魏明 梁穎紅 涂玲 劉佳 龔艷杰 張宜花 楊璐

450052鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科

miRNA-146a對(duì)尋常性銀屑病患者外周血CD4+T細(xì)胞的調(diào)控研究

魏明 梁穎紅 涂玲 劉佳 龔艷杰 張宜花 楊璐

450052鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科

目的 研究miRNA-146a對(duì)尋常性銀屑病患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞的調(diào)控，探討miRNA-146a在尋常性銀屑病發(fā)病中的作用。方法 收集尋常性銀屑病患者和健康對(duì)照各30例。采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測外周血CD4+T淋巴細(xì)胞miRNA-146a表達(dá)水平，ELISA檢測血漿干擾素（IFN）-γ、白細(xì)胞介素（IL）-4表達(dá)水平。免疫磁珠法分選外周血CD4+T淋巴細(xì)胞，將分離的細(xì)胞分為對(duì)照組、miRNA-146a組和miRNA-146a抑制物組，分別轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照miRNA、miRNA-146a模擬物和miRNA-146a抑制物后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀檢測Th1和Th2細(xì)胞數(shù)量，蛋白免疫印跡法和實(shí)時(shí)定量PCR分別檢測IFN-γ受體α（IFN-γRα）、T細(xì)胞表達(dá)T盒（T-bet）、GATA-3蛋白和mRNA的表達(dá)，ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清液IFN-γ、IL-4水平。結(jié)果 尋常性銀屑病患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞miRNA-146a［（243.81±94.32）%］與血漿IFN-γ水平［（27.69±7.64）ng/L］較健康對(duì)照組［分別為（105.74±22.93）%和（9.75±2.81）ng/L］升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為 6.653和 4.237，均P＜0.01），且miRNA-146a的表達(dá)與血清IFN-γ呈正相關(guān)（r=0.837，P＜0.01）。體外CD4+T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，miRNA-146a組Th1數(shù)量、T-bet蛋白和mRNA表達(dá)、培養(yǎng)上清液IFN-γ水平均顯著增加，IFN-γRα蛋白表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；但是，與對(duì)照組比較，miRNA-146a組和miRNA-146a抑制物組Th2細(xì)胞數(shù)量、GATA-3蛋白、GATA-3 mRNA表達(dá)以及上清液中IL-4水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。結(jié)論 miRNA-146a可能通過影響Th1細(xì)胞的分化和功能參與對(duì)尋常性銀屑病患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞的調(diào)控，在銀屑病發(fā)病過程中發(fā)揮一定的作用。

銀屑?。籖NA；T淋巴細(xì)胞，輔助誘導(dǎo)；干擾素γ；白細(xì)胞介素4；微RNAs

銀屑病是一種多基因遺傳背景下由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥性皮膚病，CD4+T細(xì)胞及多種細(xì)胞因子在銀屑病的發(fā)病中起重要作用［1］。微小RNA（micro-RNA，miRNA）是一類高度保守的非編碼小分子單鏈RNA，參與調(diào)控細(xì)胞生長、發(fā)育、分化和增殖等多個(gè)生命過程［2］，參與免疫細(xì)胞分化和成熟、抗體產(chǎn)生、炎性因子釋放等免疫過程，對(duì)機(jī)體免疫功能的正常發(fā)揮起非常重要的作用［3］。研究表明，miRNA-146a可影響CD4+T淋巴細(xì)胞亞群分化、增殖和活化的過程［4-5］，但miRNA-146a在尋常性銀屑病中的表達(dá)對(duì)CD4+T細(xì)胞是否有作用尚不清楚。我們通過研究miRNA-146a對(duì)尋常性銀屑病患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞亞群的調(diào)控，探討miRNA-146a在銀屑病發(fā)病中的作用。

材料與方法

1.研究對(duì)象：2011年10月7日至2014年12月25日就診于鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院皮膚性病科門診的尋常性銀屑病患者30例，采用銀屑病面積和嚴(yán)重程度指數(shù)（psoriasis area and severity index，PASI）［6］對(duì)病情進(jìn)行評(píng)分，其中男 18 例，女 12 例，平均年齡18.60歲，病程1個(gè)月至30年，平均7.1年，PASI評(píng)分1.8～50.0分，平均14.36分。患者近4周內(nèi)未接受糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑等系統(tǒng)治療，未合并其他皮膚病及自身免疫性疾病、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、肝病或腫瘤等。健康對(duì)照組30例，其中男11例，女9例，平均年齡18.46歲。兩組性別構(gòu)成、年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有病例選擇和標(biāo)本提取均獲患者知情同意并簽署同意書。

2.標(biāo)本采集：取肝素抗凝外周靜脈血10 ml用于ELISA檢測和CD4+T淋巴細(xì)胞分離；取其中9例患者外周血分離的CD4+T淋巴細(xì)胞用于體外培養(yǎng)干預(yù)實(shí)驗(yàn)。本試驗(yàn)遵照鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)人體試驗(yàn)管理規(guī)范執(zhí)行。

3.主要試劑與儀器：改良型RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Hyclone公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），人淋巴細(xì)胞分離液（北京索萊寶科技有限公司），Trizol試劑（北京天根生化科技有限公司），藻紅蛋白（P-phycoerythrin）-青色素（cyanine）染料 5（PE-Cy5）標(biāo)記小鼠抗人 CD4 單克隆抗體、異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記小鼠抗人IFN-γ單克隆抗體、藻紅蛋白（PE）標(biāo)記小鼠抗人IL-4單克隆抗體（美國Biolegend公司），佛波酯、離子霉素、莫能星（monensin）（美國 Sigma公司），破膜劑（美國BD公司），人CD4+T細(xì)胞分選試劑盒（挪威Dynal公司），干擾素（IFN）-γ受體 α（IFN-γRα）、T細(xì)胞表達(dá) T 盒（T-box expressed in T cells，T-bet）、GATA 結(jié)合蛋白 3（GATA-binding protein 3，GATA-3）、β 肌動(dòng)蛋白多克隆抗體（美國Proteintech Group公司），人IFN-γ、IL-4 ELISA定量檢測試劑盒（美國R&D公司），實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒（美國GeneCopeia公司），Epics XL型流式細(xì)胞儀（美國Beckman-Coulter公司），垂直電泳儀、電泳槽、蛋白電泳轉(zhuǎn)膜裝置、GelDoc 2000型凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

4.細(xì)胞分離、培養(yǎng)及體外轉(zhuǎn)染：采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。免疫磁珠法進(jìn)一步從單個(gè)核細(xì)胞中分離CD4+T淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的純度，0.2%臺(tái)盼藍(lán)鑒定活細(xì)胞數(shù)。將分離獲取的細(xì)胞調(diào)整為2×106/ml，并分為對(duì)照組（轉(zhuǎn)染50 nmol/L陰性對(duì)照miRNA）、miRNA-146a組（轉(zhuǎn)染50 nmol/L miRNA-146a模擬物）和miRNA-146a抑制物組（轉(zhuǎn)染50 nmol/L miRNA-146a 抑制物）。陰性對(duì)照 miRNA、5′-miRNA-146a模擬物與miRNA-146a抑制物的序列分別為 5′-CGCGAGAAGAUGACCCAGAU-3′、5′-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGUCCCUAUCACG AUUAGCAUUAAUU-3′和 5′-ACCCCUAUCACGAU UAGCAUUAA-3′。用脂質(zhì)體2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染過程嚴(yán)格按操作說明進(jìn)行。轉(zhuǎn)染5 h后，用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素、2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取少量細(xì)胞懸液涂布于載玻片上，倒置相差熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞發(fā)出綠光。計(jì)算轉(zhuǎn)染率，轉(zhuǎn)染率=發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞數(shù)/可見光下總細(xì)胞數(shù)×100%，48 h后，細(xì)胞計(jì)數(shù)，收集細(xì)胞。

5.流式細(xì)胞儀檢測Th1和Th2細(xì)胞：取2.0×105/ml CD4+T淋巴細(xì)胞，加含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，加入佛波酯（25 μg/L）、離子霉素（1 mg/L）、莫能星（1.7 mg/L），孵育 5 h，離心后加破膜劑500 μl，破膜 10 min后分別加 PE-CY5-CD4，PE-IL-4和FITC-IFN-γ單抗，對(duì)照管加同型對(duì)照抗體，室溫下孵育15 min，上機(jī)行流式細(xì)胞儀檢測。

6.ELISA檢測IFN-γ、IL-4水平：將全血以850×g離心15 min后取血漿，放置在-80℃冰箱中備用，集中檢測。取2×106/ml轉(zhuǎn)染后的CD4+T淋巴細(xì)胞和對(duì)照組CD4+T淋巴細(xì)胞分別加入5 μg/L的植物凝血素，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)刺激48 h后收集上清液。采用ELISA法檢測血漿和上清液IFN-γ、IL-4的表達(dá)水平，操作按說明書進(jìn)行。

7.蛋白免疫印跡法檢測 T-bet、GATA-3、IFN-γRα蛋白的表達(dá)：在植物凝血素刺激后收集細(xì)胞，用蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度。取蛋白樣品于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上。室溫下封閉1 h，加入兔抗人T-bet多克隆抗體（1∶500），兔抗人GATA-3多克隆抗體（1∶500），兔抗人IFN-γRα 多克隆抗體（1∶500）室溫孵育 2 h，以小鼠抗人β肌動(dòng)蛋白單克隆抗體（1∶2 000）作為內(nèi)參。漂洗后加相應(yīng)二抗孵育1 h，加入ECL發(fā)光劑，曝光，顯影并定影。用Quantity One軟件分析目標(biāo)條帶的灰度值，以目標(biāo)條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

8.實(shí)時(shí)定量 PCR 檢測 miRNA-146a、T-bet、GATA-3和IFN-γRα mRNA的表達(dá)：體外培養(yǎng)細(xì)胞在植物凝血素刺激后，用Trizol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，建立PCR反應(yīng)體系。miRNA-146a及內(nèi)參照U6引物由美國GeneCopeia公司提供（miRNA-146a擴(kuò)增應(yīng)用miScript通用引物及其特異性引物，分別為：5′-UGAGAACU GAAUUCCAUGGGUU-3′和 U6：5′-CTCGCTTCGGCAG CAGC ACA-3′）。 T-bet、GATA-3、IFN-γRα及β肌動(dòng)蛋白引物［生工生物工程（上海）有限公司合成］見表1。PCR反應(yīng)步驟如下：95℃變性10min；40個(gè)循環(huán)（95 ℃，10 s；退火，20 s；72 ℃，31 s）。miRNA-146a的 PCR反應(yīng)退火溫度為 60℃，T-bet、GATA-3、IFN-γRα的PCR反應(yīng)退火溫度均為58℃。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，從72℃緩慢加熱到95℃，以建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線。每個(gè)標(biāo)本均設(shè)置2個(gè)復(fù)管行PCR反應(yīng)。根據(jù)各基因?qū)崟r(shí)擴(kuò)增曲線和熔解曲線，取Ct值，按 2-△△Ct法計(jì)算待測目的基因相對(duì)表達(dá)量，2-△△Ct值相差3倍認(rèn)為表達(dá)有差異［7］。

9.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析并進(jìn)行多重比較，相關(guān)性采用直線相關(guān)分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.外周血CD4+T淋巴細(xì)胞miRNA-146a的表達(dá)：尋常性銀屑病患者組miRNA-146a的表達(dá)（243.81%±94.32%）高于健康對(duì)照組（105.74%±22.93%），兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.653，P＜0.01）。

2.血漿IFN-γ、IL-4水平：尋常性銀屑病組患者血漿 IFN-γ水平［（27.69±7.64）ng/L］顯著高于健康對(duì)照組［（9.75± 2.81）ng/L］，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.237，P＜0.01）；兩組 IL-4水平分別為（12.65±2.17）ng/L和（11.38±2.23）ng/L，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.037，P＞0.05）?；颊呓M外周血CD4+T淋巴細(xì)胞miRNA-146a表達(dá)與IFN-γ水平呈正相關(guān)（r=0.837，P＜0.01），與 IL-4水平無相關(guān)關(guān)系（r=0.004，P＞ 0.05）。

表1 引物序列

表2 體外培養(yǎng)銀屑病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中干擾素γ（INF-γ）+CD4+T細(xì)胞和白細(xì)胞介素4（IL-4）+CD4+T細(xì)胞比例以及培養(yǎng)上清液INF-γ、IL-4水平（±s）

表2 體外培養(yǎng)銀屑病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中干擾素γ（INF-γ）+CD4+T細(xì)胞和白細(xì)胞介素4（IL-4）+CD4+T細(xì)胞比例以及培養(yǎng)上清液INF-γ、IL-4水平（±s）

注：a：與對(duì)照組比較，P ＜ 0.01；b：與 miRNA-146a組比較，P ＜ 0.01

處理組例數(shù)IFN-γ+（%)IL-4+（%)IFN-γ（ng/L)IL-4（ng/L)對(duì)照組 9 19.28±2.41 2.08±0.32 32.33±4.22 9.11±1.15 miRNA-146a組 9 33.12±2.87a 2.16±0.30 54.69±6.26a 8.59±1.13 miRNA-146a抑制物組 9 24.45±3.31b 2.11±0.31 43.14±5.73b 8.87±1.14 F值 55.367 0.481 45.638 0.376 P值 ＜0.01 0.612 ＜0.01 0.679

3.體外CD4+T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)后Th1和Th2細(xì)胞變化：miRNA-146a組Th1細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組和miRNA-146a抑制物組（均P＜0.01）。3組間Th2細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

4.體外細(xì)胞培養(yǎng)上清液IFN-γ、IL-4水平：miRNA-146a組IFN-γ水平顯著高于對(duì)照組和miRNA-146a抑制物組（均P＜0.01）。3組間IL-4水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

5.IFN-γRα、T-bet、GATA-3 蛋白表達(dá) ：miRNA-146a組IFN-γRα蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組和miRNA-146a抑制物組，T-bet蛋白表達(dá)顯著高于后兩組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。3組間GATA-3蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。患者組IFN-γRα蛋白表達(dá)與IFN-γ水平呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.753，P＜0.01），與IL-4表達(dá)無明顯相關(guān)性（r=0.038，P＞0.05）。見表3，圖1。

表3 體外培養(yǎng)銀屑病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞中干擾素γ受體α（IFN-γRα）、T-bet、GATA3蛋白及 mRNA 表達(dá)（±s）

表3 體外培養(yǎng)銀屑病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞中干擾素γ受體α（IFN-γRα）、T-bet、GATA3蛋白及 mRNA 表達(dá)（±s）

注：IFN-γRα：IFN-γ 受體 α；T-bet：T 細(xì)胞表達(dá) T 盒；GATA-3:鳥嘌呤腺嘌呤胸腺嘧啶腺嘌呤序列結(jié)合蛋白-3。a：與對(duì)照組比較，P ＜ 0.01；b：與miRNA-146a組比較，P＜0.01

處理組 例數(shù)對(duì)照組 9 0.95±0.09 0.75±0.06 0.57±0.06 1.01±0.16 1.04±0.15 1.03±0.31 miRNA-146a組 9 0.41±0.06a 0.76±0.07 1.21±0.11a 1.12±0.17 1.14±0.16 2.26±0.68a miRNA-146a抑制物組 9 0.62±0.06b 0.77±0.07 0.89±0.07b 1.08±0.16 1.12±0.15 1.69±0.67b F值 143.217 0.086 152.353 1.024 1.536 12.753 P值 ＜0.01 0.901 ＜0.01 0.351 0.231 ＜0.01 IFN-γRα蛋白 GATA3蛋白 T-bet蛋白 IFN-γRα mRNA GATA3 mRNA T-bet mRNA

圖1 銀屑病患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞干擾素γ受體α（IFN-γRα）、T-bet、GATA-3 蛋白的表達(dá) 1：對(duì)照組；2：miRNA-146a組；3：miRNA-146a抑制物組

6. 體外培養(yǎng)細(xì)胞IFN-γRα、T-bet，GATA3mRNA表達(dá)變化：miRNA-146a組 T-bet mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組和miRNA-146a抑制物組 （均P＜ 0.01）；3 組間 IFN-γRα、GATA-3 mRNA表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

討 論

miRNA存在于基因組的非編碼區(qū)，通過靶mRNA靶位點(diǎn)與3′端非翻譯區(qū)的堿基配對(duì)，參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡的生物學(xué)過程［8-9］。Zibert等［10］發(fā)現(xiàn)，丹麥尋常性銀屑病患者皮損和未受累健康皮膚組織中miRNAs的表達(dá)具有差異性。Sonkoly等［11］采用實(shí)時(shí)定量PCR方法對(duì)銀屑病患者和健康人體不同組織中miRNA-146a等表達(dá)譜進(jìn)行分析比較，結(jié)果顯示，miRNA-146a在銀屑病皮損中表達(dá)量較健康人皮膚明顯增加。Koga等［12］研究結(jié)果顯示，銀屑病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miRNA-146a量也升高，上調(diào)的miRNA-146a可能通過對(duì)T細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用抑制過度的慢性炎癥反應(yīng)。miRNA-146a作為一個(gè)負(fù)調(diào)控分子，可通過互補(bǔ)結(jié)合于白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶1（IRAK1）和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）的3′端非翻譯區(qū)，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制TRAF6和IRAK1的表達(dá)［13-14］，從而對(duì)天然免疫應(yīng)答中細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用［15］，提示尋常性銀屑病患者miRNA-146a表達(dá)升高可能損傷了機(jī)體的天然免疫，在尋常性銀屑病的發(fā)病過程中發(fā)揮一定的作用。

越來越多的研究表明，miRNA參與了CD4+T淋巴細(xì)胞活化的過程，抗CD3抗體刺激活化的T淋巴細(xì)胞可導(dǎo)致多種 miRNA 表達(dá)的改變［16］。Guo 等［17］研究表明，miRNA-146a可導(dǎo)致Th1/Th2亞群失衡從而參與急性冠脈綜合征的發(fā)病過程。本研究結(jié)果顯示，miRNA-146a在尋常性銀屑病患者的CD4+T淋巴細(xì)胞表達(dá)明顯上調(diào)，且和細(xì)胞因子IFN-γ表達(dá)水平呈正相關(guān)，提示miR-146a參與尋常性銀屑病患者CD4+T淋巴細(xì)胞的調(diào)控，可能影響Th1細(xì)胞的分化和功能。進(jìn)一步體外細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示，miRNA-146a干預(yù)可以明顯增加Th1細(xì)胞主要轉(zhuǎn)錄因子T-bet蛋白和mRNA表達(dá)，主要的細(xì)胞因子IFN-γ表達(dá)也明顯增加。提示miRNA-146a可能通過復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行調(diào)控，影響T-bet及效應(yīng)因子IFN-γ的表達(dá)。而IFN-γRα的mRNA表達(dá)無明顯改變，蛋白表達(dá)降低。表明IFN-γRα可能是miRNA-146a的直接靶基因，通過IFN-γRα介導(dǎo)的IFN-γ刺激信號(hào)在Th1細(xì)胞的分化過程中起重要作用。推測miRNA-146a促進(jìn)Th1細(xì)胞分化的作用可能與下調(diào)IFN-γRα的蛋白表達(dá)有關(guān)。

但在本研究中，尋常性銀屑病患者體外培養(yǎng)CD4+T淋巴細(xì)胞給予miRNA-146a干預(yù)后，Th2細(xì)胞數(shù)量及活化均無明顯改變。其原因可能與疾病過程中細(xì)胞的狀態(tài)及誘導(dǎo)分化的條件有關(guān)，且miRNA對(duì)基因調(diào)控途徑是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，其可以通過一個(gè)miRNA來調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)，也可以通過多個(gè)miRNA的共同作用來精細(xì)調(diào)控某個(gè)基因的表達(dá)［18］。因此，可能有多個(gè)miRNA共同參與尋常性銀屑病患者CD4+T淋巴細(xì)胞分化及活化相關(guān)靶基因的調(diào)控，最終的調(diào)控效應(yīng)表現(xiàn)為對(duì)Th2的分化和功能無明顯影響，但miRNA對(duì)Th2作用有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，尋常性銀屑病患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞miRNA-146a的表達(dá)增加，可通過調(diào)控CD4+T淋巴細(xì)胞使其偏向Th1細(xì)胞分化，導(dǎo)致Th1/Th2的失衡，同時(shí)可活化和增強(qiáng)Th1的功能，主要炎癥細(xì)胞因子分泌增加，繼而導(dǎo)致尋常性銀屑病免疫調(diào)控功能紊亂。因此，CD4+T淋巴細(xì)胞miRNA-146a的表達(dá)增加在尋常性銀屑病的發(fā)生過程中具有重要的作用，但miRNA-146a在尋常性銀屑病中的具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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Regulatory effects of miRNA-146a on peripheral blood CD4+T lymphocytes from patients with psoriasis vulgaris

Wei Ming,Liang Yinghong,Tu Ling,Liu Jia,Gong Yanjie,Zhang Yihua,Yang Lu
Clinical Laboratory,Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China

ObjectiveTo evaluate regulatory effects of miRNA-146a on peripheral blood CD4+T lymphocytes from patients with psoriasis vulgaris,and to investigate the role of miRNA-146a in the pathogenesis of psoriasis vulgaris.MethodsTotally,30 patients with psoriasis vulgaris and 30 healthy human controls were enrolled into this study.Venous blood samples were obtained from these subjects,and CD4+T lymphocytes were isolated from these samples by using magnetic activated cell sorting （MACS）.Real-time quantitative PCR （RT-PCR）was performed to measure the expression of miRNA-146a in peripheral blood CD4+T lymphocytes,and enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）to determine plasma levels of interferon-γ（IFN-γ）and interleukin 4（IL-4）.Some CD4+T lymphocytes were divided into 3 groups to be transfected with 50 nmol/L negative control miRNA （control group）,miRNA-146a mimics（miRNA-146a group）or miRNA-146a inhibitor （miRNA-146a inhibitor group）.After 24-hour additional culture,flow cytometry was conducted to determine the number of Th1 and Th2 cells,Western-blot analysis and RT-PCR were performed to measure the protein and mRNA expressions of IFN-γ receptor α （IFN-γRα）,T-box expressed in T cells （T-bet）and GATA-binding protein-3 （GATA-3）respectively,and ELISA was carried out to determine the levels of IFN-γ and IL-4 in supernatants of CD4+T lymphocytes.ResultsCompared with the healthy control group,the patient group showed significantly increased miRNA-146a expression in peripheral blood CD4+T lymphocytes（243.81% ±94.32%vs.105.74%±22.93%,t=6.653,P＜0.01）and plasma IFN-γ level（27.69±7.64 ng/L vs.9.75±2.81 ng/L,t=4.237,P＜0.01）.Moreover,miRNA-146a expression was positively correlated with plasma IFN-γ level in the patients（r=0.837,P＜0.01）.After 24-hour culturein vitro,there was a significant increase in the number of Th1 cells,protein and mRNA expressions of T-bet,and supernatant level of IFN-γ,but a significant decrease in the protein expression of IFN-γRα in the miRNA-146a group compared with the control group（all P＜0.01）.However,no significant differences were observed in the number of Th2 cells,mRNA or protein expressions of GATA-3,or supernatant level of IL-4 among the control group,miRNA-146a group and miRNA-146a inhibitor group （allP＞0.05）.ConclusionmiRNA-146a may play an important role in the pathogenesis of psoriasis vulgaris by participating in the regulation of peripheral blood CD4+T lymphocytes via affecting Th1 cell differentiation and function.

Psoriasis;RNA;T-lymphocytes,helper-inducer;Interferon-gamma;Interleukin-4;MicroRNAs

Wei Ming,Email:gushiweiming@126.com

魏明，Email：gushiweiming@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.04.004

2015-08-04）

（本文編輯：尚淑賢）