星懿展 郭海英 馬小艮 李玉紅

400038重慶，第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部細(xì)胞生物學(xué)教研室

Wnt10b誘導(dǎo)再生毛囊的表達(dá)特性研究

星懿展 郭海英 馬小艮 李玉紅

400038重慶，第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部細(xì)胞生物學(xué)教研室

目的 研究Wnt10b誘導(dǎo)再生毛囊的表達(dá)特性及誘導(dǎo)作用機(jī)制。方法 HEK-293細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增并用氯化銫梯度離心純化Wnt10b過表達(dá)腺病毒及對(duì)照腺病毒，皮內(nèi)注射至C57BL/6J小鼠背部皮膚，在處理后2.5、5、7、9、14、28 d時(shí)取材，HE染色及免疫組化染色觀察毛囊結(jié)構(gòu)特征、信號(hào)通路表達(dá)特征及增殖特性。結(jié)果HE染色發(fā)現(xiàn)，AdWnt10b處理組從第5天開始出現(xiàn)新生毛囊結(jié)構(gòu)，正常生長，第28天左右進(jìn)入退化期。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，AdWnt10b處理組從處理后5 d開始新生毛囊具有AE15表達(dá)，隨著毛囊生長而增加，至處理后28 d開始減少。在AdWnt10b處理后5 d，觀察到β連環(huán)素的核表達(dá)，Lef1特異性表達(dá)于毛芽和毛母質(zhì)部位，且全為核表達(dá)。在AdWnt10b處理后28 d，Lef1表達(dá)減弱。AdWnt10b處理后2.5 d即可見Ki67表達(dá)于表皮和毛囊外根鞘。處理后2.5、7、9、14 d均在隆突區(qū)見到Ki67的表達(dá)；從處理后7 d開始，Ki67表達(dá)于毛母質(zhì)細(xì)胞。結(jié)論Wnt10b誘導(dǎo)的再生毛囊具有正常的毛囊結(jié)構(gòu)，Wnt10b激活了經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，其作用的靶細(xì)胞是毛囊干細(xì)胞及其子代細(xì)胞。

毛囊；再生；干細(xì)胞；Wnt信號(hào)通路；Ki-67抗原；β連環(huán)素

毛囊的周期性生長受到多種信號(hào)通路的調(diào)控，包括無翅型小鼠腺癌病毒整合位點(diǎn)（wingless-type mouse mammary tumor virus integration site，Wnt）信號(hào)通路、骨形成蛋白信號(hào)通路、成纖維細(xì)胞生長因子信號(hào)通路等。Wnt蛋白家族是一系列高度保守的分泌性糖蛋白，它們通過自分泌或旁分泌形式發(fā)揮作用［1］。Ouji等［2］研究發(fā)現(xiàn)，Wnt10b 能夠促進(jìn)培養(yǎng)的觸須毛囊的生長。我們前期通過在體和離體實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)腺病毒介導(dǎo)的Wnt10b能夠誘導(dǎo)毛囊的周期性再生，Wnt10b可能通過經(jīng)典Wnt信號(hào)通路發(fā)揮這種誘導(dǎo)作用［3-4］。本文在前期研究的基礎(chǔ)上，對(duì)Wnt10b誘導(dǎo)的毛囊的表達(dá)特征進(jìn)行深入研究，以期闡明Wnt10b在毛囊周期中的作用機(jī)制，并為開發(fā)治療毛囊周期相關(guān)疾病的藥物提供理論基礎(chǔ)。

材料和方法

一、腺病毒擴(kuò)增與純化

腺病毒介導(dǎo)的Wnt10b（adenovirus-mediated Wnt10b，AdWnt10b）及腺病毒介導(dǎo)的綠色熒光蛋白（adenovirus-mediated green fluorescentprotein，AdGFP）由美國芝加哥大學(xué)何通川教授惠贈(zèng)，病毒擴(kuò)增與純化按文獻(xiàn)［5］方法進(jìn)行。

二、動(dòng)物處理與分組

36只雄性7～8周齡C57 BL/6J小鼠（雄性小鼠毛囊周期更為穩(wěn)定）購自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXK（軍）20120011，并在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心按SPF級(jí)飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)。將36只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組又隨機(jī)分為6小組，即2.5、5、7、9、14、28 d組，每小組3只。腹腔注射1%戊巴比妥100 μl麻醉小鼠；沿背部正中線，經(jīng)皮內(nèi)注射25 μl單劑量（108pfu/ml）AdWnt10b（AdWnt10b處理組）或AdGFP（AdGFP 處理組）；于處理后 2.5、5、7、9、14、28 d，分別在注射部位取材，進(jìn)行HE染色及免疫組化染色。免疫組化所用一抗及稀釋度如下：AE15（美國紐約大學(xué)孫同天教授惠贈(zèng)，1∶4），β連環(huán)素（美國Santa Cruz公司，1∶100），Ki67（美國 Santa Cruz公司，1 ∶100），淋巴增強(qiáng)因子 1（lymphoid enhancer binding factor1，Lef1）（美國 SantaCruz公司，1 ∶100）。

結(jié) 果

一、AdWnt10b誘導(dǎo)再生毛囊的結(jié)構(gòu)特征

HE染色發(fā)現(xiàn)，AdWnt10b處理組，從第5天開始出現(xiàn)新生毛囊結(jié)構(gòu)，新生毛囊正常生長，在第28天左右進(jìn)入退化期，說明再生毛囊具有毛囊周期性生長的特征。AdGFP處理組（空載體對(duì)照）在觀察期間一直處于靜止期，和周邊未注射部位沒有明顯差異。除毛囊結(jié)構(gòu)變化外，AdWnt10b處理組可見表皮增厚。見圖1。

免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，AdWnt10b誘導(dǎo)再生的毛囊具有AE15表達(dá)，這種表達(dá)從處理后5 d開始出現(xiàn)，隨著毛囊生長而增加，至處理后28 d開始減少。AdGFP處理組一直未觀察到AE15表達(dá)。見圖2。

二、Wnt10b誘導(dǎo)再生毛囊的信號(hào)通路表達(dá)特征

免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，β連環(huán)素在AdWnt10b處理組和AdGFP處理組均有表達(dá)，但AdWnt10b處理組較強(qiáng)。而且，在AdWnt10b處理后5 d，觀察到β連環(huán)素的核表達(dá)。見圖2。

AdWnt10b處理后5 d起可以觀察到Lef1特異性表達(dá)于毛芽和毛母質(zhì)部位，且全為核表達(dá)。在AdWnt10b處理后28 d，Lef1表達(dá)減弱。AdGFP處理組一直未觀察到Lef1的表達(dá)，符合靜止期的表達(dá)特征。見圖2。

圖1 HE染色觀察腺病毒介導(dǎo)的Wnt10b（AdWnt10b）和腺病毒介導(dǎo)的綠色熒光蛋白（AdGFP）誘導(dǎo)不同時(shí)間后再生毛囊的結(jié)構(gòu)（×400）1A：AdWnt10b處理的皮膚；1B：AdGFP處理的皮膚

圖2 免疫組化染色觀察腺病毒介導(dǎo)的Wnt10b（AdWnt10b）和腺病毒介導(dǎo)的綠色熒光蛋白（AdGFP）誘導(dǎo)不同時(shí)間后再生毛囊中AE15、β連環(huán)素、Lef1、Ki67的表達(dá)（×400） AE15表達(dá)于毛囊的內(nèi)根鞘部位；β連環(huán)素在AdWnt10b處理后7 d表達(dá)于毛囊的毛母質(zhì)；Lef1表達(dá)于AdWnt10b誘導(dǎo)再生毛囊的毛芽及毛母質(zhì)部位，且為核表達(dá)；Ki67表達(dá)于AdWnt10b誘導(dǎo)再生毛囊隆突區(qū)，且為核表達(dá)。虛線示毛囊結(jié)構(gòu)輪廓

三、Wnt10b誘導(dǎo)再生毛囊的增殖特性

AdWnt10b處理后2.5 d即可見Ki67表達(dá)，其表達(dá)部位包括表皮和毛囊外根鞘。其中，處理后2.5、7、9、14 d均在隆突區(qū)見到Ki67的表達(dá)，但并不是所有隆突區(qū)細(xì)胞均有Ki67表達(dá)。從處理后7 d開始，Ki67表達(dá)于毛母質(zhì)細(xì)胞。AdGFP組在2.5 d時(shí)有零散的Ki67表達(dá)，以后一直未見Ki67表達(dá)。見圖2。

討 論

關(guān)于Wnt信號(hào)通路在毛囊周期中的作用研究已有報(bào)道，DKK1是Wnt通路的抑制劑，胚胎發(fā)育時(shí)持續(xù)過表達(dá)DKK1，則不能生成毛囊，在出生后過表達(dá)DKK1則抑制毛囊生長［6］。在突變?nèi)笔ef1小鼠，不能形成觸須，且體毛數(shù)量明顯減少［7］，而在表皮過表達(dá)Lef1將導(dǎo)致異位生成毛囊［8］。新分離的真皮乳頭細(xì)胞（DP細(xì)胞）能夠誘導(dǎo)毛囊bulge細(xì)胞（毛囊干細(xì)胞）形成新的毛囊，而在培養(yǎng)后，此誘導(dǎo)功能消失，當(dāng)在培養(yǎng)基中加入Wnt時(shí)，則能夠相對(duì)保持此誘導(dǎo)活性［9］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，AdWnt10b過表達(dá)能夠誘導(dǎo)毛囊的周期性再生，同時(shí)，腺病毒介導(dǎo)的Wnt5a能夠抑制毛囊的再生［10］。本研究對(duì)AdWnt10b誘導(dǎo)再生的毛囊進(jìn)行深入研究，結(jié)果顯示，AdWnt10b誘導(dǎo)再生的毛囊有正常的毛囊結(jié)構(gòu)，且能夠正常進(jìn)入下一個(gè)毛囊周期。說明Wnt10b對(duì)于啟動(dòng)毛囊生長的作用具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

AE15是毛囊內(nèi)根鞘的特異性標(biāo)記物，在毛囊生長期中出現(xiàn)，退化期中逐漸減少，在毛囊靜止期時(shí)消失。本研究發(fā)現(xiàn)，在AdWnt10b處理后5 d開始，處理部位出現(xiàn)AE15，在處理后28 d開始，AE15表達(dá)減少，說明AdWnt10b誘導(dǎo)生長的毛囊，可能從28 d開始進(jìn)入退化期，這與正常小鼠發(fā)育不同。正常小鼠的毛囊是19 d即進(jìn)入退行期，22 d全部進(jìn)入休止期，其原因可能為我們采用了腺病毒作為表達(dá)載體，而腺病毒在體內(nèi)的作用時(shí)間可以長達(dá)1個(gè)月，只是后期作用強(qiáng)度逐漸降低。Ki67是增殖細(xì)胞的標(biāo)記物，本研究發(fā)現(xiàn)，AdWnt10b處理組毛囊隆突區(qū)的部分細(xì)胞表達(dá)Ki67，說明有部分毛囊干細(xì)胞處于增殖狀態(tài)，即這部分毛囊干細(xì)胞被AdWn10b激活。

經(jīng)典Wnt信號(hào)通路激活LEF/TCF轉(zhuǎn)錄復(fù)合物后，啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄。其靶基因有多種，在誘導(dǎo)毛囊周期性再生時(shí)，具體激活什么靶基因，還有待研究。Wnt10b是分泌性糖蛋白，經(jīng)過嚴(yán)格調(diào)控的處理加工后被細(xì)胞分泌出細(xì)胞外，在細(xì)胞外基質(zhì)中運(yùn)輸，通過自分泌或旁分泌形式發(fā)揮作用［11］。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt蛋白分泌作用的范圍可以達(dá)到周圍直徑20～30個(gè)細(xì)胞距離［12］。前期研究發(fā)現(xiàn)，在正常毛囊周期中，Wnt10b表達(dá)于生長期的毛母質(zhì)細(xì)胞，在退化期和靜止期均無特異性表達(dá)［13］。因此，臨近毛母質(zhì)的毛囊細(xì)胞及毛乳頭細(xì)胞均有可能是Wnt10b可能的靶細(xì)胞，從生物體能量節(jié)約的原則考慮，最有可能的靶細(xì)胞或許是毛母質(zhì)細(xì)胞本身和鄰近的毛乳頭細(xì)胞。本研究中，采用過表達(dá)的方式發(fā)現(xiàn)，AdWnt10b處理后，發(fā)生增殖的細(xì)胞是毛囊干細(xì)胞，而不是毛乳頭細(xì)胞，說明Wnt10b的靶細(xì)胞是毛囊干細(xì)胞，而在生長期啟動(dòng)后，毛母質(zhì)也處于增殖狀態(tài)，說明Wnt10b也作用于毛母質(zhì)細(xì)胞。因此，本研究明確了Wnt10b作用的靶細(xì)胞，即毛囊干細(xì)胞及其子代細(xì)胞。當(dāng)然，增加干擾Wnt10b的實(shí)驗(yàn)更具有說服力，將在以后進(jìn)一步研究。

總之，本研究系統(tǒng)研究了AdWnt10b誘導(dǎo)再生毛囊的結(jié)構(gòu)特征、信號(hào)通路表達(dá)特征及增殖特性，發(fā)現(xiàn)AdWnt10b所誘導(dǎo)再生毛囊具有正常的毛囊結(jié)構(gòu)及毛囊周期，為開發(fā)毛囊周期性再生障礙相關(guān)疾病的治療藥物提供依據(jù)。本研究還明確了Wnt10b作用的靶細(xì)胞是毛囊干細(xì)胞及其子代細(xì)胞，為進(jìn)一步深入研究奠定了基礎(chǔ)。

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Expression characteristics in regenerating hair follicles induced by Wnt10b

Xing Yizhan,Guo Haiying,Ma Xiaogen,Li Yuhong
Department of Cell Biology,College of Basic Medical Sciences,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China

ObjectiveTo investigate expression characteristics in regenerating hair follicles induced by Wnt10b,and to explore mechanisms underlying Wnt10b-induced regeneration of hair follicles.MethodsBoth adenovirus containing the Wnt10b gene（AdWnt10b）and that containing the green fluorescent protein-encoding gene（AdGFP）were amplified in HEK-293 cells and purified by caesium chloride density gradient centrifugation.A total of 36 C57BL/6J mice were randomly and equally divided into the AdWnt10b group and AdGFP group to be intracutaneously injected with AdWnt10b and AdGFP on the back respectively.Three mice were sacrificed on day 2.5,5,7,9,14 and 28 after the injection separately,and skin samples were resected from the injected sites subsequently.Hematoxylin and eosin（HE）staining and immunohistochemical staining were performed to observe hair follicle structure,analyze expression characteristics of the Wnt signaling pathway,and to estimate proliferative activity of regenerating hair follicles induced by Wnt10b.ResultsAs HE staining showed,new hair follicles appeared as early as day 5 after the injection,then grew normally,and entered into catagen phase on day 28 in the AdWnt10b group.Immunohistochemical staining showed that AE15 expression was observed in new hair follicles as early as day 5 after the injection in the AdWnt10b group,then increased along with the growth of hair follicles,but decreased on day 28.On day 5 after AdWnt10b injection,both βcatenin and Lef1 expressions were seen in the cell nucleus.Lef1 was expressed specifically in hair germs and hair matrix,and its expression began to decrease on day 28.In addition,Ki67 expression was observed in the epidermis and outer root sheath of hair follicles as early as day 2.5 after the injection,in the bulge region of hair follicles on day 2.5,7,9 and 14,and in hair matrix cells as early as day 7.ConclusionWnt10b could induce regeneration of hair follicles with normal structure,likely by activating the canonical Wnt signaling pathway in hair follicle stem cells and their daughter cells.

Hair follicle;Regeneration;Stem cells;Wnt signaling pathway;Ki-67 antigen;beta Catenin

Li Yuhong,Email:liyuhongtmmu@hotmail.com

李玉紅，Email：liyuhongtmmu@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.04.008

國家自然科學(xué)基金（81472895）；重慶市自然科學(xué)基金（cstc2013jcyjA10084）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81472895）;Chongqing Municipal Natural Science Foundation（cstc2013jcyjA10084）

2015-09-25）

（本文編輯：顏艷）