韓　旭，?！∮瘢殴?，曹振木

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737)

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甜椒根系分泌物化學(xué)成分鑒定

韓旭，牛玉，杜公福，曹振木

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737)

【目的】 鑒定甜椒根系分泌物的化學(xué)成分，為研究其化感作用及連作障礙機(jī)理提供理論依據(jù)?！痉椒ā?采用砂培法收集甜椒根系分泌物，柱層析法分離，依次選用石油醚、乙酸乙酯、氯仿和甲醇洗脫并收集各洗脫組分，采用氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)鑒定各組分的化學(xué)成分?！窘Y(jié)果】 甜椒根系分泌物石油醚組分GC-MS鑒定圖譜共出現(xiàn)50個(gè)物質(zhì)峰，相似度≥85%的化學(xué)物質(zhì)共19個(gè)；乙酸乙酯組分GC-MS鑒定圖譜共出現(xiàn)56個(gè)物質(zhì)峰，相似度≥85%的化學(xué)物質(zhì)共26個(gè)；氯仿組分GC-MS鑒定圖譜共出現(xiàn)59個(gè)物質(zhì)峰，相似度≥85%的化學(xué)物質(zhì)共25個(gè)；甲醇組分GC-MS鑒定圖譜共出現(xiàn)59個(gè)物質(zhì)峰，相似度≥85%的化學(xué)物質(zhì)共33個(gè)?！窘Y(jié)論】 甜椒根系分泌物中主要含有烷烴類、酯類、醇類、酚類、醛類、肟類、菲類、酰胺類和萘胺類化合物。

甜椒；根系分泌物；化學(xué)成分；砂培法

在特定環(huán)境下，植物通過(guò)根系的不同部位向根際土壤中釋放不同的有機(jī)化合物，這些化合物被稱為根系分泌物，該體系具有復(fù)雜性和非均一性[1]。根系分泌物通常包括3類有機(jī)化合物，分別為大分子化合物(糖、蛋白質(zhì)、酶和凝膠等)、小分子化合物(酸、酚、酮等)和其他化合物(生長(zhǎng)激素、黃酮、甾類等)，種類高達(dá)200種以上[2]。植物根系分泌物對(duì)植物、土壤、環(huán)境等均起著重要的作用，例如可以改變土壤結(jié)構(gòu)及組成、活化土壤養(yǎng)分、參與植物養(yǎng)分的吸收、緩解環(huán)境脅迫等[3-5]，因此根系分泌物的相關(guān)研究越來(lái)越引起科學(xué)研究者的關(guān)注。植物根系分泌物的常規(guī)收集方法之一是砂培法，利用石英砂惰性強(qiáng)的特性，選其為砂培法中的栽培基質(zhì)，既不會(huì)影響植物的正常生長(zhǎng)，又具有機(jī)械阻力，在消除土壤微生物干擾的同時(shí)又使植物根系的生長(zhǎng)更接近土壤環(huán)境[6]。氣相質(zhì)譜聯(lián)用的鑒定方法具有需樣量小、靈敏度高、數(shù)據(jù)庫(kù)健全等特點(diǎn)，因此通常被用來(lái)鑒定植物根系分泌物的化學(xué)成分組成。

甜椒(CapsicumfructescensL.)是茄科辣椒屬辣椒的一個(gè)變種，又稱柿子椒、燈籠椒，廣泛種植于我國(guó)南北各地，營(yíng)養(yǎng)豐富，特別是Vc含量位居各類蔬菜之首，深受廣大消費(fèi)者喜愛[7-8]。但栽培管理制度不健全和生產(chǎn)環(huán)境局限性等因素導(dǎo)致甜椒連作障礙日益加劇，嚴(yán)重影響甜椒的品質(zhì)和產(chǎn)量，根系分泌物自毒物質(zhì)的逐年累積是導(dǎo)致連作障礙的重要因素。植物根系分泌物的化學(xué)成分與連作障礙關(guān)系密切[9]，已有研究表明，大豆[10]、花生[11]、黃瓜[12]、人參[13]等植物根系分泌物中的化學(xué)成分是導(dǎo)致其連作障礙的主要原因。因此，本研究通過(guò)砂培法收集甜椒的根系分泌物，采用硅膠柱層析法分離后用GC-MS鑒定根系分泌物的化學(xué)成分，為深入研究甜椒根系分泌物的自毒物質(zhì)和自毒作用提供理論基礎(chǔ)，為制定削減甜椒連作障礙的有效措施提供技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試甜椒品種為熱甜5號(hào)，由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所瓜菜研究室提供。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1甜椒根系分泌物的收集砂培法收集根系分泌物：石英砂高溫高壓滅菌，70 ℃烘干備用。將催芽后的熱甜5號(hào)種子播于含有石英砂的培養(yǎng)箱中，每7 d澆1次Holand營(yíng)養(yǎng)液，其余時(shí)間補(bǔ)足蒸餾水，按苗期正常管理。生長(zhǎng)40 d后向培養(yǎng)箱中注入過(guò)量蒸餾水，拔掉甜椒苗，拭干并稱根質(zhì)量，浸泡石英砂后通過(guò)雙層定性濾紙過(guò)濾，并用0.45 μm的水系微孔濾膜抽濾，即得到根系分泌物的粗提物，將其減壓濃縮到 30.0 g/L即得到甜椒根系分泌物粗提物原液。

1.2.2甜椒根系分泌物化學(xué)成分的分離將50 mL甜椒根系分泌物粗提物原液與5 g 硅膠(BDH 0.048～0.075 mm)混勻，40 ℃水浴蒸干，作為提取物。用石油醚(60～90 ℃)和100 g 硅膠(BDH 0.048～0.075 mm)填充色譜柱(200 mm×30 mm)，靜置過(guò)夜。將提取物置于色譜柱頂端，根據(jù)有機(jī)溶劑極性從小到大的順序，分別用500 mL石油醚、乙酸乙酯、氯仿和甲醇逐級(jí)洗脫，過(guò)硅膠柱時(shí)收集洗脫液的流速控制在1～2 s 1滴。分別收集各洗脫液，40 ℃減壓濃縮至干，并溶于10 mL甲醇(色譜純)，-20 ℃冰箱保存?zhèn)錅y(cè)。

1.2.3甜椒根系分泌物化學(xué)成分的鑒定采用氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀(ThermoFisher GC-MS，Trace GC ultra-DSQ-AI3000,USA)鑒定甜椒根系分泌物的化學(xué)成分。GC-MS 分析色譜條件：毛細(xì)管柱 DB5-MS (30 m×0.25 mm, 膜厚度0.25 μm)；載氣 He(流速1.0 mL/min)；進(jìn)樣口溫度 250 ℃；程序升溫：柱溫 50 ℃ (保持 2 min)，以 6 ℃/min 程序升溫至 250 ℃(保持 15 min)。GC-MS分析質(zhì)譜條件：離子源溫度 200 ℃；EI 源(電子轟擊源)；轟擊電壓 70 eV；掃描范圍 m/z 30～600 amu；1 μL進(jìn)樣，不分流。

化學(xué)成分的篩選：根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選的結(jié)果，選擇相似度≥85%的化合物作為熱甜5號(hào)根系分泌物的有效化學(xué)成分。

2　結(jié)果與分析

2.1甜椒根系分泌物石油醚組分的GC-MS鑒定

熱甜5號(hào)根系分泌物的石油醚組分GC-MS鑒定結(jié)果如圖1所示。圖1顯示，共出現(xiàn)50個(gè)物質(zhì)峰，第一個(gè)出峰時(shí)間為6.589 min，最后一個(gè)出峰時(shí)間為40.583 min，主要出峰時(shí)間集中在27～40 min，最大峰面積出現(xiàn)在30.272 min。

如表1所示，熱甜5號(hào)根系分泌物石油醚組分中相似度≥85%的化合物共有19個(gè)，其中烷烴類化合物2個(gè)，酯類化合物11個(gè)，醇類化合物3個(gè)，酚類化合物1個(gè)，萘胺類化合物1個(gè)，肟類化合物1個(gè)。

圖 1　熱甜5號(hào)根系分泌物石油醚組分的GC-MS鑒定圖譜

表 1　熱甜5號(hào)根系分泌物石油醚組分化學(xué)成分分析Table 1　Chemical components of petroleum ether extraction from root exudates of Retian No.5

2.2甜椒根系分泌物乙酸乙酯組分的GC-MS鑒定

熱甜5號(hào)根系分泌物的乙酸乙酯組分GC-MS鑒定結(jié)果如圖2所示。圖2顯示，共出現(xiàn)56個(gè)物質(zhì)峰，第一個(gè)出峰時(shí)間為6.045 min，最后一個(gè)出峰時(shí)間為49.055 min，主要出峰時(shí)間集中在28～39 min，最大峰面積出現(xiàn)在30.291 min。

如表2所示，熱甜5號(hào)根系分泌物乙酸乙酯組分中相似度≥85%的化合物共有26個(gè)，其中烷烴類化合物9個(gè)，酯類化合物10個(gè)，肟類化合物1個(gè)，酚類化合物1個(gè)，醇類化合物4個(gè)，酰胺類化合物1個(gè)。

2.3甜椒根系分泌物氯仿組分的GC-MS鑒定

圖3為熱甜5號(hào)根系分泌物氯仿組分的GC-MS鑒定結(jié)果。圖3顯示，共出現(xiàn)59個(gè)物質(zhì)峰，第一個(gè)出峰時(shí)間為6.045 min，最后一個(gè)出峰時(shí)間為48.356 min，主要出峰時(shí)間集中在30～40 min，最大峰面積出現(xiàn)在40.378 min。

熱甜5號(hào)根系分泌物氯仿組分相似度≥85%的化合物共有25個(gè)，其中酯類化合物14個(gè)，醛類化合物1個(gè)，酚類化合物1個(gè)，菲類化合物1個(gè)，烷烴類化合物4個(gè)，醇類化合物2個(gè)，萘胺類化合物1個(gè)，肟類化合物1個(gè)(表3)。

圖 2　熱甜5號(hào)根系分泌物乙酸乙酯組分的GC-MS鑒定圖譜Fig.2　GC-MS chromatograms of ethyl acetate extraction from root exudates of Retian No.5 表 2　熱甜5號(hào)根系分泌物乙酸乙酯組分化學(xué)成分分析Table 2　Chemical components of ethyl acetate extraction from root exudates of Retian No.5

圖 3　熱甜5號(hào)根系分泌物氯仿組分的GC-MS鑒定圖譜

表 3　熱甜5號(hào)根系分泌物氯仿組分化學(xué)成分分析Table 3　Chemical components of chloroform extraction from root exudates of Retian No.5

2.4甜椒根系分泌物甲醇組分的GC-MS鑒定

熱甜5號(hào)根系分泌物甲醇組分GC-MS鑒定結(jié)果如圖4所示。圖4顯示，共出現(xiàn)59個(gè)物質(zhì)峰，第一個(gè)出峰時(shí)間為6.050 min，最后一個(gè)出峰時(shí)間為44.532 min，主要出峰時(shí)間集中在30～42 min，最大峰面積出現(xiàn)在40.394 min。

圖 4　熱甜5號(hào)根系分泌物甲醇組分的GC-MS鑒定圖譜

熱甜5號(hào)根系分泌物甲醇組分相似度≥85%的化合物共有33個(gè)，其中酯類化合物20個(gè)，肟類化合物1個(gè)，酚類化合物1個(gè)，醛類化合物1個(gè)，烷烴類化合物8個(gè)，醇類化合物2個(gè)(表4)。

表 4　熱甜5號(hào)根系分泌物甲醇組分化學(xué)成分分析Table 4　Chemical components of methanol extraction from root exudates of Retian No.5

表 4(續(xù))　Continued table 4

3　討論與結(jié)論

有關(guān)辣椒根系分泌物收集的研究多采用水培法[14-15]，該方法操作簡(jiǎn)單、排除了土壤微生物的干擾，并在一定程度上能夠真實(shí)反映特定根系分泌物的變化，但水培植物在缺少機(jī)械阻力的條件下根毛發(fā)育較少，與其在土壤中生長(zhǎng)分泌的化合物有所不同。因此，本研究采用滅菌的石英砂為栽培基質(zhì)，連續(xù)收集甜椒的根系分泌物，既能保證甜椒的正常生長(zhǎng)，又能很好地消除其他植物或土壤微生物對(duì)根系生長(zhǎng)的干擾。

本研究結(jié)果表明，甜椒根系分泌物中主要含有烷烴類、醇類、酯類、醛類、肟類、酚類、菲類、酰胺類和萘胺類化合物。前人研究結(jié)果表明，線椒根系分泌物中主要含有酸類、酮類、胺類、酯類、醇類、酚類、烴類、苯及其他雜環(huán)類物質(zhì)[14]；大豆根系分泌物中含有烷烴類、酚類、醇類、醛類、酸類、酯類化合物[16-17]；花生根系分泌物中含有有機(jī)酸、醇類、醛類、酮類、烴類、酯類物質(zhì)[18]；油菜和大白菜的根系分泌物中主要含有烷烴類、脂類、酸類物質(zhì)[19-20]；低效刺槐根系分泌物中主要含酸類、醇類、脂類物質(zhì)[21]；丹參和人參根系分泌物中主要含烷烴類、脂類、酸類、醇類、醛類物質(zhì)[22-23]。本研究結(jié)果與其基本一致，說(shuō)明不同植物根系分泌物含有不同類的化學(xué)成分。

大量研究表明，植物通過(guò)根系分泌、淋溶、揮發(fā)、腐解等方式釋放14類化感物質(zhì)到環(huán)境中，主要包括有機(jī)酸、肉桂酸及其衍生物、脂肪族醛和酮、直鏈醇、簡(jiǎn)單不飽和內(nèi)酯、萘醌、蒽醌和復(fù)合醌、簡(jiǎn)單酚、香豆素類、類萜和甾類化合物、氨基酸和多肽、類黃酮、單寧、長(zhǎng)鏈脂肪酸和多炔、生物堿和氰醇、苯甲酸及其衍生物、硫化物和芥子油苷、嘌呤和核苷[24-27]。本研究中，甜椒根系分泌物鑒定出的化合物中也可能含有化感物質(zhì)，逐年累積亦會(huì)產(chǎn)生化感自毒作用，導(dǎo)致連作障礙。前人研究結(jié)果表明，鄰苯二甲酸二丁酯是辣椒根系分泌物中含量最高的化感物質(zhì)[28]，鄰苯二甲酸二異丁酯是線辣椒根系分泌物中的化感物質(zhì)[29]，鄰苯二甲酸二丁酯和2,4-二叔丁基苯酚是百合根系分泌物中的主要化感物質(zhì)[30]，本研究鑒定的化學(xué)成分中同樣含有這幾種物質(zhì)，但這些物質(zhì)如何發(fā)揮化感作用仍有待進(jìn)一步研究。

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Identification of chemical components ofCapsicumfructescensL.root exudates by sand culturing method

HAN Xu,NIU Yu,DU Gongfu,CAO Zhenmu

(TropicalCropsGeneticResourcesInstitute,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences,Danzhou,Hainan571737,China)

【Objective】 The chemical components ofCapsicumfructescensL.root exudates were identified to provide scientific basis for investigation of allelopathy and mechanism of cropping obstacles.【Method】 The root exudates ofCapsicumfructescensL.were collected by sand culturing method.The extracts were fractionated by petroleum ether,ethyl acetate,chloroform and methanol after isolation by column chromatography.The chemical components were then identified by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS).【Result】 There were 50 peaks of chemical components in GC-MS chromatograms of petroleum ether extraction fromCapsicumfructescensL.root exudates,and 19 of them had similarity of ≥85%.There were 56 peaks in GC-MS chromatograms of ethyl acetate extraction with 26 having similarity of ≥85%.There were 59 peaks in GC-MS chromatograms of chloroform extraction with 25 having similarity of ≥85%.There were 59 peaks in GC-MS chromatograms of methanol extraction,and 33 of them had similarity of ≥85%.【Conclusion】 The root exudates ofCapsicumfructescensL.contain alkane,esters,alcohols,phenols,aldehydes,oxime,phenanthrenes,amide and naphthalene compounds.

CapsicumfructescensL.;root exudates;chemical component;sand culturing method

時(shí)間:2016-08-0909:41DOI：10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.09.021

2015-09-11

海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20153119)；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(1630032014020)

韓旭(1983-)，女，吉林長(zhǎng)春人，助理研究員，博士，主要從事蔬菜栽培生理生態(tài)研究。

E-mail：hanxu_0216@126.com

曹振木(1972-)，男，廣西桂平人，研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事蔬菜作物遺傳育種研究。

E-mail：caozhenmu2007@163.com

S641.3

A

1671-9387(2016)09-0158-08

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160809.0941.042.html