血清microRNA-17-5p在膽管癌患者中的表達(dá)及其臨床意義

郭婧瀾，譚蓓蓓，葉婷

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院1.檢驗(yàn)科，2.核醫(yī)學(xué)科，四川 瀘州 646000）

血清microRNA-17-5p在膽管癌患者中的表達(dá)及其臨床意義

郭婧瀾1，譚蓓蓓2，葉婷1

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院1.檢驗(yàn)科，2.核醫(yī)學(xué)科，四川 瀘州 646000）

目的探討循環(huán)microR NA-17-5p（miR-17-5p）在膽管癌患者血清中的表達(dá)，以及在膽管癌診斷和預(yù)后方面的價(jià)值。方法利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qR T-PCR）檢測(cè)79例膽管癌患者及健康對(duì)照血清標(biāo)本中miR-17-5p的表達(dá)，并利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析循環(huán)miR-17-5p在膽管癌中的診斷和預(yù)后價(jià)值。結(jié)果qR T-PCR發(fā)現(xiàn)，循環(huán)miR-17-5p在膽管癌患者血清中的表達(dá)高于健康對(duì)照組；受試者工作特征曲線顯示，循環(huán)miR-17-5p為膽管癌有效的診斷分子靶點(diǎn)；χ2檢驗(yàn)結(jié)果表明，循環(huán)miR-17-5p與膽管癌患者的TNM分期呈正相關(guān)；卡普蘭-邁耶生存曲線顯示，循環(huán)miR-17-5p的表達(dá)水平與膽管癌患者術(shù)后5年總體生存率、無(wú)進(jìn)展生存率呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論循環(huán)miR-17-5p在膽管癌患者血清中表達(dá)水平顯著增高，是膽管癌早期診斷和判斷預(yù)后的潛在分子指標(biāo)。

循環(huán)miR-17-5p；診斷；預(yù)后；膽管癌

膽管癌是起源于膽道內(nèi)皮的惡性腫瘤，易發(fā)生早期淋巴轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。膽管癌的發(fā)病率近年來(lái)呈逐年上升趨勢(shì)，且其發(fā)病機(jī)制和易感因素尚未完全清楚[1]。根治性手術(shù)是目前唯一可能治愈膽管癌的治療方法[2]。由于膽管癌缺少早期癥狀，當(dāng)?shù)湫团R床表現(xiàn)出現(xiàn)時(shí)，多數(shù)患者已處于進(jìn)展期，而無(wú)法進(jìn)行根治性手術(shù)[3-4]。另外，由于缺少高度敏感性和特異性的膽管癌早期診斷指標(biāo)，膽管癌患者預(yù)后極差，通常只有幾個(gè)月，多數(shù)因腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移而死亡[5]。在臨床上通常使用糖類(lèi)抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）作為膽管癌診斷和判斷預(yù)后的分子指標(biāo)，但其敏感性和特異性均達(dá)不到理想水平，因此迫切需要尋找新的膽管癌早期診斷和判斷預(yù)后的分子指標(biāo)。

microRNA（miRNA）是一類(lèi)廣泛存在于真核生物體內(nèi)的內(nèi)源性的非編碼小分子RNA[6]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在包括膽管癌在內(nèi)的大多數(shù)腫瘤中異常表達(dá)，可作為癌基因或抑癌基因發(fā)揮重要的作用，提示miRNA在腫瘤的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用上具有廣闊前景[7-8]。更為重要的是，腫瘤患者血清和血漿中miRNA表達(dá)譜的相關(guān)研究證實(shí)，循環(huán)miRNA可以穩(wěn)定地被檢測(cè)并提示腫瘤狀態(tài)，是非常具有前景的腫瘤早期診斷和判斷預(yù)后的分子指標(biāo)[9-10]。然而，目前關(guān)于膽管癌患者血清中的循環(huán)miRNA的表達(dá)和臨床價(jià)值方面的研究尚不足。本研究中，筆者檢測(cè)循環(huán)miR-17-5p在79例膽管癌患者血清中的表達(dá)，并進(jìn)一步分析其在早期診斷和判斷預(yù)后方面的臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1一般資料

1.1.1研究對(duì)象選取2010年12月-2014年6月于西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院就診的膽管癌患者79例，以及同期健康對(duì)照患者79例，共158例。其中，行根治性手術(shù)治療73例，姑息性手術(shù)治療6例。所有入選患者的臨床病理資料完整。納入標(biāo)準(zhǔn)：①膽管癌患者經(jīng)病理組織學(xué)確診為膽管癌，且均為初診、初治患者；②患者入組前未接受放、化療；③入組患者無(wú)明顯肝、腎功能異常；④未合并其他器官腫瘤或嚴(yán)重內(nèi)科疾病。入組患者術(shù)前術(shù)后空腹采血各5ml，于真空干燥管中保存，1 500 r/min離心10 min后置入-80℃冰箱冷凍中保存待測(cè)。本研究經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入選的膽管癌患者同意使用其血清標(biāo)本用于科學(xué)研究，并簽署知情同意書(shū)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑和儀器miR-17-5p和內(nèi)參U6引物購(gòu)自北京TIANGEN科技有限公司，miRcute miRNA提取分離試劑盒購(gòu)自北京TIANGEN科技有限公司，miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)自北京TIANGEN科技有限公司，SYBR Fast qPCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司。主要儀器：美國(guó)Bio-Rad CFX96熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀，中國(guó)海爾公司-80℃冰箱，中國(guó)海爾公司-20℃冰箱，德國(guó)Eppendorf公司臺(tái)式低溫高速離心機(jī)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1循環(huán)miR-17-5p的提取及逆轉(zhuǎn)錄循環(huán)miR-17-5p提取方法參照北京TIANGEN科技有限公司的miRcute miRNA提取分離試劑盒所述步驟。紫外分光儀檢測(cè)RNA濃度及純度。逆轉(zhuǎn)錄步驟參照北京TIANGEN科技有限公司miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒所述步驟，每個(gè)逆轉(zhuǎn)錄體系中含有10 ng RNA模板。逆轉(zhuǎn)錄條件為：16℃變性30min，42℃退火30min，85℃延伸5min。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-timepolymerasechainreaction，qR T-PCR）qRT-PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性12s，60℃退火35s，共循環(huán)40次。采用的相對(duì)定量法計(jì)算循環(huán)miR-17-5p的相對(duì)表達(dá)量，相對(duì)表達(dá)量=2-Δct，Δct=ctmiR-17-5p-ctU6，ct為每個(gè)反應(yīng)管熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

1.2.3血清CA19-9含量檢測(cè)使用瑞士羅氏公司的Cobas e 601電化學(xué)發(fā)光分析儀及配套CA19-9檢測(cè)試劑盒，對(duì)膽管癌患者血清CA19-9進(jìn)行檢測(cè)，參考值為0～34u/ml。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，膽管癌患者與健康對(duì)照、膽管癌患者術(shù)前與術(shù)后循環(huán)miR-17-5p表達(dá)差異比較用t檢驗(yàn)，循環(huán)miR-17-5p表達(dá)與膽管癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系用χ2檢驗(yàn)，循環(huán)miR-17-5p的診斷價(jià)值用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC），Kaplan-Meier法繪制生存曲線，各組間生存差異比較用Log-rankχ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1膽管癌患者血清循環(huán)miR-17-5p的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示，循環(huán)miR-17-5p在79例膽管癌患者血清中的相對(duì)表達(dá)量為（21.971± 13.134），79例健康對(duì)照組血清中miR-17-5p的相對(duì)表達(dá)量為（0.873±0.782），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.763，P=0.000）。miR-17-5p在膽管癌患者血清中相對(duì)表達(dá)量高于健康對(duì)照組。見(jiàn)圖1。

圖1　膽管癌患者血清miR-17-5p的表達(dá)水平

2.2膽管癌患者手術(shù)前后血清循環(huán)miR-17-5p的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示，在73例行根治性手術(shù)治療的膽管癌患者中，術(shù)前miR-17-5p的相對(duì)表達(dá)量為（20.641±12.232），術(shù)后miR-17-5p的相對(duì)表達(dá)量為（4.516±4.458），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 10.583，P=0.007），術(shù)后循環(huán)miR-17-5p的表達(dá)較術(shù)前降低。而在6例行姑息性手術(shù)治療的膽管癌患者中，術(shù)前miR-17-5p的相對(duì)表達(dá)量為（28.572±21.603），術(shù)后miR-17-5p的相對(duì)表達(dá)量為（20.167±9.087），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.879，P=0.403），手術(shù)前后血清循環(huán)miR-17-5p的表達(dá)水平無(wú)明顯改變。見(jiàn)圖2。

圖2　膽管癌患者手術(shù)前后血清miR-17-5p的表達(dá)變化

2.3循環(huán)miR-17-5p表達(dá)水平對(duì)膽管癌的診斷效率

根據(jù)79例膽管癌患者術(shù)前循環(huán)miR-17-5p和CA19-9的表達(dá)水平繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，miR-17-5P的ROC曲線下面積為0.855[95%置信區(qū)間（Confidenceinterval，CI）：0.795，0.915]，敏感性為81.051%，特異性為75.947%，對(duì)應(yīng)診斷界值7.27，CA19-9的ROC曲線下面積為0.814（95%CI：0.747，0.880），敏感性為75.941%，特異性為71.931%。提示在膽管癌中循環(huán)miR-17-5p有較高的診斷價(jià)值。見(jiàn)圖3。

圖3　循環(huán)miR-17-5p和CA19-9對(duì)膽管癌的診斷價(jià)值

2.4循環(huán)miR-17-5p的表達(dá)與膽管癌患者臨床病理特征的關(guān)系

miR-17-5p高表達(dá)的TNMⅠ、Ⅱ期膽管癌患者14例，miR-17-5p高表達(dá)的TNMⅢ、Ⅳ期膽管癌患者28例；miR-17-5p低表達(dá)的TNMⅠ、Ⅱ期膽管癌患者26例，miR-17-5p低表達(dá)的TNMⅢ、Ⅳ期膽管癌患者11例，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，循環(huán)miR-17-5p的表達(dá)上調(diào)與膽管癌患者的TNM分期相關(guān)，隨著膽管癌TNM分期進(jìn)展，循環(huán)miR-17-5p的表達(dá)亦逐漸升高。而循環(huán)miR-17-5p的表達(dá)與患者的年齡、性別、細(xì)胞核分化程度等臨床病理特征無(wú)關(guān)。見(jiàn)附表。

2.5循環(huán)miR-17-5p與膽管癌患者術(shù)后5年生存率的關(guān)系

根據(jù)73例行根治性切除術(shù)的膽管癌患者術(shù)前循環(huán)miR-17-5p表達(dá)水平，將膽管癌患者分為循環(huán)miR-17-5p高表達(dá)組和循環(huán)miR-17-5p低表達(dá)組?？ㄆ仗m-邁耶生存曲線顯示，循環(huán)miR-17-5p高表達(dá)組的膽管癌患者的術(shù)后5年總體生存率和無(wú)進(jìn)展生存率均低于循環(huán)miR-17-5p低表達(dá)組（總體生存率log-rank test：P=0.012，無(wú)進(jìn)展生存率log-rank test：P=0.023）。見(jiàn)圖4。

附表　臨床病理因素與膽管癌患者循環(huán)miR-17-5p表達(dá)水平的關(guān)系例

圖4　循環(huán)miR-17-5p與膽管癌患者術(shù)后5年生存率的關(guān)系

3 討論

既往文獻(xiàn)顯示，循環(huán)血液中的miR-17-5p可作為多種腫瘤的診斷和判斷預(yù)后指標(biāo)，包括肺癌、胃癌、胰腺癌和肝癌等[11-15]。筆者發(fā)現(xiàn)，膽管癌患者血清循環(huán)miR-17-5p為膽管癌早期診斷和判斷預(yù)后的重要指標(biāo)。本研究中，筆者檢測(cè)循環(huán)miR-17-5p在膽管癌和健康對(duì)照血清中的表達(dá)水平，研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)miR-17-5p在膽管癌患者血清中表達(dá)較健康對(duì)照升高。而后筆者利用ROC曲線評(píng)估循環(huán)miR-17-5p作為膽管癌診斷指標(biāo)的可行性，結(jié)果顯示，根據(jù)膽管癌患者血清中循環(huán)miR-17-5p的表達(dá)水平可有效地區(qū)分出膽管癌患者，是膽管癌有效的診斷指標(biāo)。另外，研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)miR-17-5p與膽管癌患者TNM分期及術(shù)后5年總體和無(wú)進(jìn)展生存率密切相關(guān)，結(jié)果顯示，循環(huán)miR-17-5p的水平隨著TNM分期升高而相應(yīng)升高，循環(huán)miR-17-5p高表達(dá)的膽管癌患者術(shù)后5年總體生存率和無(wú)進(jìn)展生存率均低于循環(huán)miR-17-5p低表達(dá)組，提示在膽管癌中，miR-17-5p可能起到癌基因的作用。

miR-17-5p是miR-17-92家族成員，在多種腫瘤中發(fā)揮癌基因的作用。miR-17-5p在多種腫瘤中表達(dá)異常升高，包括結(jié)腸癌、胃癌、肝細(xì)胞癌、和腦膠質(zhì)瘤等[16-19]。另外，研究發(fā)現(xiàn)miR-17-5p在乳腺癌、肺癌及結(jié)腸癌中可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和分化[20-22]。更為重要的是研究發(fā)現(xiàn)，miR-17-5p可抑制p21、BIM、AIB1和E2F1等抑癌基因的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和分化[20，23-24]。在膽管癌的發(fā)生、發(fā)展中，miR-17-5p同樣發(fā)揮著重要作用。研究顯示，過(guò)表達(dá)miR-17-5p可上調(diào)YES1的表達(dá)，而進(jìn)一步促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的增殖并抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[25]。筆者認(rèn)為，miR-17-5p在膽管癌的發(fā)生、發(fā)展中同樣起到癌基因的作用。

綜上所述，筆者的研究證實(shí)，膽管癌患者血清中miR-17-5p表達(dá)高于健康對(duì)照組；血清中miR-17-5p膽管癌早期診斷為有效的分子指標(biāo)；膽管癌患者循環(huán)miR-17-5p的水平與膽管癌的TNM分期分呈正相關(guān)，而與年齡、腫瘤類(lèi)型及分化程度等臨床病理特征無(wú)關(guān)；血清中miR-17-5p高表達(dá)的膽管癌患者5年總體生存率和無(wú)進(jìn)展生存率均低于循環(huán)miR-17-5p低表達(dá)組。本研究揭示循環(huán)miR-17-5p在膽管癌中的臨床價(jià)值，為膽管癌的早期診斷及預(yù)后判斷提供潛在分子靶點(diǎn)。

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（童穎丹編輯）

Expression of circulating miR-17-5p in cholangiocarcinoma patients and its clinical significance

Jing-lan Guo1，Bei-bei Tan2，Ting Ye1
（1.Clinical Laboratory；2.Department of Nuclear Medicine，the Affiliated Hospital of Southwest Medical University，Luzhou，Sichuan 646000，China）

Objective To explore the expression of circulating miR-17-5p in the patients with cholangiocarcinoma and its clinical significance.Methods Expression of circulating miR-17-5p was analyzed by qRTPCR in 79 patients with cholangiocarcinoma.Statistical analysis was conducted to analyze the diagnostic and prognostic value of circulating miR-17-5p in cholangiocarcinoma.Results qRT-PCR revealed that the circulating miR-17-5p was significantly up-regulated in the serum of the patients with cholangiocarcinoma compared to the normal controls.ROC curves revealed that circulating miR-17-5p was a promising diagnostic biomarker for patients with cholangiocarcinoma.Chi-square test revealed that circulating miR-17-5p was positively associated with clinical stage of the patients with cholangiocarcinoma.Kaplan-Meier curves revealed that the cholangiocarcinoma patients with high circulating miR-17-5p expression had poorer outcome compared to the patients with low circulating miR-17-5p expression.Conclusions Circulating miR-17-5p expression is up-regulated in serum of patients with cholangiocarcinoma，and is a promising diagnostic and prognostic biomarker for patients with cholangiocarcinoma.

circulating miR-17-5p；diagnosis；prognosis；cholangiocarcinoma

R 735

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.19.009

1005-8982（2016）19-0042-05

2016-07-06