孫麗偉，周衛(wèi)東，劉承浩，楊　芳，王　君，汪　琦，任　歆，尹曉明，曾慶玉

?

血管緊張素原基因AGT M235T多態(tài)性與腦白質(zhì)疏松癥相關(guān)性研究

孫麗偉1，周衛(wèi)東1，劉承浩1，楊芳1，王君1，汪琦1，任歆1，尹曉明2，曾慶玉2

目的探討腎素血管緊張素原(angiotensinogen,AGT)M235T基因多態(tài)性與腦白質(zhì)疏松癥(Leukoaraiosis,LA)的相關(guān)性。方法采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及聚合酶鏈反應(yīng)-限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)及Sequenom系統(tǒng)檢測(cè),經(jīng)頭部MRI確診的202例腦白質(zhì)疏松癥患者及105例經(jīng)MRI排除LA的正常對(duì)照者AGTM235T基因多態(tài)性。結(jié)果腦白質(zhì)疏松癥患者AGTMT基因型及T等位基因頻率與對(duì)照組有明顯差異，兩組間TT基因型差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論AGT基因MT基因型和T等位基因可能與腦白質(zhì)疏松癥的發(fā)病相關(guān)。

腦白質(zhì)疏松癥；基因多態(tài)性；血管緊張素原；腦小血管病

腦白質(zhì)疏松癥是腦小血管疾病的一種，其與認(rèn)知障礙[1]、跌倒發(fā)作以及神經(jīng)精神疾病[2,3]有密切關(guān)聯(lián)，還可增加腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重影響老年人的健康和生活質(zhì)量。目前腦白質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制尚不明確，有研究提示腦白質(zhì)疏松癥是一種多基因遺傳性疾病。RAS系統(tǒng)通過(guò)影響血管收縮、血壓調(diào)節(jié)、血栓形成和血管壁的損傷，最終可能導(dǎo)致腦血管疾病。研究發(fā)現(xiàn)，AGT基因多態(tài)性不僅與高血壓、冠心病密切相關(guān),還參與缺血性腦損傷的病理生理過(guò)程。本研究應(yīng)用PCR-RFLP技術(shù)檢測(cè)AGT M235T基因多態(tài)性在腦白質(zhì)疏松癥患者及正常人群中的分布情況，來(lái)探討其與腦白質(zhì)疏松癥的相關(guān)性。

1　材料與方法

1.1研究對(duì)象病例組于2013年3月-2015年6月本院神經(jīng)內(nèi)科收集的已確診的腦白質(zhì)疏松癥患者202例，男73例，女129例，平均年齡(65.68±9.131)歲，來(lái)自同一地區(qū)，非1級(jí)親屬。入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡在50～85歲之間，符合腦白質(zhì)疏松癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)頭部MRI掃描確診。LA診斷標(biāo)準(zhǔn)：雙側(cè)大腦皮質(zhì)下白質(zhì)、側(cè)腦室周圍及半卵圓中心的散在或者彌漫性病灶，T1呈等信號(hào)或低信號(hào)，T2和FLMR呈高信號(hào)，DWI呈低信號(hào)[4]。排除標(biāo)準(zhǔn)：癡呆、帕金森、嚴(yán)重的全身系統(tǒng)性疾病、腦出血、腦梗死、顱腦腫瘤及其他遺傳代謝性神經(jīng)系統(tǒng)疾病病史等患者。對(duì)照組：同期本院通過(guò)招募的年齡在50～85歲,且經(jīng)MRI排除LA的正常對(duì)照105例，男35例，女70例，平均年齡(59.66±6.83)歲。兩組人群的排除標(biāo)準(zhǔn)一致。由兩名神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師根據(jù)Fazekas視覺(jué)等級(jí)評(píng)分法[5]對(duì)所有LA患者分別進(jìn)行評(píng)定，兩者評(píng)定結(jié)果不一致的再通過(guò)上級(jí)醫(yī)師驗(yàn)證。Fazekas視覺(jué)等級(jí)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：Fazekas 0級(jí)：無(wú)LA；Fazekas 1級(jí)：點(diǎn)狀或片狀病灶(單個(gè)病灶直徑≤9 mm,簇狀病灶﹤20 mm)；Fazekas 2級(jí)：病灶開始融合，但病灶之間并無(wú)橋狀連接(單個(gè)病灶直徑10～20 mm，簇狀病灶直徑>20 mm)；Fazekas 3級(jí)：?jiǎn)蝹€(gè)或片狀融合病灶直徑≥20 mm。

1.2臨床資料本研究已獲得煤炭總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均已簽署知情同意書。兩組均采用統(tǒng)一調(diào)查表填寫內(nèi)容：年齡、性別、高血壓、高脂血癥、糖尿病等相關(guān)病史，同時(shí)進(jìn)行血常規(guī)、血脂、空腹血糖、肝腎功能及頸部血管彩超等檢查。

1.3試劑與方法

1.3.1基因組DNA提取采取所有受試者肘部靜脈血2 ml于紫帽管中，-20 ℃保存。嚴(yán)格按照DNA提取試劑盒(美國(guó)Omega Bio-Tek公司提供)說(shuō)明書上的步驟進(jìn)行DNA提取。

1.3.2AGT引物在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI)獲得AGT基因組序列，ID號(hào)：183。引物設(shè)計(jì)及合成在中國(guó)上海生工生物工程有限公司完成。上游引物序列(FF)：5’ACCCTGGCCTCTCTCTATCTG3’。下游引物序列(RR)：5’AGCCACTTCCCCACTTCTCAAG3’。上下游引物之間共577 bp。突變位點(diǎn)在379 bp位置處。

1.3.3采用PCR-RFLP技術(shù)行PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增體系：10×buffer(含Mg2+)5 μl；2.5 mmol dNTP 2 μl；10 μmol上游引物1 μl；10 μmol下游引物1 μl；模板DNA 2 μl；TaqDNA聚合酶0.5 μl；加ddH2O至終體積為50 μl。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，再以94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s的程序循環(huán)35次，最后在 72 ℃延伸5 min。PCR儀：YG96梯度PCR儀。擴(kuò)增回收前凝膠圖像(見(jiàn)圖1)。

1.3.4擴(kuò)增產(chǎn)物的純化選用瓊脂糖凝膠電泳法純化回收。瓊脂糖濃度為2%，取30 μl擴(kuò)增產(chǎn)物加5 μl溴酚藍(lán)上樣，每排加一個(gè)Marker。電泳45 min，紫外分析儀下，將目的條帶切下，用膠回收試劑盒回收，得到30 μl左右的純化產(chǎn)物。取3 μl上樣檢測(cè)并記錄。電泳儀：雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀-DYY-8C(北京市六一儀器廠)；紫外分析儀：Biosens-SC-BO5(BioTop)。

1.3.5擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序純化后檢測(cè)成功的樣本進(jìn)行BDT反應(yīng)。依次加入測(cè)序酶、buffer、引物和純化后的產(chǎn)物，行PCR儀擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物采用酒精純化法，純化后的產(chǎn)物加入HIDI混勻，上機(jī)(3730XL)測(cè)序。突變位點(diǎn)的測(cè)序圖(見(jiàn)圖2)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0 軟件，兩組間不同基因型比較和等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)，相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)率以優(yōu)勢(shì)比(odds ratio,OR) 及其95% 可信區(qū)間(confidenceinterval,CI)表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)量資料應(yīng)用t檢驗(yàn)，分類資料應(yīng)用χ2檢驗(yàn)。等級(jí)資料應(yīng)用非參數(shù)檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1AGT基因多態(tài)性所有DNA樣本經(jīng)上述PCR 和擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后，應(yīng)用Chromas 2軟件讀取擴(kuò)增的AGT基因序列，可觀察到AGT基因突變的3種類型：無(wú)突變型MM型(見(jiàn)圖2)、純合突變型TT型(見(jiàn)圖3)、雜合突變型MT型(見(jiàn)圖4、圖5)。

2.2經(jīng)Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)表明，LA組和對(duì)照組兩組AGT基因M235 T 多態(tài)性基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡，具有群體代表性。

2.3LA組和對(duì)照組AGT 基因M235 T多態(tài)性和等位基因頻率比較(見(jiàn)表1)。LA組AGT基因MT基因型頻率(33.2%對(duì)21%；χ2=5.220，P=0.022)及T等位基因頻率(20.5%對(duì)13.33%；χ2=4.071，P=0.044)高于對(duì)照組，均P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LA組AGT基因MM基因型頻率(63.4%對(duì)76.2%；χ2=5.220，P=0.022)顯著低于對(duì)照組，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組相比，MT+TT(突變型)與MM(無(wú)突變型)顯著性增高(χ2=5.209，P=0.023)P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4LA組與對(duì)照組的人口資料學(xué)及臨床指標(biāo)的比較(見(jiàn)表2)。與對(duì)照組相比，LA組年齡(t=-6.504，P=0.00)、高血壓病(χ2=13.873，P=0.000)、冠心病(χ2=4.733，P=0.030)均P<0.05，顯著性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此，年齡、高血壓病、冠心病可能是腦白質(zhì)疏松癥的危險(xiǎn)因素。

2.5將兩組可能危險(xiǎn)因素進(jìn)行Logistic多因素方差分析(見(jiàn)表3)，結(jié)果顯示年齡(OR=1.092；95%CI：1.054～1.130；P=0.000)、基因突變(OR=1.754；95%CI：1.064～2.890；P=0.028)高血壓(OR=2.019；95%CI：0.778～3.233；P=0.009)是LA的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。行協(xié)方差分析排除年齡混雜因素后，該基因突變?nèi)匀慌cLA有相關(guān)性(P=0.015,95%CI：0.661～0.838)。

2.6AGT M235T基因多態(tài)性在LA不同分級(jí)間的比較因TT基因型分布頻率較低，將TT基因型與MT基因型歸為同組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)基因未突變組(MM型)與突變組(MT+TT型)與不同LA分級(jí)行Spearman相關(guān)分析，結(jié)果顯示：相關(guān)系數(shù)r=0.145，P=0.011，P<0.05，提示基因突變與LA 嚴(yán)重程度顯著相關(guān)，且成正相關(guān)關(guān)系。AGT基因突變各基因型在LA不同分級(jí)間的分布(見(jiàn)表4)。

表1　LA組和對(duì)照組 AGT 基因 M235 T 多態(tài)性和等位基因頻率比較

與對(duì)照組比較*較*P<0.05

表2　LA組與對(duì)照組的人口資料學(xué)及臨床指標(biāo)的比較

與對(duì)照組比較*較*P<0.05

表3　兩組間危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析

與對(duì)照組比較*較*P<0.05

表4　AGT基因突變各基因型在LA不同分級(jí)間的分布

圖1　DNA目的片段凝膠圖像

圖2　無(wú)突變型MM型

(需觀察的突變位點(diǎn)如箭頭所示，F(xiàn)F序列為T堿基，RR序列為A堿基)

圖3純合突變型TT型(FF 突變處T堿基突變?yōu)镃堿基，RR 突變處A堿基突變?yōu)镚堿基)

圖4雜合突變型MT型(FF 突變處T堿基突變?yōu)镃堿基，RR 序列無(wú)突變?nèi)詾锳堿基)

圖5雜合突變型MT型(FF 序列無(wú)突變?nèi)詾門堿基，RR 序列：突變處A堿基突變?yōu)镚堿基)

3　討　論

腦白質(zhì)疏松癥，又名白質(zhì)高信號(hào)(white matter hyperintensities,WMH)，是一種常見(jiàn)的神經(jīng)影像學(xué)表現(xiàn)。研究提示LA是一種多基因遺傳性疾病，文獻(xiàn)報(bào)道其遺傳率從55%～80%不等[6]。AGT M235T基因位于人染色體1q42～q43，該基因結(jié)構(gòu)上至少存在16個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，位于第2外顯子核苷酸第704 處胸腺嘧啶(T)被胞嘧啶(C)替代,最終導(dǎo)致編碼產(chǎn)物第235 位氨基酸由蛋氨酸Met 突變?yōu)樘K氨酸Thr，即 M235T，構(gòu)成3種基因型：未突變型235MM、突變純合型235TT和突變雜合型235MT。

本研究結(jié)果表明LA組的MT基因型和T等位基因明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，該結(jié)論體現(xiàn)了中國(guó)人群LA的AGT基因型分布特點(diǎn)及突變特征。國(guó)外一薈萃分析[7]，納入了van Rijn、Schmidt、Sierra等6個(gè)研究[8～10]，分析顯示AGT基因突變與LA無(wú)相關(guān)性，但該分析僅涉及歐、美洲一些國(guó)家，由于種族差異，該結(jié)論不能反映亞洲中國(guó)人群LA的AGT突變特點(diǎn)，且該薈萃分析樣本量小，尚需更多及更大樣本量研究來(lái)證實(shí)AGT基因突變與LA相關(guān)性問(wèn)題。國(guó)內(nèi)一薈萃分析[11]顯示AGT 235T突變型可增加亞洲人群缺血性卒中風(fēng)險(xiǎn),與白種人無(wú)關(guān)。故推測(cè)AGT MT基因型與T等位基因可能參與LA的發(fā)生，其機(jī)制尚不清楚。Stephen等及Lanz JR等[12]推測(cè)T等位基因通過(guò)升高血漿中血管緊張素原水平，間接使血管緊張素Ⅱ水平升高，后者使小動(dòng)脈平滑肌收縮和血管平滑肌細(xì)胞的增生、肥大及脂質(zhì)沉積，影響血壓的同時(shí)可直接導(dǎo)致皮質(zhì)下小血管硬化,繼而引起皮質(zhì)下及深層白質(zhì)缺血性改變。

本研究發(fā)現(xiàn)LA發(fā)生與年齡、高血壓病、冠心病等因素相關(guān),年齡、高血壓、AGT基因突變是LA發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Kuller和Grueter等的研究認(rèn)為[13]，隨著年齡的增長(zhǎng)，腦小血管危險(xiǎn)因素如動(dòng)脈粥樣硬化、頸動(dòng)脈斑塊、高血壓等所致小動(dòng)脈狹窄，而供應(yīng)腦白質(zhì)區(qū)域血管灌注壓下降時(shí)，易造成腦白質(zhì)缺血改變。本研究中LA患者AGT M235T基因突變與高血壓病(MT基因型χ2=0.669，P=0.413；MT+TT基因型χ2=0.441，P=0.507)無(wú)相關(guān)性，故我們推測(cè)MT基因型可能是獨(dú)立于血壓高水平的LA的遺傳學(xué)危險(xiǎn)因素。Amelia等[14]也得出一致的結(jié)論。而Sierra等25例LA研究[10]，未得出AGTMT與LA的關(guān)聯(lián)，可能因樣本量過(guò)小所致。

在本研究中，我們所選擇的是中國(guó)北京地區(qū)漢族人群，比較好的控制了遺傳異質(zhì)性對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生的影響，且本研究所選正常對(duì)照病例均經(jīng)MRI檢查，入排標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格，樣本同質(zhì)性較好，能夠比較真實(shí)的反映國(guó)人LA的遺傳危險(xiǎn)因素，通過(guò)對(duì)LA易感基因的篩查,可以在傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素的檢測(cè)基礎(chǔ)上,更為準(zhǔn)確地篩查L(zhǎng)A發(fā)生的高危人群，從而采取針對(duì)性的預(yù)防及治療措施。

[1]Assareh A,Mather KA,Schofild PR,et al.The genetics of white matter lesions[J].CNS Neurosci Thrapeut,2011,17:525-540.

[2]Debette S,Markus HS.The clinical importance of white matter hyperintensities on brain magnetic resonance imaging:systematic review and meta-analysis[J].BMJ,2010,341:c3666.

[3]牛寶豐,周衛(wèi)東,劉長(zhǎng)春,等.椎-基底動(dòng)脈系統(tǒng)短暫性腦缺血發(fā)作患者腦白質(zhì)變性的危險(xiǎn)因素研究[J].中國(guó)神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志,2015,24(1):46-48.

[4]Smith EE.Leukoaraiosis and stroke[J].Stroke,2010,41:139-143.

[5]Prins ND,Scheltens P.White matter hyperintensities,cognitive impairment and dementia:an updat[J].Nat Rev Neurol,2015,11:157-165.

[6]Lin Q,Huang WQ,Tzeng CM,et al.Genetic associations of leukoaraiosis indicate pathophysiological mechanisms in white matterlesions etiology[J].Rev Neurosci,2015,26(3):343-358.

[7]Paternoster L,Chen WT,Sudlow Cathie LM,et al.Genetic determinants of white matter hyperintensities on brain scans[J].Stroke,2009,40:2020-2026.

[8]Van Rijn MJ E,Bos MJ,Isaacs A,et al.Polymorphisms of the renin-angiotensin system are associatedwith blood pressure,atherosclerosis and cerebral white matterpathology[J].J Neurol Neurosurg Psychiatry,2007,78(10):1083-1087.

[9]Schmidt R,Schmidt H,Fazekas F,et al.Angiotensinogen polymorphism M235T,carotid atherosclerosis,and small-vessel disease-related cerebral abnormalities[J].Hypertension,2001,38:110-115.

[10]Sierra C,Coca A,Gamez-Angelats E,et al.Renin-angiotensin system genetic polymorphisms and cerebralwhite matter lesions in essential hypertension[J].Hypertension,2002,39:343-347.

[11]LiangBY,QinLL,Wei HJ,et al.AGT M235T polymorphisms and ischemic stroke risk:a meta-analysis[J].J Neurological Sci,2013,331:118-125.

[12]Lanz JR,Pereira AC,Leos PA,et al.Angiotensinogen M235T polymorphism isassociated with coronary artery disease severity[J].Clin Chim Acta,2005,362:176-181.

[13]Kuller LH,Margolis KL,Gaussoin SA,et al.Relationship of hypertension,blood pressure,and blood pressure control with white matter abnormalities in the Women’s Health Initiative Memory Study (WHIMS)-MRI trial[J].J Clin Hypertens,2010,12(3):203-212.

[14]Assareh AA,Mather KA,Crawford JD,et al.Renin-angiotensin system genetic polymorphisms and brain white matter lesions in older australians[J].Am J Hypertension,2014,27:1191-1198.

Association of the polymorphism of angiotensinogen gene M235T leukoaraiosis

SUNLiwei,ZHOUWeidong,LIUChenghao,etal.

(DepartmentofNeurology,ChinaMeitanGeneralHospital,Beijing100028,China)

ObjectiveTo study the relationship between polymorphisms of angiotensinogen AGT(M235T)gene and leukoaraiosis.MethodsA case control study was carried out using 202 cases of leukoaraiosis(LA group) and 105 cases of control.The M235T polymorphisms gene were determined by polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (PFLP) technique and sequenom system test.ResultsThere was a statistical difference in AGT MT genotypes and T alleles frequency between leukoaraiosis group and control subjects.The difference of AGT TT genotypes between the two groups had no statistical significance.ConclusionThe mutation of AGT MT genotypes and T alleles frequency may be associated with leukoaraiosis.

Leukoaraiosis;Gene polymorphism;Angiotensinogen;Cerebral small vessel disease

1003-2754(2016)04-0303-04

2016-02-13；

2016-03-30

首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項(xiàng)(No.2011-6011-01)

(1.煤炭總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100028；2.煤炭總醫(yī)院影像科，北京 100028)

周衛(wèi)東，E-mail：mtzyyneuro@163.com

R742

A