張崟，劉文龍，熊偉，宋俊霖，王新惠，王衛(wèi)

（成都大學/四川省肉類加工重點實驗室，四川成都610106）

響應面法優(yōu)化酶解豬血制備血紅素工藝

張崟，劉文龍，熊偉，宋俊霖，王新惠，王衛(wèi)*

（成都大學/四川省肉類加工重點實驗室，四川成都610106）

為了提高從豬血中制備血紅素的得率，并獲得胰蛋白酶水解豬血制備血紅素的最優(yōu)工藝，本文以豬血為原料，采用胰蛋白酶水解豬血，并對酶解工藝采用響應面法進行優(yōu)化。結果發(fā)現(xiàn)，加酶量、酶解溫度、酶解pH均對血紅素的得率有顯著（P＜0.05）影響，水解時間對血紅素得率的影響不顯著（P＞0.05）。擬合模型的顯著性分析及可靠性驗證結果顯示，所得模型能較好地反映各因素與血紅素得率的相關性（R2=0.987），得出加酶量412.5 U/mg、酶解溫度45℃、pH 5、酶解時間5.5h時，血紅素的得率最高，對應的血紅素得率為79.45%（質(zhì)量分數(shù)），實測得率為76.3%±1.97%（質(zhì)量分數(shù)）。

血紅素；酶解；豬血

豬血是生豬屠宰加工主要的副產(chǎn)物之一。盡管豬血的營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，但由于其血腥味較重、適口性差等缺點，導致回收利用較少［1］。這不僅造成資源的巨大浪費，而且也帶來嚴重的環(huán)境污染問題。因此，開發(fā)豬血的綜合利用技術是目前畜禽屠宰業(yè)急需解決的技術難題。血紅素是豬血中具有很高食用和藥用價值的物質(zhì)。血紅素可被腸黏膜細胞直接吸收而不會造成損傷，可用于補鐵類功能性食品加工［2-3］。血紅素還是治療惡性腫瘤的卟啉類藥物和治療肝炎的原卟啉二鈉鹽的前體物質(zhì)［4］。美國FDA早在1983年就批準氯化血紅素作為藥品使用，我國于1998年正式批準以血紅素為基本原料的血卟啉為抗腫瘤新藥［5］。血紅素也是制備膽紅素的前體物質(zhì)，可作為人工牛黃的間接來源［6］。血紅素在肉制品工業(yè)中可作為發(fā)色劑及人工色素替代品［7］。因此，近年來從畜禽血中提取血紅素成為畜禽血回收利用的新亮點。

目前提取血紅素的方法主要有酶解法、有機溶劑法、CMC法及表面活性劑法，其中酶解法被認為是最環(huán)保的一種提取血紅素的方法［6］。In等采用肽鏈外切和內(nèi)切酶水解血紅蛋白制備血紅素肽，酶解液超濾后血紅素與肽的比值達25.4%［8］；楊錫洪等先用中性蛋白酶酶解血紅蛋白，再用風味酶水解，酶解液經(jīng)10 kDa和3 kDa超濾膜超濾，獲得亞鐵血紅素與肽的比值達9.92%［9］。瞿桂香等采用正交試驗法優(yōu)化中性蛋白酶水解豬血制備亞鐵血紅素肽工藝，得出加酶量8 000 U/g、反應pH 7.5、溫度55℃、底物質(zhì)量分數(shù)8%、水解1 h時，血紅素提取效果最好［7］。張亞娟選用不同蛋白酶對豬血紅細胞粉進行水解，得出胰蛋白酶和堿性蛋白酶水解對血紅素提取效果較好［10］。朱媛媛采用正交試驗法對堿性蛋白酶水解牛血紅蛋白制取亞鐵血紅素工藝進行優(yōu)化，得出當堿性蛋白酶水解時，底物濃度7%、加酶量1%、pH 8、酶解2 h時血紅素得率最高為10.87 mg/mL；風味酶水解時，pH 6.5、加酶量2%、酶解2 h血紅素得率最高為11.18 mg/mL［11-12］。研究發(fā)現(xiàn)在酶解工藝優(yōu)化時采用響應面法的優(yōu)化結果優(yōu)于正交試驗法［13］，而以往對酶解血紅蛋白制備血紅素工藝的優(yōu)化主要采用正交試驗法［10-12］，而且目前國內(nèi)外對采用胰蛋白酶水解血紅細胞粉制備血紅素工藝的研究較少。因此，為了獲得更高效的酶解制備血紅素工藝，本文探討了采用胰蛋白酶水解豬血血紅細胞粉制備血紅素的工藝，并采用響應面法對水解工藝進行優(yōu)化，以期為工業(yè)化提取血紅素提供參考。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

新鮮豬血：四川省欣康率食品有限公司；胰蛋白酶（酶活力1 000 U/mg）：上海緣聚生物科技有限公司；分析純檸檬酸、磷酸氫二鈉：成都市科龍化工試劑廠；三羥甲基氨基甲烷（Tris）（分析純）：美國Sigma公司。

SHA-CA型水浴恒溫振蕩器：金壇市金南儀器制造有限公司；ZFD-A5140型鼓風干燥機：上海智成分析儀器制造有限公司；FD-1A-50型真空冷凍干燥機：上海比朗儀器制造有限公司；DR6000紫外可見分光光度計：安慶昌嘉電子產(chǎn)品貿(mào)易有限公司；海爾BCD-182STPA冰箱：青島海爾集團公司。

1.2方法

1.2.1原料處理

新鮮豬血中加入0.314%（質(zhì)量分數(shù)）檸檬酸三鈉，充分混勻，然后在2h內(nèi)將其在3500r/min下離心15min，去除上清液，收集離心管底部的血紅細胞。將收集的血紅細胞置于海爾BCD-182STPA冰箱于-18℃凍結。凍結的血紅細胞采用FD-1A-50型真空冷凍干燥機在-50℃，10 kPa條件下干燥至恒重后備用。

1.2.2血紅素制備工藝

凍干血紅細胞粉→過100目篩→緩沖溶液溶解→預熱至酶解溫度→酶解→滅酶→測定血紅素濃度

1.2.3緩沖液制備

酶解時酶解液pH的調(diào)節(jié)采用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液（pH范圍2.2～8）和Tris-鹽酸（pH范圍7.2～9.0）緩沖溶液。

1.2.4單因素酶解試驗

1.2.4.1加酶量對血紅素得率的影響

取0.2 g凍干的血紅細胞，按料液比1∶100（g/mL）溶于20 mL的檸檬酸和磷酸氫二鈉緩沖液（pH為7），將其置于已升溫至37℃的SHA-CA型水浴振蕩器中，以80 r/min振蕩30 min，使混合溫度升至37℃，然后按0、150、300、450、600、750 U/mg分別加入胰蛋白酶，恒溫酶解3 h。酶解后取出錐形瓶，置于DZKW-4電子恒溫水浴鍋在85℃水浴鍋內(nèi)滅酶15 min。然后測血紅素得率。

1.2.4.2反應溫度對血紅素得率的影響

取0.2 g凍干的血紅細胞，按料液比1∶100（g/mL）溶于20 mL pH 7緩沖液，將其置于SHA-CA型水浴振蕩器中，分別在30、33、36、39、42、45℃，以80 r/min振蕩30 min，使混合液溫度升至設定溫度，然后按1.2.4.1獲得的最高血紅素得率對應的胰蛋白酶用量添加胰蛋白酶，恒溫酶解3 h。酶解后取出錐形瓶，置于DZKW-4電子恒溫水浴鍋在85℃水浴鍋內(nèi)滅酶15 min。然后測血紅素得率。

1.2.4.3反應pH對血紅素得率的影響

取0.2 g凍干的血紅細胞，按料液比1∶100（g/mL）溶于20 mL pH分別為5、6、7、8、9的緩沖液，將其置于SHA-CA型水浴振蕩器中，在1.2.4.2獲得的最高血紅素得率對應的水解溫度下，以80 r/min振蕩30 min，使混合溫度升至設定溫度，然后按1.2.4.1獲得的最高血紅素得率添加胰蛋白酶量，恒溫酶解3 h。酶解后取出錐形瓶，置于DZKW-4電子恒溫水浴鍋在85℃水浴鍋內(nèi)滅酶15 min。然后測血紅素得率。

1.2.4.4反應時間對血紅素得率的影響

取0.2 g凍干的血紅細胞，按料液比1∶100（g/mL）溶于20 mL緩沖液，在1.2.4.1、1.2.4.2、1.2.4.3得到的最高血紅素得率對應的加酶量、酶解溫度和pH下，分別酶解1、2、3、4、5、6 h，酶解前先預熱酶解液至酶解溫度后再加酶。酶解后取出錐形瓶，置于DZKW-4電子恒溫水浴鍋在85℃水浴鍋內(nèi)滅酶15 min。然后測血紅素得率。

1.2.5血紅素含量測定

血紅細胞酶解后血紅素含量的測定采用張亞娟建立的分光光度法對血紅素含量進行定量［10］。通過在波長383 nm處測定血紅素的吸光度，利用已建立的血紅素吸光度與血紅素濃度的關系式，計算血紅素含量。

1.2.6血紅素得率

根據(jù)測得的酶解后血紅素含量和原血粉中血紅素的含量計算血紅素的得率［10］。血紅素得率計算式如下：

式中：Y為血紅素得率，%；mHeme為提取的血紅素質(zhì)量，g；m血紅素總量為所用血紅細胞干粉中血紅素的總質(zhì)量，g。

1.2.7響應面設計

采用4因素、5中心、1響應、31次試驗的中心旋轉(zhuǎn)設計，對胰蛋白酶水解工藝條件進行分析和優(yōu)化［14］。因素編碼及因素水平見表1。

表1　因素編碼及各因素水平Table 1Coded level of experiment factors

1.2.8數(shù)據(jù)分析

試驗中血紅素含量測定均做3次平行測定。試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010求平均值、計算標準誤差并繪圖。采用SAS 9.0軟件設計響應面試驗方案，并對試驗數(shù)據(jù)進行擬合和優(yōu)化分析。

2　結果與討論

2.1單因素試驗

2.1.1加酶量對血紅素得率的影響

加酶量對血紅素得率的影響見圖1。

圖1中數(shù)據(jù)顯示，隨著加酶量的增加，血紅素得率呈先增加后減少的趨勢。加酶量為600 U/mg時血紅素得率顯著（P＜0.05）高于其他加酶量；加酶量為450 U/mg時血紅素的得率顯著（P＜0.05）高于加酶量為300 U/mg；加酶量為750 U/mg時血紅素的得率與加酶量為900 U/mg時的血紅素得率無顯著差異（P＜0.05）。因此，選擇加酶量在450 U/mg～750 U/mg之間作為優(yōu)化試驗的加酶量取值范圍。

圖1　加酶量對血紅素得率的影響Fig.1Effect of enzyme amount on extract ratio of heme

豬血血紅細胞干物質(zhì)中血紅蛋白含量98.09%［15］。血紅蛋白由蛋白質(zhì)和輔基兩部分組成，蛋白質(zhì)部分為珠蛋白，輔基部分為血紅素［7］。當加酶量增加時，酶與底物比增加，更多的珠蛋白被分解，血紅素被釋放；但是當加酶量過多時，導致血紅蛋白的蛋白質(zhì)過度分解，致使釋放的血紅素與酶解肽混合而難以分離。這可能是導致血紅素得率隨著加酶量的增加呈現(xiàn)先增加后減少趨勢的主要原因。

2.1.2酶解溫度對血紅素得率的影響

酶解溫度對血紅素得率的影響見圖2。

圖2　酶解溫度對血紅素得率的影響Fig.2Effect of hydrolysis temperature on extract ratio of heme

圖2中曲線的分布趨勢表明，隨著酶解溫度的增加，血紅素得率呈現(xiàn)先增加后降低趨勢；當酶解溫度為39℃時，血紅素的得率顯著（P＜0.05）高于其他溫度。溫度為36℃和42℃時血紅素的得率均顯著（P＜0.05）低于39℃時血紅素的得率。因此，選擇36℃～42℃溫度區(qū)間為優(yōu)化試驗的溫度取值范圍。

酶在作用于底物時，有最適的作用溫度［16］。這可能是胰酶水解血紅細胞提取血紅素時，血紅素得率隨酶解溫度增加呈先增加后減小趨勢的主要原因。類似現(xiàn)象在堿性蛋白酶水解血紅蛋白提取血紅素的單因素試驗中出現(xiàn)［10，17］。

2.1.3酶解pH對血紅素得率的影響

pH對血紅素得率的影響見圖3。

圖3　酶解pH對血紅素得率的影響Fig.3Effect of hydrolysis pH on extract ratio of heme

圖3中數(shù)據(jù)顯示，pH對血紅素得率有顯著（P< 0.05）影響。當pH為7時，血紅素的得率顯著（P＜0.05）高于pH 6和pH 9時的得率，但與pH 8時的得率無顯著差異（P＞0.05）。因此，選擇pH 6～8作為優(yōu)化試驗的pH取值范圍。

胰酶水解蛋白質(zhì)時有最適的pH，而且該pH受其他酶解條件影響而發(fā)生變化，如底物種類、酶解溫度、加酶量、酶解時間等。文獻報道胰蛋白酶水解海參制備肽時的pH為8［18］；胰蛋白酶水解制備蛤蟆油蛋白時的最適pH為4.5［19］。海參與蛤蟆油蛋白的性質(zhì)不同，前者主要是胰蛋白酶與海參蛋白質(zhì)間的相互作用，而后者在酶解的同時還要利用低酸性條件使脂肪酸與蛋白質(zhì)分離再酶解。由此可見，底物的性質(zhì)對酶解pH的影響很大。

2.1.4酶解時間對血紅素得率的影響

酶解時間對血紅素得率的影響見圖4。

圖4　酶解時間對血紅素得率的影響Fig.4Effect of hydrolysis time on extract ratio of heme

圖4中數(shù)據(jù)顯示，隨著酶解時間增加，血紅素得率呈現(xiàn)逐漸增加趨勢，當酶解時間達4 h以后，血紅素的得率提高不顯著（P＞0.05），趨于恒定。水解3 h時血紅素的得率顯著（P＜0.05）低于4、5 h和6 h時的得率。因此，在響應面優(yōu)化水解工藝時，選擇提取時間范圍為4 h～5 h。

隨著酶解時間的增加，酶作用于底物的時間也增加。因而會使血紅蛋白更多地被分解，進而釋放出輔基血紅素。但是在加酶量和底物濃度一定的條件下，隨著水解時間增加，水解產(chǎn)生的血紅素量會趨于恒定，加之水解產(chǎn)生多肽使血紅素的分離純化難度增加。因而導致血紅素的得率增長緩慢。這可能是隨著酶解時間的增加，血紅素得率趨于穩(wěn)定的主要原因。類似現(xiàn)象在堿性蛋白酶水解豬血紅蛋白提取血紅素的單因素試驗中出現(xiàn)［10］。

2.2酶解工藝的響應面法優(yōu)化

2.2.1優(yōu)化試驗方案及試驗結果

為了進一步獲得最優(yōu)的胰蛋白酶水解提取血紅素工藝，在單因素試驗確定的加酶量、酶解溫度、pH和酶解時間取值范圍基礎上，采用中心旋轉(zhuǎn)設計法對響應面試驗方案進行了設計。所得試驗方案及試驗結果見表2。

表2　響應面試驗方案及試驗結果Table 2Response surface plan and experiment results

對表2中各因素與血紅素得率進行擬合，所得擬合方程見式1。

式中：Y表示血紅素得率，%；X1表示加酶量，U/mg；X2表示酶解溫度，℃；X3表示酶解pH；X4表示酶解時間，h。

2.2.2擬合顯著性分析

對擬合模型（式1）及擬合模型中各因素對血紅素得率影響的顯著性進行分析，結果見表3。

表3　數(shù)學模型的顯著性分析Table 3Significant analysis of relativity model

由表3所得顯著性分析結果顯示，P主模型=0.000 1＜0.05，P失擬項=0.142 412＞0.05，且擬合相關性系數(shù)的平方（R2）=0.987。由此可知，所得模型具有較高的顯著性，能夠有效反映各因素與血紅素得率的關系。PX1（加酶量）= PX2（酶解溫度）=PX3（pH）=0.000 1＜0.05，由此可知，酶解溫度、pH及加酶量均對血紅素得率有顯著影響，而且影響程度相近。PX4（酶解時間）=0.395 041＞0.05，因此酶解時間對血紅素得率的影響不顯著。

2.2.3擬合模型的可靠性驗證

為了進一步驗證擬合模型（式1）的可靠性，以獲得可靠的最優(yōu)酶解工藝，對擬合模型的計算結果與實測結果進行對比，所得結果見表4。

表4　擬合模型在預測血紅素得率時的有效性驗證Table 4Effectiveness of relativity model in predicting the extract ratio of hemoglobin

表4中的實測血紅素得率（Y實）與計算血紅素得率（Y計）相對誤差顯示，相對誤差值均小于10%。由此可見，所得模型具有較好的可靠性，可用于試驗優(yōu)化以獲得最優(yōu)的酶解工藝條件。

2.3酶解工藝優(yōu)化

以式1擬合模型為依據(jù)，對最優(yōu)的酶解工藝條件進行優(yōu)化，得出加酶量412.5 U/mg、酶解溫度45℃、pH 5、酶解時間5.5 h時，血紅素的得率最高，對應的血紅素得率為79.45%（質(zhì)量分數(shù)）。通過再次對優(yōu)化工藝進行試驗驗證，得出實測血紅素得率為76.3%±1.97%（質(zhì)量分數(shù)）。與優(yōu)化得到的最優(yōu)值79.45%比較，相對誤差為3.96%。因此，加酶量412.5 U/mg、酶解溫度45℃、pH 5、酶解時間5.5 h為制備血紅素的最優(yōu)酶解工藝。

加酶量、酶解溫度及pH，酶解時間對血紅素得率的影響也可以通過響應面圖看出（圖5）。圖中血紅素得率的變化趨勢顯示，隨著加酶量、酶解溫度及pH的變化，血紅素得率的變化程度均較隨酶解時間變化大。由此可見，在用胰蛋白酶水解血紅細胞粉制備血紅素時，應嚴格控制加酶量、酶解溫度及pH，以獲得理想的酶解效果。

3　結論

圖5　酶解因素與血紅素得率的響應面圖Fig.5Response Surface of the optimized extract ratio of serum protein

采用響應面法優(yōu)化胰蛋白酶水解血紅細胞提取血紅素工藝的結果顯示，加酶量、酶解溫度、酶解pH均對血紅素的得率有顯著（P＜0.05）影響；酶解時間對血紅素得率的影響不顯著（P＞0.05）。擬合模型的顯著性分析及可靠性驗證結果顯示，所得模型能較好地反映酶解各因素與血紅素得率的相互關系（R2=0.987）。根據(jù)所得的擬合模型，對胰蛋白酶水解血紅細胞粉提取血紅素的工藝進行優(yōu)化，得出加酶量412.5 U/mg、酶解溫度45℃、pH 5、酶解時間5.5 h時血紅素的得率最高，對應的優(yōu)化血紅素得率為79.45%，實測得率為76.3%±1.97%。

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Process Optimization of Preparing Heme from Pig Blood by Enzymatic Hydrolysis with Response Surface Method

ZHANG Yin，LIU Wen-long，XIONG Wei，SONG Jun-lin，WANG Xin-hui，WANG Wei*
（Chengdu University，Key Laboratory of Meat Processing of Sichuan，Chengdu 610106，Sichuan，China）

In order to improve extracting ratio of heme from pig blood，and obtain an optimal process of heme preparation by trypsin hydrolysis，the pig blood was taken as raw material，trypsin was adopted to hydrolyze the red blood cell，and the hydrolysis process was optimized using response surface method.Results showed that the extraction ratio of the heme was significantly（P＜0.05）affected by the amount of trypsin，hydrolysis temperature，and hydrolysis pH，the extraction ratio of the heme was not significantly（P＞0.05）influenced by hydrolysis time.The significance analysis of the fitting model and the results of reliability confirmation indicated that the obtained fitting model correlated the factors and the extraction ratio of heme well（R2=0.987）.Results showed that the heme extraction ratio was the highest with the amount of trypsin of 412.5 U/mg，enzyme temperature of 45℃，pH of 5，hydrolysis time of 5.5 h.The corresponding heme extraction ratio was 79.45%（mass fraction），the confirmed heme extraction ratio was 76.3%±1.97%（mass fraction）.

heme；enzymolysis；pig blood

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.024

四川省教育廳重點項目（14ZA0320）；自然科學基金青年基金（31501505）

張崟（1981—），男（漢），副教授，博士，從事肉品加工及副產(chǎn)物利用方面的研究。

王衛(wèi)（1958—），男（漢），教授，碩士，從事肉品加工方面的研究。

2015-12-11