連翹葉中連翹酯苷A的提取及其抗氧化活性

原江鋒，趙君峰，劉建利，邱智軍，王大紅

連翹葉中連翹酯苷A的提取及其抗氧化活性

原江鋒1，趙君峰1，劉建利2，邱智軍1，王大紅1

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003；2.陜 西省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，陜西 西安 710054）

研究連翹葉中連翹酯苷A的制備及其抗氧化活性。采用有機(jī)溶劑提取和柱層析方法制備粗連翹酯苷A，進(jìn)一步用反相硅膠色譜柱層析得到純化連翹酯苷A，并用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定其純度；采用體外抗氧化活性法測(cè)定粗連翹酯苷A和純化連翹酯苷A的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力、羥自由基（?OH）清除能力、超氧陰離子自由基（O2－·）清除能力、總還原能力和抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力。從連翹葉中分離得到的純度為62%粗連翹酯苷A和92%純化連翹酯苷A均具有較強(qiáng)體外抗氧化活性，并且清除DPPH自由基、總還原能力和抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照。連翹葉中連翹酯苷A含量豐富，且具有較強(qiáng)的抗氧化生物活性，是具有良好開(kāi)發(fā)前景的天然抗氧化劑和保健食品及生物藥品基料。

連翹葉；連翹酯苷A；制備；抗氧化活性

連翹葉為木犀科（Oleacaae）連翹屬（Forsythia）連翹（Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl）的干燥葉[1]。傳統(tǒng)主要以野生果實(shí)入藥，《中藥大辭典》、《中華本草》等現(xiàn)代典籍記載“連翹莖葉，味苦，性寒”，功能主治清熱解毒，主治“心肺積熱”[2]。連翹葉中含有連翹苷、連翹酯苷A、蘆丁、右旋松脂酚等化學(xué)成分，與連翹果實(shí)十分類似，連翹葉還具有降血糖、保肝、抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤等作用[3-7]。陜西關(guān)中連翹葉中連翹苷和連翹酯苷A的含量高于相應(yīng)地區(qū)連翹果實(shí)的含量[8]，連翹主產(chǎn)區(qū)山西和河南的連翹葉中連翹苷和連翹酯苷A含量均較高[9]，由于連翹葉沒(méi)有進(jìn)入國(guó)家藥典，所以連翹葉的開(kāi)發(fā)受到了極大地限制。本實(shí)驗(yàn)對(duì)連翹葉中主要活性成分之一的連翹酯苷A的制備工藝進(jìn)行研究，并對(duì)其體外抗氧化生物活性進(jìn)行系統(tǒng)研究，對(duì)于開(kāi)發(fā)利用這一生物資源，具有重要的理論意義及實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

連翹葉，2014年6月采自河南豫西伏牛山地區(qū)連翹種植基地，經(jīng)河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院候小改教授鑒定為木犀科植物連翹（Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl）的葉。

甲醇、乙腈（色譜純） 美國(guó)Fisher公司；連翹酯苷A（批號(hào)：111810-201405，純度＞91.4%） 中國(guó)食品藥品檢定研究院；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國(guó)Sigma公司；硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、氯化硝基四氮唑藍(lán)（nitrotetrazolium blue chloride，NBT）、FeSO4、乙二胺四乙酸（eathylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、H2O2、FeCl3、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced form of nicotinamideadenine dinucleotid，NADH）、吩嗪硫酸甲酯（phenazine methosulfate，PMS）、二丁基羥基甲苯（2,6-di-tertbutyl-4-methylphenol，BHT）、VC、K3Fe(CN)6、2’-脫氧核糖、正丁醇均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫科技公司；BS 124S型萬(wàn)分之一天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；721可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；TGL-18C-C型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 連翹酯苷A的提取

將粉碎至40 目的連翹葉50 g用60%的乙醇1 000 mL在70 ℃條件下浸提50 min，收集提取液，重復(fù)提取一次，合并提取液并過(guò)濾，濾液減壓濃縮，濃縮液用100%乙醇調(diào)整溶液體積分?jǐn)?shù)為5%乙醇濾液。連翹葉提取物用AB-8大孔吸附樹(shù)脂柱（2.6 cm×25 cm）分離，用50%乙醇洗脫液進(jìn)行洗脫，洗脫液減壓濃縮后用正丁醇萃取3 次，正丁醇層濃縮并冷凍干燥后得到粗連翹酯苷A。粗連翹酯苷A用反相硅膠色譜柱（8 cm×50 cm）進(jìn)一步純化，用30%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮并冷凍干燥，獲得純化連翹酯苷A。

1.3.2 色譜條件

Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.4%冰醋酸溶液（15∶85，V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm；流速1.0 mL/min；柱溫25 ℃。

精密稱取連翹酯苷A對(duì)照樣品1.8 mg，溶于少量甲醇，移至10 mL容量瓶中，用甲醇精密定容至刻度線，搖勻，即得連翹酯苷A質(zhì)量濃度為0.18 mg/mL的對(duì)照樣品溶液。

1.3.3 DPPH自由基的清除作用

參照Dutta等[10]的方法測(cè)定，并略有變動(dòng)。取質(zhì)量濃度分別為5、10、15、20、25、30 μg/mL的粗連翹酯苷A和純化連翹酯苷A樣品溶液1 mL，加入0.004% DPPH溶液3 mL，充分混勻，避光靜置30 min后，以甲醇為空白對(duì)照，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。每一樣品平行測(cè)3 次，取其平均值。清除率公式可表示為：

式中：A1為樣品或者陽(yáng)性對(duì)照吸光度；A2為空白對(duì)照吸光度。

1.3.4 羥自由基（?OH）清除能力

采用脫氧核糖-鐵體系法[11-12]測(cè)定，略有改動(dòng)。在反應(yīng)體系中加入20 mmol/L，pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）1.0 mL（包含0.1 mmol/L FeCl3、0.1 mmol/L EDTA、2.8 mmol/L脫氧核糖），加入1 mmol/L VC溶液0.1 mL，20 mmol/L H2O2溶液0.5 mL和質(zhì)量濃度分別為100、200、300、400、500 μg/mL粗連翹酯苷A和純化連翹酯苷A溶液1.0 mL。37 ℃水浴中反應(yīng)90 min后，加入1.0 mL 1%的TCA溶液終止反應(yīng)，再加入2.8%的TBA 0.3 mL，100 ℃沸水浴15 min，冰水冷卻后于532 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度A，每一樣品平行實(shí)驗(yàn)測(cè)3 次，取其平均值。用VC做陽(yáng)性對(duì)照，空白對(duì)照不加脫氧核糖溶液。?OH清除率的計(jì)算見(jiàn)下式。

式中：A1為樣品或者陽(yáng)性對(duì)照吸光度；A2為空白對(duì)照吸光度。

參照文獻(xiàn)[13]方法。20 mmol/L pH 7.4的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液中含NADH 468 μmol/L，NBT 78 μmol/L，PMS 60 μmol/L，用VC做陽(yáng)性對(duì)照，空白對(duì)照不加PMS，總體積為3 mL，以空白管調(diào)零，于560 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。每一樣品平行測(cè)3 次，取其平均值?！で宄实挠?jì)算見(jiàn)下式。

式中：A1為樣品或者陽(yáng)性對(duì)照吸光度；A2為空白對(duì)照吸光度。

1.3.6 總還原能力的測(cè)定[14-15]

分別取不同濃度的BHT、VC、粗連翹酯苷A和純化連翹酯苷A溶液1 mL于試管中，加入0.2 mol/L，pH 6.6的PBS 2.5 mL及1% K3Fe(CN)62.5 mL，于50 ℃水浴反應(yīng)20 min后急速冷卻，加入10% TCA溶液2.5 mL后3 000×g離心10 min，取上清2.5 mL加入蒸餾水2.5 mL及0.1% FeCl3溶液0.5 mL，混合均勻后放置10 min，于700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度（A700nm）。以A700nm表示總還原能力。

1.3.7 脂質(zhì)過(guò)氧化抑制作用

采用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）法[16]測(cè)定，將10.0 mL蛋黃溶解于10 mmol/L，pH 7.45 PBS中，制備成10%的脂質(zhì)體分散液。取0.5 mL卵磷脂乳濁液，加入0.5 mL質(zhì)量濃度分別為50、100、200、300 μg/mL的樣品溶液，0.07 mol/L的FeSO4溶液0.05 mL后37 ℃條件下水浴30 min。將上述試管取出后，加入1.5 mL 20%的乙酸溶液（用NaOH調(diào)pH值至3.5），0.05 mL 20%的TCA，靜置10 min后加入1.5 mL 0.8%的TBA，于95 ℃條件下反應(yīng)60 min，冰水冷卻后加入等體積正丁醇萃取，取正丁醇層于532 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度（A532nm），平行實(shí)驗(yàn)3 次，取其平均值，用VC和BHT做陽(yáng)性對(duì)照。每一樣品平行測(cè)3 次，取其平均值。脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率的計(jì)算見(jiàn)下式。

式中：A1為樣品或者陽(yáng)性對(duì)照吸光度；A2為未加樣品組吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 連翹酯苷A純度

以連翹酯苷A對(duì)照品峰面積Y為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)，得連翹酯苷A回歸方程：Y=17 617X+105.71（R2=0.980 3），線性范圍為0.018～0.900 μg。采用有機(jī)溶劑提取和大孔吸附樹(shù)脂柱層析方法制備得到粗連翹酯苷A 5.85 g，采用反相硅膠色譜柱純化得到純化連翹酯苷A 3.19 g。精密稱取粗連翹酯苷A和純化連翹酯苷A樣品少許，溶于少量甲醇，測(cè)得粗連翹酯苷A和純化連翹酯苷A的純度分別為62%和92%。

2.2 DPPH自由基清除能力

圖1 連翹葉中粗連翹酯苷A和純化連翹酯苷A清除DPPH自由基能力Fig.1 DPPH radical scavenging activities of crude and purified forsythiaside A from Forsythia suspense leaves

DPPH自由基是一種化學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，不易被清除，若受試物能夠清除它，則表示受試物具有較強(qiáng)的自由基清除能力[17]。由圖1可知，從連翹葉中提取得到的粗連翹酯苷A和純化連翹酯苷A對(duì)DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除能力，在較低質(zhì)量濃度下即可達(dá)到較高的清除率，隨著樣品溶液質(zhì)量濃度的增大，清除能力增強(qiáng)，在5～30 μg/mL范圍內(nèi)呈較好的量效關(guān)系。在檢測(cè)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，純化的連翹酯苷A與陽(yáng)性對(duì)照BHT和VC相比較，抗氧化活性比陽(yáng)性對(duì)照強(qiáng)；粗連翹酯苷A與陽(yáng)性對(duì)照BHT相比具有較強(qiáng)的抗氧化活性，但略低于VC。結(jié)果說(shuō)明，從連翹葉中提取的粗的連翹酯苷A和純化的連翹酯苷A具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基能力。

2.3 ·OH清除能力

圖2 連翹葉中粗連翹酯苷A和純化連翹酯苷A清除?OH能力Fig.2 Hydroxyl radical scavenging activities of crude and purified forsythiaside A from Forsythia suspense leaves

由圖2可知，在100～500 μg/mL范圍內(nèi)，粗連翹酯苷A和純化連翹酯苷A對(duì)·OH清除率隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而增大，并且呈較好的量效關(guān)系。在100 μg/mL時(shí)，粗連翹酯苷A和純化連翹酯苷A的清除率基本與陽(yáng)性對(duì)照VC接近；在500 μg/mL質(zhì)量濃度時(shí)，粗連翹酯苷A和純化連翹酯苷A清除率均超過(guò)50%；并且粗連翹酯苷A、純化連翹酯苷A和VC的IC50分別為484.09、310.94、212.07 μg/mL。結(jié)果說(shuō)明粗連翹酯苷A清除·OH的活性略低于純化連翹酯苷A；純化連翹酯苷A清除·OH活性雖略低于陽(yáng)性對(duì)照VC，但仍具有明顯的清除·OH活性。

圖3 連翹葉中粗連翹酯苷A和純化連翹酯苷A清除·能力Fig.3 Superoxide anion radical scavenging capacities of crude and purified forsythiaside A from Forsythia suspense leaves

2.5 總還原能力

活性成分的抗氧化能力與還原能力之間具有很好的相關(guān)性，因此還原能力可以作為一種衡量抗氧化能力的指標(biāo)[19]。通過(guò)吸光度的大小來(lái)判定其還原能力，吸光度越大表示還原力越強(qiáng)[20]。由圖4可知，隨著樣品質(zhì)量濃度的升高，總還原能力逐漸增強(qiáng)。陽(yáng)性對(duì)照VC的總還原力始終大于BHT的總還原力，并且純化連翹酯苷A和粗連翹酯苷A的總還原力要高于陽(yáng)性對(duì)照BHT的總還原力，而且各化合物總還原力大小分別為：VC＞純化連翹酯苷A＞粗連翹酯苷A＞BHT。此結(jié)果表示，在50～400 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，純化連翹酯苷A和粗連翹酯苷A具有顯著的總還原能力，因此具有極大的開(kāi)發(fā)價(jià)值。

圖4 粗連翹酯苷A和純化連翹酯苷A的總還原力Fig.4 Reducing power of crude and purified forsythiaside A at various concentrations

2.6 對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用

在生物體系中細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜含有大量的不飽和脂肪酸，很容易引起脂質(zhì)過(guò)氧化，而很多疾病和細(xì)胞衰老現(xiàn)象都與脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)[21]。而卵磷脂C-2位上所含極低密度脂蛋白和低密度脂蛋白的過(guò)不飽和脂肪酸在亞鐵離子的催化下, 經(jīng)振蕩能誘發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生烷氧基（LO·）和烷基過(guò)氧基（LOO·）。在加熱的條件下，過(guò)氧化物可與TBA反應(yīng)產(chǎn)生紅色化合物，并在532 nm波長(zhǎng)處有顯著的光吸收。

圖5 粗連翹酯苷A和純化連翹酯苷A脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用Fig.5 Inhibition of lipid peroxidation by crude and purified forsythiaside A

由圖5可知，在實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的50～300 μg/mL范圍內(nèi)，粗連翹酯苷A和純化連翹酯苷A對(duì)過(guò)氧化體系均有一定的抑制作用，這種抑制作用隨著體系質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。在50～300 μg/mL范圍內(nèi)，VC的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率為47.2%～72.9%；粗連翹酯苷A和純化連翹酯苷A的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率分別為53.3%～76.2%和58.2%～82.7%，對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化抑制大小排序?yàn)椋杭兓B翹酯苷A＞粗連翹酯苷A＞VC。此結(jié)果表明，從連翹葉中提取的連翹酯苷A具有顯著的抑制脂質(zhì)過(guò)氧化作用，是極具開(kāi)發(fā)潛力的天然產(chǎn)物。

3 討 論

近年來(lái)，隨著生命科學(xué)研究的不斷深入，科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)自由基的生成與一些慢性疾病的發(fā)生率有關(guān)。在正常的生理代謝過(guò)程中，體內(nèi)的防御機(jī)制能將人體產(chǎn)生少量的自由基及時(shí)清除，以維持自由基的代謝平衡，因此一般不會(huì)對(duì)細(xì)胞、組織產(chǎn)生損傷[22]。然而，衰老及一些誘導(dǎo)因素會(huì)造成體內(nèi)的自由基代謝失衡并累積，對(duì)生物大分子結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生破壞作用，從而對(duì)細(xì)胞、組織產(chǎn)生損傷，導(dǎo)致多種疾病并加速衰老。通過(guò)補(bǔ)充外源性抗氧化劑來(lái)調(diào)節(jié)自由基平衡，將是未來(lái)營(yíng)養(yǎng)保健、機(jī)體損傷修復(fù)和防治疾病的新熱點(diǎn)[23]。從生物材料中尋找具有較強(qiáng)活性的天然抗氧化劑是目前研究的熱點(diǎn)。

目前，由于連翹葉沒(méi)有進(jìn)入國(guó)家藥典，因此對(duì)連翹葉的研究多集中在活性成分的檢測(cè)和分析上，而對(duì)連翹葉中主要活性成分的提取、分離及其抗氧化活性鮮有報(bào)道。本研究從連翹葉中得到純度分別為62%粗連翹酯苷A和92%純化連翹酯苷A，提取率分別為11.7%和6.38%，并通過(guò)粗連翹酯苷A和純化連翹酯苷A對(duì)DPPH自由基體系、·OH體系、·體系、總還原能力和清除脂質(zhì)過(guò)氧化能力系統(tǒng)的研究，結(jié)果證實(shí)純化連翹酯苷A和粗連翹酯苷A具有較強(qiáng)抗氧化活性，并且對(duì)DPPH自由基清除能力、總還原能力和清除脂質(zhì)過(guò)氧化能力高于陽(yáng)性對(duì)照，說(shuō)明連翹葉中連翹酯苷A具有極大的活性和開(kāi)發(fā)價(jià)值。為了降低商品的開(kāi)發(fā)成本，對(duì)提取率較高的粗連翹酯苷A可以開(kāi)發(fā)成天然抗氧化劑和保健食品；而純連翹酯苷A則可以作為藥物基料進(jìn)行開(kāi)發(fā)。

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Extraction and Antioxidant Effect of Forsythiaside A from Forsythia suspense Leaves

YUAN Jiangfeng1, ZHAO Junfeng1, LIU Jianli2, QIU Zhijun1, WANG Dahong1
(1. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China; 2. Shaanxi Environmental Center Monitoring Station, Xi’an 710054, China)

The purpose of this study is to investigate the preparation of forsythiaside A and its antioxidant activity in vitro. The crude forsythiaside A was obtained from Forsythia suspense leaves by organic solvent extraction and macroporous resin column chromatography, and the purified forsythiaside A was obtained with reversed-phase silica column chromatography. The crude and purified forsythiaside A were analyzed by HPLC, and their antioxidant activities in vitro were evaluated by DPPH radical scavenging capacity, hydroxyl radical scavenging capacity, superoxide anion radical scavenging capacity, reducing power, and anti-lipid peroxidation capacity. The 62% crude forsythiaside A and 92% purified forsythiaside A from Forsythia suspense leaves had pote nt antioxidant activity, and their antioxidant activities were stronger than those of the positive control in DPPH radical scavenging activity, reducing power, and lipid peroxidation assay. Forsythiaside A was rich in Forsythia suspense leaves, and it had strong antioxidant activity. Therefore, forsythiaside A from Forsythia suspense leaves may be exploited as a good natural antioxidant as well as an important functional ingredient of foods and biomedicines.

Forsythia suspense leaves; forsythiaside A; preparation; antioxidant activity

10.7506/spkx1002-6630-201601017

Q946.8

A

1002-6630（2016）01-0094-05

原江鋒, 趙君峰, 劉建利, 等. 連翹葉中連翹酯苷A的提取及其抗氧化活性[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(1): 94-98.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601017. http://www.spkx.net.cn

YUAN Jiangfeng, ZHAO Junfeng, LIU Jianli, et al. Extraction and antioxidant effect of forsythiaside A from Forsythia suspense leaves[J]. Food Science, 2016, 37(1): 94-98. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601017. http://www.spkx.net.cn

2015-06-25

洛陽(yáng)市科技攻關(guān)項(xiàng)目（1401076A）；河南人才培養(yǎng)聯(lián)合基金項(xiàng)目（U1404307）；

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31401672）

原江鋒（1978—），女，副教授，博士，主要從事生物活性成分的分析和應(yīng)用研究。E-mail：jiangfengyuan@163.com