路雨婷 王震英 宋亞麗 姬燦燦 張莉

250021濟南，山東大學附屬省立醫(yī)院皮膚科

人GJB6基因Tet-on HaCaT細胞穩(wěn)定株的構建與鑒定

路雨婷 王震英 宋亞麗 姬燦燦 張莉

250021濟南，山東大學附屬省立醫(yī)院皮膚科

目的 以Tet-on慢病毒為載體建立穩(wěn)定表達GJB6基因及其突變體的HaCaT細胞株，為后續(xù)研究有汗性外胚層發(fā)育不良的發(fā)病機制奠定實驗基礎。方法 利用PCR技術擴增人GJB6基因野生型與突變型（A88V）基因，重組Tet-on慢病毒質粒，經基因測序及酶切技術對其鑒定，再將重組慢病毒轉染入HaCaT細胞，經嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定表達編碼縫隙連接蛋白Cx30的GJB6基因的細胞株。細胞株加四環(huán)素誘導后，通過RTPCR檢測GJB6基因的mRNA表達量，同時通過Western印跡檢測Cx30與FLAG標簽肽的表達，從而對穩(wěn)定表達GJB6基因的HaCaT細胞株進行鑒定。用CCK8法檢測GJB6基因野生型與突變型經四環(huán)素誘導表達后對細胞增殖的影響。結果 經酶切、測序鑒定，重組慢病毒質粒構建成功。RT-PCR檢測到穩(wěn)定轉染的HaCaT細胞中GJB6基因mRNA表達量明顯增加，感染野生型Tet-on慢病毒的HaCaT細胞組（WT組）加四環(huán)素GJB6基因表達豐度是WT組不加四環(huán)素的113.369倍（P＜0.05），感染突變型（A88V）Tet-on慢病毒的HaCaT細胞組（MU組）加四環(huán)素GJB6基因表達豐度是MU組不加四環(huán)素的3.249倍（P＜0.05）；Western印跡可檢測到經四環(huán)素處理的WT組和MU組穩(wěn)定表達Cx30與FLAG，而未經四環(huán)素處理的細胞和感染陰性對照病毒的HaCaT細胞組（NC組）未檢測到Cx30與FLAG目的條帶。NC組加與不加入四環(huán)素在4、8、12、24、36、48 h時的A值差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；WT組加與不加入四環(huán)素在4、8、12、24、36 h時的A值差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；MU組加與不加入四環(huán)素在4、8、12、24、36、48 h時的A值差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論 成功構建出穩(wěn)定表達GJB6基因野生型及其突變體A88V的HaCaT細胞株。

外胚層發(fā)育不良癥；連接蛋白類；GJB6基因；HaCaT細胞；Tet-on

Cx30是縫隙連接蛋白中的一員。2000年Lamartine 等［1］已證實，編碼 Cx30 蛋白的 GJB6 基因為有汗性外胚層發(fā)育不良的致病基因。迄今為止，在有汗性外胚層發(fā)育不良（hidrotic ectodermal dysplasia，HED）患者中已發(fā)現(xiàn)該基因的5種突變，它們均為錯義突變，分別為G11R、A88V、V37E、D50N和N14S［1-5］。目前的研究雖然已識別出該病的致病基因，但對其發(fā)病機制還了解甚少。我們曾通過過表達慢病毒的方法進行細胞轉染，欲對Cx30蛋白的功能進行進一步研究，但在實驗過程中4種突變型的過表達慢病毒分別轉染HaCaT細胞后，細胞死亡現(xiàn)象均較明顯，熒光表達弱，導致后續(xù)研究不能正常進行［6］。因此，改用Ten-on基因表達系統(tǒng)再次嘗試轉染HaCaT細胞并構建為穩(wěn)定株。

材料與方法

一、實驗材料

1.實驗細胞與慢病毒：HaCaT細胞購自中國科學院基礎研究所細胞中心；陰性對照組慢病毒、Tet-on野生型及突變型（A88V）慢病毒均為本院中心實驗室保存。

2.主要試劑：胎牛血清（澳大利亞Ausbian公司），二甲基亞砜（DMSO，北京索萊寶科技有限公司），DMEM（美國Corning公司），胰酶［生工生物工程（上海）股份有限公司］，嘌呤霉素（美國Clontech公司），Trizol試劑、逆轉錄試劑盒（日本Takara公司），BCA Protein Assay Kit（美國HyClone-Pierce公司），預染的蛋白參照（上海中晶公司），ECL-PLUS/Kit（美國 Amersham公司），Cx30抗體（美國Inventrogen公司），F(xiàn)LAG抗體（美國Sigma公司），辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG以及山羊抗鼠IgG（北京中杉金橋公司），ECL+plusTMWestern印跡試劑盒（美國Amersham公司）。

二、方法

1.重組慢病毒質粒載體的鑒定：以GJB6基因野生型及野生型A88V引物為模板擴增其對應的GJB6基因的cDNA序列。再克隆到GV308質粒上，經生工生物工程（上海）股份有限公司測序分析證實其正確性。

2.HaCaT細胞的培養(yǎng)：從液氮罐中取出細胞凍存管，迅速放入37℃水浴中，并不時搖動使其盡快解凍。完全解凍后，150×g，離心3 min，75%乙醇擦拭凍存管消毒后，移至生物安全柜。吸去凍存液上清液，將細胞懸液接種至含有10%胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，輕輕晃勻后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱。24 h后更換1次培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，保持細胞良好的生長狀態(tài)。

實驗分組：感染陰性對照病毒的HaCaT細胞組（NC組）、感染野生型Tet-on慢病毒的HaCaT細胞組（WT組）、感染突變型（A88V）Tet-on慢病毒的HaCaT細胞組（MU組）。

3.Tet-on慢病毒感染HaCaT細胞：將處于對數(shù)生長期的細胞用胰酶消化，完全培養(yǎng)基制成3×104～5×104個/ml細胞懸液，接種相應的細胞數(shù)到培養(yǎng)板中進行預實驗，繼續(xù)培養(yǎng)保證感染時鋪板量達到15%～30%左右。按照預實驗結果，將完全培養(yǎng)基制成3×104～5×104個/ml細胞懸液接種至6孔板中，感染時每孔細胞融合度為20%，MOI值為20，16 h左右更換為常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

4.觀察感染后細胞狀態(tài)及感染效率并篩選細胞：細胞狀態(tài)良好，未出現(xiàn)大量死亡，感染效率達到80%左右。于感染96 h后，換用含嘌呤霉素的培養(yǎng)基篩選細胞，處理時間為120 h。待細胞融合至70%～80%時，以終濃度2.00 mg/L的嘌呤霉素進行篩選，根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細胞生長情況每3～5 d更換1次篩選培養(yǎng)基，最終以1.00 mg/L的嘌呤霉素維持。5 mg/L四環(huán)素處理48 h后送樣RT-PCR檢測和Western印跡檢測。

5.RT-PCR檢測目的基因GJB6：用Trizol法提取細胞總RNA，用分光光度儀測得A260nm/A280nm為1.8～2.1。按照試劑盒說明書，取1 μg RNA為模板逆轉錄合成cDNA，然后PCR擴增。GJB6基因引物序列上游為5′-GTGGCCTACTACAGGCACGAA-3′，下游 5′-AGCGACCCCTCTATCCGAAC-3′，擴增長度為113 bp。GAPDH為內參照，引物序列上游為5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，下游 5′-CA CCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′，擴增長度為 121 bp。

6.Western印跡檢測HaCaT細胞中Cx30與FLAG的表達：收集生長狀態(tài)良好的目的細胞，提取蛋白。以GAPDH、β肌動蛋白作為內參，每個樣品蛋白上樣量均為30 μg。采用10%分離膠進行SDSPAGE電泳，在4℃、300mA恒流條件下濕轉150 min，將蛋白轉移到PVDF膜上。用封閉液室溫封閉PVDF膜1 h，一抗4℃孵育過夜。洗膜后二抗室溫孵育2 h，次日顯影。

7.CCK8法檢測加四環(huán)素誘導GJB6基因表達后對細胞增殖的影響：將對數(shù)生長期HaCaT細胞分組：①對照組：不加四環(huán)素的NC組、WT組、MU組HaCaT細胞；②實驗組：加四環(huán)素的NC組、WT組、MU組HaCaT細胞。在96孔板中接種密度為6×103個/ml的細胞懸液，每組設3個復孔，每孔培養(yǎng)基為100 μl，同時設置空白組，即培養(yǎng)基+CCK8試劑，上述方法種4塊96孔板分別用于各個時間點的檢測。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱預培養(yǎng)24 h后，實驗組換含有5 mg/L四環(huán)素的培養(yǎng)基100 μl。培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng) 4、8、12、24、36、48 h，取出培養(yǎng)板，加入10 μl CCK8溶液。在細胞培養(yǎng)箱內繼續(xù)孵育1 h，選擇450 nm波長，在酶標儀上測定各孔吸光度（A值），實驗重復3次，取平均值。

8.采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對實驗結果進行分析，差異可信區(qū)間為95%，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。所有數(shù)據(jù)以±s表示。兩組間比較采用t檢驗。

結 果

一、PCR擴增GJB6基因的野生型和突變型A88V并克隆到載體進行測序

PCR試劑盒擴增突變型和野生型GJB6基因cDNA全長序列，PCR產物交換人線性化表達載體，將該片段克隆至GV308載體（12.4 kb）中進行轉化，挑選單克隆菌落。PCR鑒定結果，野生型與突變型A88V的陽性轉化子PCR產物大小分別是829 bp和1128bp，陰性轉化子PCR產物大小分別是363bp和377 bp，經測序，結果與已報道的GJB6基因序列一致，表明重組質粒構建成功（圖1）。

二、Tet-on過表達慢病毒轉染HaCaT細胞結果

陰性對照組慢病毒、Tet-on野生型及突變型（A88V）慢病毒分別感染HaCaT細胞后（圖2），細胞狀態(tài)良好，為多角形，呈簇集生長。感染96 h后，經嘌呤霉素處理120 h后的細胞形態(tài)未見明顯異常，生長狀態(tài)亦良好（圖3）。HaCaT細胞為有嘌呤霉素抗性的細胞，轉染較為成功。

圖1 酶切鑒定重組質粒結果 1：陰性對照（ddH20）；2：空載自連對照組；3：GAPDH；4：標準參照物：自上而下依次為5 kb、3 kb、2 kb、1.5 kb、1 kb、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp；5 ～ 12：1A 為 GJB6基因野生型1～8號重組質粒，1B為GJB6基因突變型A88V 1～8號重組質粒

圖2 Tet-on過表達慢病毒感染HaCaT細胞 細胞狀態(tài)良好，為多角形，呈簇集生長

圖3 Tet-on過表達慢病毒感染HaCaT細胞96 h、經嘌呤霉素處理120 h后的生長狀態(tài) HaCaT細胞生長良好，細胞無明顯分化、老化現(xiàn)象

三、四環(huán)素誘導后細胞狀態(tài)的變化

MU組加四環(huán)素誘導，24 h后細胞形態(tài)發(fā)生變化，48 h后大部分細胞死亡，殘存的細胞老化，細胞核固縮（圖4），而NC組與WT組細胞形態(tài)未有明顯變化，且細胞無明顯死亡。

四、RT-PCR檢測目的基因GJB6 mRNA水平

WT加四環(huán)素組GJB6基因表達豐度（113.369±6.494） 是 WT不加四環(huán)素組（1.001±0.067）的113.369倍（P＜0.05）；MU加四環(huán)素組GJB6基因表達豐度（3.249±0.273）是MU不加四環(huán)素組（1.001±0.067）的3.249倍（P＜0.05）。穩(wěn)定轉染的HaCaT細胞加四環(huán)素誘導后表達量增高，說明目的基因的表達是可調控的。

圖4 Tet-on過表達慢病毒感染HaCaT細胞經四環(huán)素誘導24、48 h后的細胞形態(tài) 24 h后的細胞形態(tài)發(fā)生變化，48 h后的細胞老化，細胞核固縮

圖5 Western印跡檢測各組蛋白的表達 經四環(huán)素處理的感染野生型Tet-on慢病毒組（WT組）和感染突變型（A88V）Tet-on慢病毒組（MU組）檢測到Cx30與FLAG目的條帶。1：感染陰性對照病毒的HaCaT細胞組（NC組）不加四環(huán)素；2：NC組加四環(huán)素；3：WT組不加四環(huán)素；4：WT組加四環(huán)素；5：MU組不加四環(huán)素；6：MU組加四環(huán)素

五、HaCaT細胞中Cx30與FLAG的檢測

將各實驗組細胞裂解并提取蛋白行Western印跡檢測，經四環(huán)素處理的WT組和MU組檢測到Cx30與FLAG目的條帶，而未經四環(huán)素處理的細胞和NC組細胞未檢測到Cx30與FLAG目的條帶（圖5）。說明穩(wěn)定株轉染成功，且表達受四環(huán)素調控。

六、加四環(huán)素誘導基因表達后對HaCaT細胞增殖的影響

各組細胞分別培養(yǎng)4、8、12、24、36、48h后測A值（表1）。結果發(fā)現(xiàn)，NC組加與不加四環(huán)素在各個時間節(jié)點的A值差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；WT組加與不加四環(huán)素在 4、8、12、24、36 h 時的A值差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；MU組加與不加四環(huán)素在各時間點差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。加入四環(huán)素后不同組別間各時段的多重比較采用單向方差分析，LSD法結果提示，加入四環(huán)素后NC組與WT組、NC組與MU組、MU組與WT組之間差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 加四環(huán)素誘導基因表達后不同時間對HaCaT細胞增殖的影響（A450值）

討 論

Tet-on基因表達系統(tǒng)是一個由Gossen和Bujard［7］建立的比較成熟的四環(huán)素正向誘導的真核生物外源基因誘導表達系統(tǒng)，具有高效、無毒、開關嚴密等優(yōu)點。當四環(huán)素的衍生物存在時，目的基因高效表達；而撤走藥物時，基因一般不被轉錄［8］。該基因表達系統(tǒng)目前被廣泛運用在基因功能研究中。Schrier等［9］使用該表達系統(tǒng)穩(wěn)定轉染了攜帶FMRP野生型和突變型的PC12細胞株，并研究了FMRP突變體的功能，為該蛋白的功能研究開辟了一個新的途徑。Tet-on基因表達系統(tǒng)的這些優(yōu)勢彌補了之前本課題組在構建傳統(tǒng)慢病毒載體過程中所遇到的基因表達和終止調控性差等問題，成功穩(wěn)定構建GJB6野生型與突變型（A88V）HaCaT細胞株。

縫隙連接蛋白（Connexin）是在細胞間通訊中起重要作用的一個蛋白質家族，它們是完整的膜蛋白，形成含水的縫隙連接通道，允許細胞間離子和小代謝分子的擴散交換，協(xié)調多細胞組織的新陳代謝活動［10］。間隙連接是介導多細胞生物相鄰細胞之間直接進行小分子物質交換的通道，其介導的信息交流在細胞增殖、分化、胚胎發(fā)育過程中起到了十分重要的作用?？p隙連接蛋白是組成間隙連接通道的亞單位。目前已發(fā)現(xiàn)許多遺傳性疾病的發(fā)生與縫隙連接蛋白的突變有關［11-13］。

有研究顯示，大鼠表皮角質形成細胞（REKs）被表達了A88V突變體后會進入細胞死亡途徑，細胞核發(fā)生固縮、碎裂，并且可引起細胞膜的破壞，從而導致細胞在突變體表達后的 24 h內死亡［14］。Essenfelder等［15］研究發(fā)現(xiàn)，A88V 突變體通過形成異常的間隙連接半通道，導致ATP外流和細胞死亡。我們曾構建過帶有綠色熒光的過表達慢病毒載體轉染HaCaT細胞，G11R和A88V突變體過表達慢病毒載體轉染細胞后，可觀察到弱的熒光；V37E突變型未觀察到熒光或僅有較弱熒光，且48 h內3種HaCaT細胞均出現(xiàn)大量死亡，細胞無法傳代［6］。以至于不能對轉染后的HaCaT細胞進行篩選，未得到穩(wěn)定表達的細胞株，無法確保實驗的同步性和統(tǒng)一性。改用Tet-on基因表達系統(tǒng)后，將攜帶GJB6基因野生型和突變型的過表達慢病毒載體轉染到HaCaT細胞，因病毒載體具有抗嘌呤霉素的特性，被成功轉染該病毒載體的HaCaT細胞也具備嘌呤霉素抗性，未被轉染的細胞沒有上述特點，故經過嘌呤霉素篩選后的HaCaT細胞即為轉染成功后穩(wěn)定表達的細胞株。然后，通過四環(huán)素的誘導使它們在同一時間點表達該基因的野生型和突變型A88V。實驗過程中觀察到，四環(huán)素誘導突變體A88V在HaCaT細胞內表達后，經過24 h細胞形態(tài)即發(fā)生變化，部分細胞出現(xiàn)漂??；48 h后貼壁細胞中部分細胞胞核固縮，細胞出現(xiàn)老化，大部分細胞漂浮。為了進一步了解GJB6基因野生型與突變型A88V經四環(huán)素誘導表達后對細胞增殖的影響，我們采用CCK8法進行檢測。實驗結果發(fā)現(xiàn)，WT組和MU組加入四環(huán)素的A值與WT組和MU組不加四環(huán)素的A值相比差異有統(tǒng)計學意義，說明四環(huán)素對感染野生型和突變型（A88V）Tet-on慢病毒的HaCaT細胞的增殖有顯著影響；加入四環(huán)素后WT組在各時間段的A值比NC組略小，MU組在各時間段的A值明顯小于NC組，且加入四環(huán)素的WT組與MU組比較后在各時間段的A值具有統(tǒng)計學差異，說明GJB6基因野生型與突變型（A88V）經四環(huán)素誘導表達后會不同程度地影響上述兩組HaCaT細胞的增殖。

本實驗成功構建了突變體A88V和野生型Tet-on慢病毒表達載體，我們將用該方法構建G11R等其他突變體的載體。通過該載體穩(wěn)定轉染HaCaT細胞株后探討野生型和多種突變型GJB6基因對角蛋白、兜甲蛋白、內披蛋白和絲聚蛋白的作用，從而為闡明GJB6基因突變體引起皮膚角化異常等表型的可能機制奠定基礎。該模型不僅有助于揭示有汗性外胚層發(fā)育不良的發(fā)病機制，還可以探討與縫隙連接蛋白基因突變相關的其他多種綜合征的發(fā)病機制，為今后的基因治療提供實驗研究依據(jù)。

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Construction of HaCaT cell lines stably expressing the human GJB6 gene by using a Tet-On lentiviral vector and their identification

Lu Yuting,Wang Zhenying,Song Yali,Ji Cancan,Zhang Li
Department of Dermatology,Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong University,Jinan 250021,China

ObjectiveTo construct HaCaT cell lines stably expressing the wild type human GJB6 gene or its mutant by using a Tet-On lentiviral vector,and to lay an experimental foundation for studies on pathogenesis of hidrotic ectodermal dysplasia.MethodsThe wild-type human GJB6 gene and its mutant（A88V）were amplified by PCR,and then inserted into the Tet-on lentivirus plasmid to construct recombinant lentivirus vectors.The recombinants were identified by gene sequencing and enzymatic digestion.Cultured HaCaT cells were classified into three groups to be transfected with a negative control lentiviral vector （NC group）,the lentivirus vector expressing the wild-type human GJB6 gene （WT group）,or the lentivirus vector expressing the mutant human GJB6 gene （MU group）.Puromycin was used to select HaCaT cell clones stably expressing the GJB6 gene which encodes the connexin 30 （Cx30）protein.The selected HaCaT cell clones were cultured with or without tetracycline for 48 hours,thereafter,real-time PCR（RT-PCR）was performed to detect GJB6 gene mRNA expression,Western-blot analysis to measure expressions of Cx30 and FLAG-tag proteins,and cell counting kit 8 （CCK8）assay to evaluate cellular proliferative activity.ResultsEnzymatic digestion and gene sequencing showed that recombinant lentivirus plasmids were successfully constructed.RT-PCR showed evidently increased mRNA expression of the GJB6 gene in stably transfected HaCaT cells.Moreover,the expression abundance of the GJB6 gene was 112.369 times higher in the WT group induced by tetracycline than in that without tetracycline treatment（P＜0.05）,and 2.249 times higher in the MU group induced by tetracycline than in that without tetracycline treatment（P＜ 0.05）.Western-blot analysis showed that Cx30 and FLAG-tag proteins were stably expressed in the WT group and MU group after induction with tetracycline,while neither of them was observed in the WT group or MU group without tetracycline treatment,or in the NC group.Significant differences were noted in cellular proliferative activity（expressed as the absorbance value at 450 nm）between the MU group with and without tetracycline treatment and between the WT group with and without tetracycline treatment at 4,8,12,24,36 and 48 hours（allP＜0.05）,but not between the NC group with and without tetracycline treatment at any of the above time points （allP＞0.05）.ConclusionHaCaT cell lines which stably express the wild-type GJB6 gene or its mutant（A88V）are successfully constructed.

Ectodermal dysplasia;Connexins;GJB6 gene;HaCaT cells;Tet-on

Zhang Li,Email:zhangliwenzhe@medmail.com.cn

張莉，Email：zhangliwenzhe@medmail.com.cn

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.04.009

國家自然科學基金（81171492）；山東省自然科學基金（ZR2011HQ056）；山東省科技發(fā)展計劃項目（2010GSF10812、2011GSF11847）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China （81171492）;Natural Science Foundation of Shandong Province of China （ZR2011HQ056）;Shandong Province Science and Technology Development Program（2010GSF10812,2011GSF11847）

2015-08-18）

（本文編輯：顏艷）