徐玉敏， 苗 亮， 李明云， 安 欽， 李笑萌， 穆方申， 侯紅紅， 陳 炯

(寧波大學(xué) 教育部應(yīng)用海洋生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 寧波 315211)

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香魚成熟卵母細(xì)胞過熟進(jìn)程中卵膜超微結(jié)構(gòu)變化

徐玉敏， 苗 亮， 李明云， 安 欽， 李笑萌， 穆方申， 侯紅紅， 陳 炯

(寧波大學(xué) 教育部應(yīng)用海洋生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 寧波 315211)

香魚成熟卵母細(xì)胞能較長時(shí)間維持受精能力，但隨時(shí)間延遲受精能力逐漸降低直至消失。為探索其機(jī)制，采用透射電鏡技術(shù)觀察了香魚卵母細(xì)胞過熟進(jìn)程中卵膜超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果顯示：處于濾泡內(nèi)時(shí)，成熟卵母細(xì)胞表面的放射膜(Zona radiate, ZR)分為3層，從外到內(nèi)依次是放射外膜1(ZR1)、放射膜2(ZR2)、放射膜3(ZR3)，其中ZR1最厚；放射膜外有一層膠膜(Jelly coat, JC)。排出后的成熟卵母細(xì)胞放射膜ZR1消失，僅ZR2和ZR3兩層，但放射膜外面的膠膜層依然存在，此時(shí)ZR2很薄，ZR3層次明暗分明，包含明暗相間的各5條帶并且完全不透明，在與卵膜垂直的方向上形成亮區(qū)(Light region, LR)和暗區(qū)(Dark region, DR)。隨著排卵后的時(shí)限延長，至48 h后，卵的膠膜層消失，放射膜壓縮，內(nèi)部出現(xiàn)孔道(Pore canals, PC)；60 h后膠膜層孔道數(shù)量增多，孔徑變大；至96 h時(shí)孔道變長，貫穿ZR3的1/2；至104 h時(shí)ZR2基本解體，孔道繼續(xù)伸長并貫穿ZR3，至此成熟卵母細(xì)胞徹底凋亡。

香魚；卵母細(xì)胞；過熟；卵膜；透射電鏡

AbstratThe mature oocytes of sweet fishPlecoglossusaltiveliscan maintain fertilization ability for a long time. In this study, we observed the ultrastructure′ changes ofP.altivelisoocytes during post-ovulatory process using transmission electron microscope(TEM). In follicular phase, the outer layer of oocyte memebrane is zona radiate(ZR), which includes three-layers(ZR1, ZR2 and ZR3 from outside to inside, and the thickest layer is ZR1). Outside of ZR is jelly coat(JC). After ovulation, ZR1 disappears and ZR remains two layers (ZR2 and ZR3), and JC still exisst. In this stage, ZR2 is very thin, and ZR3 includes 5 light-bands alternate with 5 dark-bands. ZR3 is completely opaque, and in the vertical of oolemma showed alternating "light region" and "dark region". At 48 h after ovulation, JC disappears, ZR is thinner and pore canals(PC) appears in ZR3. At 60 h, the number of PC increases and diameter enlarges. To 96 h, the length of PC increases to 1/2 of the ZR3. 104 h later, with the disintegration of ZR2, PC continues to elongate and pass through ZR3, and then the mature oocyte completely apoptosis.

香魚(Plecoglossusaltivelis)是原產(chǎn)于東亞地區(qū)(中國、朝鮮半島、日本)沿海通海江溪中的一種名貴一年生經(jīng)濟(jì)魚類，俗名仙胎魚、八月香、油香魚、留香魚等。香魚肉質(zhì)細(xì)嫩，清香味濃郁，色如黃金，有獨(dú)特的風(fēng)味和色澤。香魚為裸卵魚類，適當(dāng)成熟卵母細(xì)胞直接排入到腹腔中，經(jīng)生殖孔產(chǎn)出體外，附著于溪流沙礫上并在較為惡劣的環(huán)境中孵化，與其他魚類的浮性卵和沉性卵相比，香魚的卵膜較厚[1]。香魚成熟的卵母細(xì)胞過熟進(jìn)程較慢，經(jīng)歷96 h后仍能受精孵化，具有長時(shí)效的受精能力，其受精率與孵化率分別為10.83%和0.54%[2]，這種生命現(xiàn)象在魚類中并不多見，這可能與香魚的卵膜結(jié)構(gòu)與過熟進(jìn)程中的變化有一定關(guān)聯(lián)。

魚類的卵膜對(duì)卵細(xì)胞的生長、胚胎發(fā)育和繁殖具有重要作用，其卵膜超微結(jié)構(gòu)在發(fā)育過程中的變化已經(jīng)有了較多研究[3-5]。對(duì)于香魚的研究，湯先念等[6]用掃描電鏡技術(shù)觀察香魚成熟卵母細(xì)胞過熟進(jìn)程中卵膜表面結(jié)構(gòu)不斷退化、解體，與過熟進(jìn)程中的受精率逐漸降低存在相關(guān)性，但不清楚卵膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)的情況。為了進(jìn)一步了解卵母細(xì)胞過熟進(jìn)程中卵膜的超微結(jié)構(gòu)的變化，本研究在香魚成熟卵母細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu)在過熟進(jìn)程中變化研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過投射電鏡觀察卵膜內(nèi)部構(gòu)造變化，研究結(jié)果可為研究香魚卵子過熟進(jìn)程的機(jī)理完善提供基礎(chǔ)資料。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用魚為人工養(yǎng)殖的10月齡性成熟香魚，由浙江寧海鳧溪清泉香魚養(yǎng)殖專業(yè)合作社提供。挑選健康雌魚，逐尾做好標(biāo)記后暫養(yǎng)于塑料養(yǎng)殖箱中。從排卵開始取樣，對(duì)同一條雌魚進(jìn)行連續(xù)擠卵采樣，每次取樣之間時(shí)間間隔12 h，直到魚卵產(chǎn)盡。所取樣品立即液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2透射電鏡觀察

采集樣品后立刻用戊二醛進(jìn)行固定，然后用常規(guī)方法制備電鏡超薄切片[7]，用H-7650型透射電子顯微鏡(Hitch公司，日本)對(duì)超薄切片進(jìn)行觀察，對(duì)卵細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)特別是卵膜結(jié)構(gòu)拍照。

2　結(jié)果

香魚成熟卵母細(xì)胞過熟進(jìn)程中卵膜超微結(jié)構(gòu)的變化見圖版Ⅰ。卵巢內(nèi)即將排卵的卵細(xì)胞卵膜從外向內(nèi)依次有鞘膜(T)、濾泡膜(FC)、放射膜(ZR，圖版Ⅰ-1)。濾泡膜和放射膜之間為一層著色很淺、空隙較多的膠膜(JC)。放射膜由外向內(nèi)分為放射膜1(ZR1)、放射膜2(ZR2)和放射膜3(ZR3)。3層中ZR1最厚、質(zhì)地均一、不分層，并且內(nèi)有長度和直徑大小不一的孔道；ZR2最薄、電子密度最高，呈不連續(xù)的斷層；ZR3與細(xì)胞質(zhì)膜緊密相連、界限不易區(qū)分。

排出卵巢后的卵細(xì)胞(0 h)外面的膠膜層依然存在，但放射膜ZR1消失，僅ZR2和ZR3兩層；ZR2很薄，電子密度低、著色較淺；ZR3加厚、層次分明，包含明暗條帶各5條，并且明暗條紋往往在同一位置呈此薄彼厚的規(guī)律變化，從而在與卵膜垂直的方向上形成 “亮區(qū)(LR)”與“暗區(qū)(DR)”的明暗相間排列(圖版Ⅰ-2)。排卵后12 h，卵細(xì)胞卵殼膜仍分為膠膜層和放射膜兩層；ZR3靠近細(xì)胞質(zhì)的一側(cè)結(jié)構(gòu)變得較寬、排列松散，而靠近ZR2的一側(cè)則被壓縮，并在“亮區(qū)”中出現(xiàn)零星的透明孔道(PC)；ZR2無明顯變化，膠膜層開始退化、變的稀疏(圖版Ⅰ-3)。排卵后24 h(圖版Ⅰ-4)，卵細(xì)胞卵膜的膠膜層已不具備完整的膜結(jié)構(gòu)，不連續(xù)地貼在ZR2外側(cè)；ZR2電子密度降低、著色變淺；ZR3的條紋層次增多且開始?jí)嚎s，“亮區(qū)”的寬度增大；另外，在ZR2的外側(cè)相對(duì)于ZR3“暗區(qū)”的位置上出現(xiàn)了顆粒狀的放射帶突起(PZR)。

香魚卵細(xì)胞排出后36 h，膠膜層僅剩零星殘留；ZR2著色更淺，與膠膜層顏色基本相同，并在“亮區(qū)”位置有顆粒狀突起；ZR3從內(nèi)到外都有明顯的壓縮痕跡，亮紋和暗紋界限分明，“亮區(qū)”和“暗區(qū)”對(duì)比清晰(圖版Ⅰ-5)。48 h時(shí)，膠膜層消失，ZR2著色更淺，在“暗區(qū)”位置仍有放射帶突起(PZR)； ZR3的“暗區(qū)”中透明孔道數(shù)量增多、孔徑擴(kuò)大(圖版Ⅰ-6)。60 h時(shí)，ZR3中的條紋從內(nèi)到外結(jié)構(gòu)緊密，透明孔道數(shù)量增多且孔徑大小一致；ZR2上的顆粒狀突起增大，邊緣模糊，分散成細(xì)小的顆粒狀(圖版Ⅰ-7)。72 h時(shí)，卵細(xì)胞膜的ZR3外側(cè)被壓縮，內(nèi)側(cè)則較為松散，其中的透明孔道縱向延長，相互連接；ZR2內(nèi)部出現(xiàn)空泡(圖版Ⅰ-8)。

香魚卵細(xì)胞排出后84 h，ZR3中透明孔道增多、增大，呈長矩形；ZR2外層結(jié)構(gòu)模糊，呈細(xì)小顆粒狀分布(圖版Ⅰ-9)。96 h時(shí)卵細(xì)胞ZR2厚度減小、電子密度降低，邊緣呈顆粒狀；ZR3結(jié)構(gòu)松散，層次模糊，其中的透明孔道的長度超過ZR3厚度的一半以上，貫穿多達(dá)6層暗條紋(整個(gè)ZR3有暗紋10層，圖版Ⅰ-10)。至104 h時(shí)孔道逐漸延伸至ZR3和ZR2的交界處，并形成開口，卵細(xì)胞完全凋亡(圖版Ⅰ-11)。

圖版Ⅰ香魚卵細(xì)胞膜超微結(jié)構(gòu)的透射電鏡觀察PlateⅠ Membrane configuration of ayu oocyte obserwed by Transmission electron microscope (TEM)

1：排卵前 (×15 000)；2:排卵后0 h(×25 000)；3:排卵后12 h(×25 000)；4:排卵后24 h(×25 000)；5:排卵后36 h(×15 000)；6:排卵后48 h(×15 000)；7:排卵后60 h(×12 000)；8:排卵后72 h(×20 000)；9:排卵后84 h(×15 000)；10:排卵后96 h(×20 000)；11:排卵后104 h(×12 000)。DR：暗區(qū)；DS：暗帶；LR：亮區(qū)；LS：亮帶；MV：卵細(xì)胞微絨毛；PC：放射帶孔道；PF：濾泡層突起；PZR：放射帶突起；ZR1：放射帶1；ZR2：放射帶2；ZR3：放射帶3

3　討論

魏剛等[8]對(duì)鯰魚以及其他硬骨魚[9]的研究中發(fā)現(xiàn)，鯰魚卵母細(xì)胞放射膜從外到內(nèi)分為ZR1、ZR2、ZR3 3層，ZR1與濾泡細(xì)胞相連；ZR2較薄，電子染色深，由不定型物質(zhì)組成；ZR3最里面，在卵細(xì)胞成熟過程中大幅增厚，且在卵細(xì)胞成熟(即排卵)后，ZR1消失。香魚的卵母細(xì)胞在成熟前后同樣出現(xiàn)這種現(xiàn)象，卵細(xì)胞在排卵前后，放射膜的組成發(fā)生了變化，卵巢中的成熟卵細(xì)胞在排卵前由3層結(jié)構(gòu)組成，從外到內(nèi)依次是ZR1、ZR2、ZR3，初期ZR1的厚度占整個(gè)放射膜的大部分，但到最終排卵時(shí)，ZR1消失；ZR2電子密度顯著增大，厚度也有所增加；ZR3的厚度明顯增厚，由原來的0.2～0.5μm增厚到5μm。香魚卵細(xì)胞放射膜包含3層結(jié)構(gòu)，國外很多研究都有相似的結(jié)果[10-14]。

Anderson[13]的研究發(fā)現(xiàn)海馬和尖嘴魚的放射膜ZR3在卵細(xì)胞成熟過程中厚度和密度都有增加，最后變成完全閉塞的結(jié)構(gòu)，且呈現(xiàn)明暗相交的分層現(xiàn)象。香魚卵細(xì)胞放射膜中也分布有中空的孔道，卵母細(xì)胞伸出的微絨毛(Microvilli from the oocyte, MV)和濾泡細(xì)胞突起(Protrusions of follicular cells, PF)在這些孔道中延伸，放射膜的超微結(jié)構(gòu)也有變化。卵細(xì)胞ZR3從含有很多微孔孔道的網(wǎng)狀變成了完全密實(shí)不透明的膜結(jié)構(gòu)，而且ZR3結(jié)構(gòu)同樣呈現(xiàn)出明暗相交的片層狀，在結(jié)構(gòu)變化上與上述現(xiàn)象相同。Dumont[15]認(rèn)為壓縮的絲狀放射膜具有阻止卵細(xì)胞在低水位環(huán)境里失水的作用，這對(duì)于產(chǎn)黏性卵和沉性卵魚類的胚胎孵化具有重要意義。香魚卵細(xì)胞膜的ZR3從網(wǎng)格狀到一體閉合型的改變或許可以使卵細(xì)胞在一定程度上成為一個(gè)相對(duì)獨(dú)立于外界環(huán)境的封閉整體，根據(jù)Niksirat[16]對(duì)鰲蝦的研究也發(fā)現(xiàn)了卵的封閉結(jié)構(gòu)，推測(cè)這種狀態(tài)能夠通過其他路徑限制或者減弱了卵細(xì)胞內(nèi)的代謝活動(dòng)以及與外界環(huán)境的物質(zhì)能量交換，從而可以促進(jìn)香魚卵細(xì)胞在排出卵巢后保持較長時(shí)間的受精能力和較高的孵化率。

關(guān)于卵細(xì)胞排出卵巢后的結(jié)構(gòu)變化未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)香魚成熟的卵細(xì)胞排出卵巢后，過熟進(jìn)程啟動(dòng)，在放射膜的外面包裹著一層膠膜至 48 h后消失，使卵子質(zhì)量急劇下降。ZR2是放射膜的外層結(jié)構(gòu)，在過熟過程中ZR2的電子密度逐漸降低，在“亮區(qū)”所對(duì)應(yīng)的位置，ZR2出現(xiàn)了顆粒狀的突起，這些突起的內(nèi)部在72 h出現(xiàn)空泡，其外層的膠膜消失后，從第48小時(shí)起，ZR2的外緣開始變得模糊，并最終消失，致使胞外物質(zhì)可滲入胞內(nèi)。ZR3是由數(shù)層明暗相間的條紋狀物質(zhì)組成，其層次和密度變化無規(guī)律，在卵子保存的前36 h，ZR3條紋層數(shù)由開始的5層增加到9層；前60 h內(nèi)，ZR3結(jié)構(gòu)從內(nèi)而外逐步壓縮，但從72 h起，ZR3的內(nèi)層又開始變松。由于壓縮程度不同，組成ZR3的這些條紋相互之間厚度不一，同一條紋對(duì)應(yīng)在卵膜不同的位置厚薄也有差異，且呈現(xiàn)規(guī)律性的變化，從而形成了結(jié)構(gòu)鮮明的“亮區(qū)”和“暗區(qū)”。在“亮區(qū)”所在區(qū)域，從48 h開始出現(xiàn)透明的孔道，這些孔道長度逐漸增大，最后形成貫穿ZR3的孔道，隨著ZR2的最終消失，這些孔道出現(xiàn)在卵細(xì)胞表面。推測(cè)外層膠膜的消失，放射膜組成和致密性的改變，膜內(nèi)透明孔道的形成，以及擴(kuò)大可能會(huì)對(duì)卵細(xì)胞跟外界環(huán)境的物質(zhì)交流產(chǎn)生影響，從而使得卵細(xì)胞的質(zhì)量下降。至于為什么ZR1和ZR2分別在卵細(xì)胞的成熟和過熟過程中消失，有待于今后進(jìn)一步研究。

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Changes of egg envelope of sweet fish Plecoglossus altivelis during post-ovulatory ageing

XU Yu-min, MIAO Liang, LI Ming-yun, AN Qin, LI Xiao-meng,MU Fang-shen, HOU Hong-hong, CHEN Jiong

(Applied Marine Biotechnology Key Laboratory of the Ministry of Education, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

Plecoglossusaltivelis; maturatonal oocyte; post-ovulatory ageing; egg envelope; TEM

2015-12-04；

2016-01-06

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41406154)；浙江省“十二五”水產(chǎn)育種專項(xiàng)(2012C12907-9)；長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(IRT0734號(hào))；浙江省“水產(chǎn)”重中之重學(xué)科開放基金項(xiàng)目(xkzsc1514)；浙江省教育廳(理)/科研計(jì)劃項(xiàng)目(Y201430860)；寧波市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015A610271)

徐玉敏，碩士研究生，研究方向?yàn)轸~類遺傳育種與增養(yǎng)殖，E-mail: xuyumin90@163.com

李明云，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)轸~類增養(yǎng)殖、遺傳育種和種質(zhì)資源保護(hù)，E-mail: limingyun@nbu.edu.cn

Q954;S917.4

A

2095-1736(2016)05-0005-03

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.05.005