劉小花, 侯作賢, 張夢(mèng)婷, 王　影, 封士蘭

(1. 蘭州大學(xué) 藥學(xué)院, 甘肅 蘭州　730000；2. 蘭州大學(xué) 資產(chǎn)與實(shí)驗(yàn)室管理處, 甘肅 蘭州　730000)

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中藥制劑分析課的體驗(yàn)式教學(xué)改革研究與實(shí)踐

劉小花1, 侯作賢2, 張夢(mèng)婷1, 王影1, 封士蘭1

(1. 蘭州大學(xué) 藥學(xué)院, 甘肅 蘭州730000；2. 蘭州大學(xué) 資產(chǎn)與實(shí)驗(yàn)室管理處, 甘肅 蘭州730000)

將體驗(yàn)式教學(xué)應(yīng)用于中藥制劑分析課程,以培養(yǎng)學(xué)生的動(dòng)手能力、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)能力及理論與實(shí)踐的結(jié)合能力為目的,讓學(xué)生有機(jī)會(huì)對(duì)先進(jìn)的大型儀器進(jìn)行體驗(yàn)式上機(jī)操作。具體實(shí)施是以甘肅道地藥材“黃芪”為研究對(duì)象,建立其多種指標(biāo)成分含量測(cè)定的方法,讓研究生和本科生獨(dú)立完成實(shí)驗(yàn),以此促進(jìn)學(xué)生學(xué)習(xí)的積極性和主動(dòng)性,真正實(shí)現(xiàn)教學(xué)與科研的充分結(jié)合,達(dá)到以教學(xué)促進(jìn)科研、以科研提升教學(xué)的目的。

中藥制劑分析； 超高效液相色譜； 體驗(yàn)式教學(xué)

體驗(yàn)式教學(xué)[1-4]是培養(yǎng)學(xué)生使之具有獨(dú)立、自主和創(chuàng)新精神,以學(xué)生的自我體驗(yàn)為主要學(xué)習(xí)方式,力求在師生互動(dòng)和學(xué)生親身體驗(yàn)的過(guò)程中達(dá)到認(rèn)知與體驗(yàn)過(guò)程的有機(jī)結(jié)合的一種教學(xué)方法。與傳統(tǒng)的教學(xué)模式相比較,體驗(yàn)式教學(xué)以學(xué)生為主體,注重感覺體驗(yàn),鼓勵(lì)學(xué)生自我探索。體驗(yàn)式教學(xué)是適應(yīng)當(dāng)代大學(xué)生需求的教學(xué)方式。 體驗(yàn)式教學(xué)的價(jià)值和意義不僅提供了一種教學(xué)方法,更重要的是提供了一種有助于學(xué)生主體開展思考的教學(xué)理念[2]。體驗(yàn)式教學(xué)有4種模式:情境體驗(yàn)、案例體驗(yàn)、實(shí)踐體驗(yàn)和拓展活動(dòng)體驗(yàn)[4]。

高效液相色譜技術(shù)是中藥制劑分析中最常用也是最先進(jìn)的現(xiàn)代分析手段,是教師必須講授和學(xué)生必須要掌握的內(nèi)容。前期蘭州大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心推進(jìn)本科生綜合實(shí)驗(yàn)和設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)改革[5-7],取得了不錯(cuò)的成績(jī),積累了一定經(jīng)驗(yàn)。本項(xiàng)目要求學(xué)生查閱大量的關(guān)于黃芪藥材含量測(cè)定方法的文獻(xiàn)[8-13],要求學(xué)生盡可能選擇多種實(shí)驗(yàn)方案,通過(guò)對(duì)樣品處理方法的選擇和色譜測(cè)定條件的優(yōu)化,用對(duì)照品進(jìn)行比對(duì),建立UPLC(超高效液相色譜)法測(cè)定黃芪中多種指標(biāo)成分含量的實(shí)驗(yàn)方法,并與HPLC(高效液相色譜)法測(cè)定其含量[7]進(jìn)行比較,尋找出UPLC的優(yōu)勢(shì)。通過(guò)此項(xiàng)目的建立使學(xué)生掌握超高效液相色譜儀的使用和維護(hù),了解藥物分析及中藥制劑分析的一般流程,激發(fā)學(xué)生實(shí)踐學(xué)習(xí)的積極性,有利于培養(yǎng)學(xué)生的動(dòng)手能力、儀器的使用與操作,以及綜合思維與創(chuàng)新能力。

1　實(shí)驗(yàn)

1.1儀器與試劑

儀器:超高效液相色譜儀(Waters ACQUITYTM UPLC),KQ3200DB超聲波清洗器(昆明市超聲儀器有限公司),電熱恒溫水浴鍋(上海恒一),分析天平(BS224S型,十萬(wàn)分之一,德國(guó)Sartorius賽多利斯)。

試劑:乙腈,色譜純,德國(guó)默克公司；水為超純水；其他試劑均為分析純。

黃芪藥材:自采或購(gòu)買(見表1),經(jīng)蘭州大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)研究所馬志剛教授鑒定為蒙古黃芪Astragalus membranaceus (Fish.) Bge. Var. mongholicus (Bge.) Hsiao的干燥根。

對(duì)照品:毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷和芒柄花素均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

表1　黃芪藥材來(lái)源與品種

1.2黃芪藥材提取物制備

稱取黃芪藥材2 g,用10倍量的95%乙醇回流提取,共提取3次,每次1 h,合并提取液,將提取液蒸發(fā)濃縮,得黃芪提取物濃縮液,置于4 ℃冰箱冷藏備用。

1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別取毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花苷、金雀異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品適量,用甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為0.100、0.130、0.116、0.103、0.157 mg·mL-1的對(duì)照品溶液,置于4 ℃冰箱冷藏備用

1.4色譜條件

Fluoro-Phenyl 色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm)；流動(dòng)相為乙腈和超純水,梯度洗脫,洗脫程序見表2；進(jìn)樣量2 μL；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。

表2　梯度洗脫條件

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1色譜條件選擇

經(jīng)查閱文獻(xiàn)[11-13],確定了最佳色譜條件:流動(dòng)相組成為乙腈和水,洗脫方式為梯度洗脫,流速為0.3 mL·min-1。該色譜方法使所得的色譜峰窄,峰形較好,且使得各分析物得到了很好的分離。

2.2方法學(xué)考察

2.2.1線性關(guān)系

分別取“1.3”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液,以及毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷和芒柄花素,均以進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo),峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明這5種化合物的回歸方程均呈良好的線性關(guān)系,見表3。

表3　4種化合物在生物樣品中的標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取對(duì)照品溶液測(cè)定日內(nèi)精密度和日間精密度。同一對(duì)照品溶液在同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次,每次進(jìn)樣5 μL,計(jì)算日內(nèi)精密度,5個(gè)黃酮類化合物的RSD見表4。

同一對(duì)照品溶液連續(xù)3天每天進(jìn)樣2次,計(jì)算日間精密度,5個(gè)黃酮類化合物的RSD見表4。

日內(nèi)和日間精密度的RSD<2%,符合規(guī)定。

2.2.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取1號(hào)黃芪藥材(來(lái)自于臨夏地區(qū))6份,每份2 g,精密稱定,制備成供試品溶液,按照樣品測(cè)定方法測(cè)定。測(cè)得5個(gè)黃酮類化合物的平均含量和RSD,結(jié)果見表4。5種化合物重復(fù)性試驗(yàn)的RSD<2%,符合規(guī)定。

表4　5個(gè)黃酮類化合物的精密度和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2. 2.4準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

以加樣回收率考察準(zhǔn)確度。取同一批已知含量的1號(hào)黃芪藥材(來(lái)自于臨夏地區(qū))5份,每份2 g,精密稱定,各加入適量的各種對(duì)照品溶液(毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、金雀異黃酮、芒柄花素的質(zhì)量濃度分別為0.100、0.130、0.116、0.103、0.157 mg·mL-1),按照供試品溶液制備中的操作測(cè)定,計(jì)算5個(gè)化合物的加樣回收率,結(jié)果見表5。5個(gè)黃酮類成分平均回收率在96.86%～101.09%,RSD<2%,符合規(guī)定。

表5　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

表5(續(xù))

2.3樣品測(cè)定

取6批黃芪藥材,制備成樣品溶液,精密吸取2 μL進(jìn)入U(xiǎn)PLC儀進(jìn)行分析,含量測(cè)定結(jié)果見表6,色譜圖見圖1、圖2。

表6　黃芪藥材中5種黃酮類成分的含量

由圖1、圖2可知,通過(guò)與對(duì)照品比對(duì),鑒別出黃芪藥材提取物的UPLC色圖譜中5個(gè)色譜峰的結(jié)構(gòu),F1—F5號(hào)峰對(duì)應(yīng)的化合物分別為毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、金雀異黃酮、芒柄花素,其保留時(shí)間分別為1.912、3.484、4.018、4.703、5.569 min。

3　結(jié)果與討論

3.1提取效能評(píng)價(jià)

該實(shí)驗(yàn)要求學(xué)生查閱中藥中常用的幾種樣品處理方法的操作和使用,使學(xué)生熟悉回流提取、超聲提取和索氏提取法等樣品提取方法,并采用不同溶劑進(jìn)行提取；實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,選用95%乙醇作為溶劑對(duì)6批來(lái)自不同產(chǎn)地的黃芪藥材進(jìn)行回流提取,5個(gè)黃酮類成分在該提取條件下得到的提取率高、提取時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單,適合于學(xué)生實(shí)驗(yàn)。

圖1　6批黃芪藥材提取物UPLC-DAD 色譜圖(254 nm)

圖2　黃芪藥材與5個(gè)對(duì)照品UPLC-DAD 色譜圖(254 nm)

3.2檢測(cè)系統(tǒng)評(píng)價(jià)

采用UPLC法對(duì)6批來(lái)自不同產(chǎn)地的黃芪藥材進(jìn)行黃酮類成分的含量測(cè)定,測(cè)得各對(duì)照品的最大吸收波長(zhǎng)如下:毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷為258.1 nm,芒柄花苷為249.8 nm,毛蕊異黃酮為248.7 nm,金雀異黃酮為259.3 nm,芒柄花素為248.7 nm。本實(shí)驗(yàn)選取254 nm為檢測(cè)波長(zhǎng),對(duì)這5個(gè)黃酮類成分進(jìn)行分析,其結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好。說(shuō)明將UPLC法應(yīng)用于黃芪藥材中黃酮類成分的質(zhì)量控制中效果好。

3.3含量測(cè)定分析

用UPLC法測(cè)定黃芪藥材內(nèi)5種黃酮類成分含量大小的順序?yàn)?毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷>毛蕊異黃酮>芒柄花苷>芒柄花素>金雀異黃酮,其結(jié)果與用HPLC法測(cè)定的順序一致。6批藥材中的金雀異黃酮含量均少于2 μg·g-1,而以往的研究使用HPLC法測(cè)定黃芪藥材中成分的含量,由于HPLC法靈敏度低,金雀異黃酮的峰形不易被發(fā)現(xiàn),這也解釋了為何至今未見金雀異黃酮在黃芪藥材中報(bào)道的現(xiàn)象。

從表6中可發(fā)現(xiàn),即使是同一對(duì)照品在6批不同的黃芪藥材中的含量也會(huì)有較大的差異,這可能與黃芪的生長(zhǎng)環(huán)境、生長(zhǎng)年限以及儲(chǔ)藏時(shí)間等因素有關(guān)。

3.4UPLC與HPLC比較

與HPLC比較,UPLC法分析時(shí)間更短、靈敏度更高。同時(shí)測(cè)定黃芪中5種黃酮類成分,UPLC法完成一次樣品運(yùn)行時(shí)間只需8 min,而HPLC法需要45 min。使用UPLC法的流速為0.3 mL·min-1,而HPLC的流速為1 mL·min-1,結(jié)果比較得出,UPLC法使用的溶劑更少,該方法更綠色和環(huán)保。

4　結(jié)語(yǔ)

在教學(xué)實(shí)施過(guò)程中,學(xué)生在傾聽、動(dòng)口、動(dòng)手等溝通討論研究的過(guò)程中,又各自分享了不同的親歷感受,這種經(jīng)驗(yàn)的分享有助于學(xué)生對(duì)事物認(rèn)識(shí)的深化,也有助于學(xué)生立場(chǎng)與觀點(diǎn)的重新定位與補(bǔ)充。對(duì)教師而言,讓整個(gè)的課堂活動(dòng)成為學(xué)生自己的事情,讓他們自己去查閱相關(guān)資料、小組成員共同設(shè)計(jì)方案,由指導(dǎo)教師修訂方案,最后由學(xué)生獨(dú)立完成。學(xué)生通過(guò)對(duì)比、換位、揣摩、嘗試,去體會(huì)、感受,讓他們自己去交流,去總結(jié),去運(yùn)用。這種建立在充分自主活動(dòng)基礎(chǔ)上的學(xué)習(xí),能夠極大地調(diào)動(dòng)學(xué)生已有的知識(shí)背景,在活動(dòng)中形成新的知識(shí)體驗(yàn),并最終產(chǎn)生學(xué)習(xí)的“意義”。

通過(guò)對(duì)本項(xiàng)目的實(shí)施,使學(xué)生掌握超高效液相色譜儀的理論知識(shí)和實(shí)踐運(yùn)用。通過(guò)回流提取、超聲提取和索氏提取法進(jìn)行比較,使學(xué)生熟悉中藥制劑分析提取的幾種樣品處理方法的操作和使用。建立多種指標(biāo)成分含量測(cè)定的方法學(xué)考察實(shí)驗(yàn),包括色譜條件選擇、線性關(guān)系、穩(wěn)定性考察、精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、準(zhǔn)確度試驗(yàn)、樣品測(cè)定,可以使學(xué)生了解中藥制劑分析的一般流程,同時(shí)掌握UPLC法和HPLC測(cè)定中藥中指標(biāo)成分的方法以及它們的差異。

通過(guò)該體驗(yàn)式教學(xué),給學(xué)生提供最大的自由空間,提高了學(xué)生的創(chuàng)新能力,使他們能夠充分發(fā)揮自身的實(shí)踐能力,學(xué)習(xí)和使用現(xiàn)代技術(shù)手段、了解和應(yīng)用當(dāng)前新技術(shù),牢固掌握所學(xué)的理論知識(shí)。

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Research and practice on experimential teaching reform for Pharmacy Analysis of Traditional Chinese Medicine course

Liu Xiaohua1, Hou Zuoxian2, Zhang Mengtin1, Wang Ying1, Feng Shilan1

(1. School of Pharmacy,Lanzhou University, Lanzhou 730000, China;2. Department of Assets and Laboratory Management, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China)

In order to cultivate students' practical ability, experimental design ability and combination ability of theory and practice, and enable the students to have the opportunity to experience the operation of the advanced large-scale instruments on their own, the experiential teaching is applied to Pharmacy Analysis of Traditional Chinese Medicine course. Taking Radix Astragaliis as the research object, a method of determining the content of multi-index constituents by UPLC(Ultra Performance Liquid Chromatography) is adopted. Undergraduate and graduate students are encouraged to complete the experiment independently, and their enthusiasm and initiative in using the large-scale instruments are promoted.The combination of teaching with research is well completed, the research and teaching are stimulated, and the purpose for promoting research by teaching and stimulating teaching by research is realized.

Pharmacy Analysis of Traditional Chinese Medicine; UPLC; experimental type teaching

10.16791/j.cnki.sjg.2016.10.050

2016-04-13修改日期：2016-05-26

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(lzujbky-2015-59)；蘭州大學(xué)2016年教學(xué)改革項(xiàng)目；蘭州大學(xué)2016年實(shí)驗(yàn)技術(shù)創(chuàng)新基金項(xiàng)目

劉小花(1976—),女,甘肅蘭州,博士,高級(jí)實(shí)驗(yàn)師,研究藥物分析學(xué).E-mail：liuxiaoh@lzu.edu.cn

R917

A

1002-4956(2016)10-0199-05