褐變的影響因素是復雜的，隨外植體種類、基因型、取材部位及生理狀況等的不同而危害程度有所區(qū)別，國內(nèi)外也研究報道了一些減少或防止褐變的方法。本文系統(tǒng)歸納了植物組織培養(yǎng)褐變的影響因素和防止措施，對深入研究褐變問題和組織培養(yǎng)技術(shù)都有著非常重要的意義。

1 褐變的影響因素

1.1 外植體基因型

在植物組織培養(yǎng)中，有些品系容易褐變，誘導困難，而有些品系褐變較少，愈傷組織化容易些，組培容易成功，其原因之一可能是酚類物質(zhì)含量及多酚氧化酶活性上的差異。

1.2 外植體的生理狀態(tài)

外植體本身的生理狀態(tài)不同，接種后褐變的程度也不同。致褐物質(zhì)的含量會因生理年齡、季節(jié)、取材時間及部位的不同而不同。

1.3 培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件

無機鹽濃度、培養(yǎng)基pH值、培養(yǎng)基狀態(tài)及植物激素等不適宜，均會引起褐變的產(chǎn)生。此外，培養(yǎng)過程中溫度過高或光照過強，也會加速褐變的產(chǎn)生。

1.4 培養(yǎng)時間

接種后轉(zhuǎn)瓶時間的早晚也是影響褐變的因素，接種后外植體培養(yǎng)時間過長，未及時轉(zhuǎn)瓶，會使培養(yǎng)材料傷口積累過多酚類物質(zhì)，導致褐變。

2 褐變的防止措施

2.1 外植體的選擇

2.1.1 基因型。在相同培養(yǎng)條件下，甜菜二倍體品系外植體發(fā)生褐變的頻率低于四倍體品系。Dalal等[1]比較2個葡萄品種“Pusa Seedless”和“Beauty Seedless”的褐變時，發(fā)現(xiàn)后者比前者嚴重，酚類化合物含量也是后者明顯高。因此，在組織培養(yǎng)中應注意不同基因型的篩選，選擇褐變程度較小的材料來進行培養(yǎng)。

2.1.2 生理年齡。外植體年齡對褐變有較大影響，Chevre分析表明歐洲栗幼齡材料酚類化合物含量少，而成齡材料比較多。周 艷等[2]研究發(fā)現(xiàn)馬纓杜鵑的二年生莖段在組織培養(yǎng)過程中的褐變率最低。

2.1.3 取材時期。致褐物質(zhì)的含量會因季節(jié)的不同而不同，冬季褐變少，夏秋季褐變最嚴重，存活率最低。對柿樹離體繁殖中外植體的褐變研究結(jié)果表明，2月取即將萌動的休眠芽進行培養(yǎng)，褐變死亡率低，4月取嫩枝莖尖進行培養(yǎng)，褐變死亡率高[3]。紫葉黃櫨在1月取休眠枝條組織培養(yǎng)后外植體褐變程度最輕。

2.1.4 取材部位。平陰玫瑰不同品種、同一品種不同芽位的外植體在組培中褐變發(fā)生情況不同，但5個品種各芽位的平均褐變度均呈單峰型變化，且峰值均在第4芽。張素勤等[4]研究報道，非洲菊幼嫩葉片、花蕾、花托和花梗不同外植體中葉片的褐變程度最重，花蕾的褐變程度最輕。

2.2 外植體的預處理

在非洲菊葉片組織培養(yǎng)接種前將外植體用100 mg/L VC溶液浸泡1 h，使褐變現(xiàn)象得到有效控制[4]。青錢柳外植體先于4 ℃低溫預處理5 d和直接用燒紅的手術(shù)刀快速切割外植體后再進行接種可有效減少外植體的褐變。紫葉黃櫨嫩莖組織培養(yǎng)前經(jīng)0.1% HgCl2滅菌2～3 min，外植體褐變程度最輕。

2.3 適當?shù)呐囵B(yǎng)基狀態(tài)和成分

2.3.1 培養(yǎng)基狀態(tài)。液體培養(yǎng)基可有效克服外植體褐變，因為在液體培養(yǎng)基中，外植體溢出的有害物質(zhì)可以很快擴散，對外植體傷害較輕。潘 梅等[5]在淮山組織培養(yǎng)抑制褐變的研究中發(fā)現(xiàn)液體培養(yǎng)淮山組織褐變程度較固體培養(yǎng)輕。尚旭嵐等[6]研究報道，鶴望蘭紙橋液體培養(yǎng)可以有效降低外植體的褐變度。

2.3.2 培養(yǎng)基成分。選擇適宜的無機鹽成分、蔗糖濃度和激素水平也是十分重要的。牛尾菜組織在不同激素配比的培養(yǎng)基中，隨著6-BA和NAA濃度的提高，外植體發(fā)生褐化時間呈現(xiàn)提前的趨勢。此外，相對于基本培養(yǎng)基MS、1/2MS，在低無機鹽離子濃度WPM基本培養(yǎng)基中，可減緩外植體褐化程度。銀杏組織培養(yǎng)在蔗糖濃度為5%的培養(yǎng)基上，愈傷組織增長倍數(shù)最高。

2.3.3 添加抗氧化劑和吸附劑。在植物組培中常用于抑制褐變的抗氧化劑有抗壞血酸、硫代硫酸鈉、多胺等，常用的吸附劑有聚乙烯吡咯烷酮、活性炭等。鄭曉丹等[7]發(fā)現(xiàn)海南龍血樹組織培養(yǎng)抗褐變的最適處理是培養(yǎng)基里加入維生素C然后泡半胱氨酸。魔芋組織培養(yǎng)中在培養(yǎng)基中分別添加活性炭、半胱氨酸、二氧化硫、聚乙烯吡咯烷酮或抗壞血酸等都能有效降低魔芋組織培養(yǎng)中的褐變率[8]。

2.4 合適的培養(yǎng)條件

溫度過高或光照過強，可使多酚氧化酶的活性提高，從而加速培養(yǎng)材料的褐變，尤其是初期暗培養(yǎng)及保持較低溫度（15～20 ℃）有降低褐變的作用[9]?？ㄌ靥m在10～20 ℃時褐變程度要比20 ℃以上時輕。魔芋組織培養(yǎng)中溫度25～30 ℃、光照1 500 lx的條件下培養(yǎng)物褐變率僅為6%，愈傷組織誘導率達94%，成功率最高。

2.5 縮短轉(zhuǎn)瓶時間

及時轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物可減輕醌類物質(zhì)對培養(yǎng)物的毒害作用，顯著減少材料的褐變。在山月桂樹的莖尖培養(yǎng)中，接種后12～24 h便轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中，然后每天轉(zhuǎn)移1次，連續(xù)1個星期，褐變便得到完全控制[9]。軟棗獼猴桃組織培養(yǎng)過程中每隔10～15 d轉(zhuǎn)換1次培養(yǎng)基可有效控制褐變并保持植株正常生長。

3 參考文獻

[1] DALAL MA，SHANNA BB，RAO MS.Studies on stock plant treatment and initiation culture mode in control of oxidative browning cultures of grapevine[J].Sci Hort，1992（51）：35-41.

[2] 周艷，陳訓.馬纓杜鵑組織培養(yǎng)過程中外植體褐變與多酚氧化酶及酚類物質(zhì)的關(guān)系[J].種子，2009，28（7）：61-63.

[3] 張妙霞，孔祥生，郭秀璞，等.柿樹組織培養(yǎng)防止外植體褐變的研究[J].河南農(nóng)業(yè)大學學報，1999，33（1）：89-93.

[4] 張素勤，鄒志榮，耿廣東，等.非洲菊組織培養(yǎng)抑制褐變現(xiàn)象的研究[J].貴州農(nóng)業(yè)科學，2007，35（2）：56-57.

[5] 潘梅，王景飛，黃賽，等.淮山組織培養(yǎng)抑制褐變的研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2014，42（6）：57-59.

[6] 尚旭嵐，張健，夏晗.鶴望蘭組織培養(yǎng)的褐變因素及防止措施[J].四川農(nóng)業(yè)大學學報，2003，21（3）：61-64.

[7] 鄭曉丹，胡燕梅.海南龍血樹組織培養(yǎng)及抗褐變的研究[J].武漢生物工程學院學報，2011，7（4）：235-237.

[8] 李劍美，寸湘琴，謝世清.魔芋組織培養(yǎng)中的褐變機理及防控措施[J].中國農(nóng)學通報，2006，22（5）：234-236.

[9] 曹孜義，劉國民.實用植物組織培養(yǎng)技術(shù)教程[M].蘭州：甘肅科學技術(shù)出版社，2003：48-49.