木糖醇對大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)和起泡特性的影響

潘明喆，李 斌，孟憲軍，*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110161；2.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

木糖醇對大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)和起泡特性的影響

潘明喆1，2，李 斌1，孟憲軍1，*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110161；2.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

研究添加不同質(zhì)量分數(shù)木糖醇時大豆分離蛋白的結(jié)構(gòu)、溶解性、表面疏水性、內(nèi)源熒光強度以及起泡特性的變化情況，以期更加深入了解木糖醇對大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性的影響。結(jié)果表明：在木糖醇的作用下，大豆分離蛋白的溶解性增加，而表面疏水性和內(nèi)源熒光強度降低，原來暴露的酪氨酸和色氨酸殘基則被包裹到分子內(nèi)部。同時，大豆分離蛋白的結(jié)構(gòu)也發(fā)生了改變，其二級結(jié)構(gòu)變得更加有序、致密。由于大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)的變化，其起泡能力受到抑制。另外，木糖醇使大豆分離蛋白溶液的表觀黏度增加，有利于提高其泡沫穩(wěn)定性。

大豆分離蛋白；木糖醇；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；起泡特性

潘明喆， 李斌， 孟憲軍. 木糖醇對大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)和起泡特性的影響［J］. 食品科學， 2016， 37（15）: 63-68. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201615011. http://www.spkx.net.cn

PAN Mingzhe， LI Bin， MENG Xianjun. Effect of xylitol on structural and foaming properties of soy protein isolate［J］. Food Science，2016， 37（15）: 63-68. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615011. http://www.spkx.net.cn

大豆蛋白是一種優(yōu)質(zhì)廉價的動物蛋白質(zhì)替代資源，隨著人們對大豆蛋白功能性質(zhì)及營養(yǎng)特征的了解不斷加深，其被廣泛應用于各類食品的開發(fā)中［1-2］。大豆蛋白在諸多方面的應用與其所特有的功能性質(zhì)如溶解性、起泡特性、乳化穩(wěn)定性和增稠性等有著緊密的聯(lián)系。將大豆蛋白用于肉類食品、焙烤食品、冰淇淋、休閑食品的生產(chǎn)加工，可以改善和提高產(chǎn)品的質(zhì)地和穩(wěn)定性［3］。在食品中，大豆蛋白能否充分發(fā)揮其所具有的功能特性，取決于其在食品中的結(jié)構(gòu)和濃度、溶解大豆蛋白的溶液組成，以及食品的生產(chǎn)工藝。進一步研究以上因素對大豆蛋白功能特性的影響，對提高大豆蛋白食品的品質(zhì)十分有益［4-5］。

許多食品在生產(chǎn)過程中除了使用大豆蛋白，還會添加一些小分子水溶性的中性助溶劑，如糖和糖醇類化合物［5］。糖醇是非糖甜味劑，作為食糖的替代物能夠用于食品的生產(chǎn)［6］。例如，木糖醇和山梨醇可以用于生產(chǎn)無糖和預防齲齒的食品［7-8］。許多研究表明，糖醇化合物能夠改變、提高蛋白質(zhì)的構(gòu)型和功能特性，例如熱穩(wěn)定性、膠凝性、起泡特性以及乳化穩(wěn)定性等［4，9］，然而，這些化合物對溶液中蛋白質(zhì)特性的改變，則往往與其自身的性質(zhì)例如分子大小、形狀以及分子間的相互作用緊密相關(guān)［10-11］。如果在蛋白質(zhì)溶液中添加合適類型和濃度的糖醇化合物，則可以調(diào)整蛋白質(zhì)在某一方面的功能特性。例如，Conti等［12］的研究表明添加質(zhì)量分數(shù)20%的山梨醇能夠顯著提高蛋白質(zhì)在等電點附近的溶解性。

目前，有關(guān)糖醇化合物對大豆蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性影響的研究報道并不多見。因此，本實驗擬采用凱氏定氮法、8-苯胺基-1-萘磺酸鈉（1-naphthalenesulfonicacid-8-（phenylamino）-sodiumsalt，ANS）熒光探針法、紫外吸收光譜、熒光光譜以及圓二色光譜（circular dichroism，CD）檢測方法，研究添加不同質(zhì)量分數(shù)木糖醇時大豆蛋白溶解性、疏水性、結(jié)構(gòu)以及起泡能力和泡沫穩(wěn)定性的變化情況，從而探究木糖醇對大豆蛋白結(jié)構(gòu)和起泡特性的影響。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

大豆東農(nóng)46由東北農(nóng)業(yè)大學大豆研究所提供。

ANS 美國Sigma公司；甘露醇、山梨醇、木糖醇阿拉丁試劑公司；Lowry法蛋白質(zhì)含量測定試劑盒上海荔達生物公司；其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

AllegraTM64R離心機 美國Beckman公司；PHS-3C型pH計 上海雷磁公司；DU800紫外-可見分光光度計 美國Beckman公司；F4500熒光分光光度計 日本Hitachi公司；J-815圓二色光譜儀 日本Jasco公司；T18基本型分散機 德國IKA公司。

1.3方法

1.3.1大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）的制備

參考Jiang Jiang等［13］的方法，略有改動：以東農(nóng)46大豆種子為原料，經(jīng)搗碎脫皮、去胚芽得到豆瓣。豆瓣經(jīng)磨粉機粉碎后過80 目篩。在室溫條件下，再按1∶4（m/V）的料液比與正己烷混合脫脂，如此重復3 次，得脫脂豆粉。將脫脂豆粉按1∶15（m/V）的料液比與去離子水混合，用2 mol/L NaOH調(diào)pH值至8.0，攪拌1.5 h后，將其懸浮液4 ℃、10 000×g離心30 min，取上清液用2 mol/L HCl調(diào)pH值至4.5。靜置后4 ℃、6 000×g離心30 min。水洗沉淀2 次，取蛋白沉淀分散于水中并用 2 mol/L NaOH調(diào)pH值至7.0。最后4 ℃、10 000×g離心30 min除去少量雜質(zhì)，冷凍干燥后置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2SPI溶液的配制

參考Chen Haiying等［14］的方法，略有改動：在室溫（22±2） ℃條件下，稱取一定質(zhì)量的大豆分離蛋白（SPI）凍干樣品，溶解在pH 7.0、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液中，經(jīng)磁力攪拌2 h（確保充分溶解），配制成質(zhì)量分數(shù)為5%的蛋白原溶液。將木糖醇溶解到緩沖溶液中，磁力攪拌30 min，配制成質(zhì)量分數(shù)為40%木糖醇原溶液。然后將適量的木糖醇原液緩慢添加到SPI溶液中，再充分混勻，最終配制成含有1% SPI和不同質(zhì)量分數(shù)（0%、2.5%、5%、7.5%、10%、15%、20%）木糖醇的溶液。

1.3.3溶解度的測定

參考Lee等［15］的方法，略有改動：參照1.3.2節(jié)方法制備SPI以及SPI和木糖醇溶液，20 ℃、10 000×g離心20 min后，用凱氏定氮法測定上清液（可溶部分）的蛋白含量（N含量×6.25）。上清液的蛋白含量與樣品蛋白總含量的比值即為溶解度，其計算公式如下。

1.3.4蛋白質(zhì)表面疏水性的測定

參考Kato等［16］的方法，略有改動：采用0.01 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液將樣品的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度稀釋到0.01～0.1 mg/mL之間。取不同質(zhì)量濃度的稀釋樣品5 mL，加入25 μL的ANS溶液（用pH 7.0、0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液配制成8 mmol/L的溶液），振蕩均勻。采用日立F4500熒光分光光度計，在激發(fā)和發(fā)射波長分別為390 nm和470 nm、激發(fā)和發(fā)射狹縫寬均為5 nm條件下，測定樣品的熒光強度（fluorescence intensity，F(xiàn)I）。以熒光強度對蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度作圖，曲線初始階段的斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性指數(shù)。

1.3.5蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光分析

參考Zhang Jing等［17］的方法，略有改動：采用0.01 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液將樣品的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度稀釋到0.1 mg/mL。采用日立F4500熒光分光光度計，在激發(fā)波長為280 nm、激發(fā)和發(fā)射狹縫寬均為5 nm條件下，測定300～400 nm波長范圍內(nèi)的發(fā)射光譜。

1.3.6紫外吸收光譜掃描

參考Jiang Jiang等［13］的方法，略有改動：用0.01 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液將樣品的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度稀釋到0.1 mg/mL。采用貝克曼DU800紫外-可見分光光度計進行掃描，獲得樣品在270～310 nm波長范圍內(nèi)的紫外光譜。所得的紫外光譜經(jīng)Origin軟件處理得到二級衍生紫外光譜。

1.3.7圓二色光譜分析

采用0.01 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液將樣品的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度稀釋到0.1 mg/mL。采用Jasco-815圓二色光譜儀在25 ℃條件下測定樣品在遠紫外區(qū)域（190～250 nm）的CD光譜。以0.01 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液為空白，掃描速率、間隔時間、寬度以及最小間隔度分別為100 nm/min、0.25 s、1.0 nm、0.2 nm。掃描5 次，取平均值得到最終的CD光譜，以平均殘基摩爾橢圓率（［θ］/（deg?cm2/dmol））表示［13］。

1.3.8起泡特性的測定

參照Flanagan等［18］的方法，略有改動：SPI的起泡能力采用泡沫膨脹率（foam expansion，F(xiàn)E）來表示。在室溫條件下，將50 mL質(zhì)量分數(shù)1%的大豆蛋白溶液置于250 mL的量筒中，采用IKA T18分散機（set=5）分散2 min。將制備的泡沫樣品小心轉(zhuǎn)移至預先稱質(zhì)量的50 mL量筒中并除去頂端多余的泡沫。稱量相同體積條件下的泡沫質(zhì)量。然后將稱質(zhì)量的泡沫放置30 min。這一期間排放出的液體小心地從量筒中轉(zhuǎn)移出來，并對剩余的泡沫和量筒進行稱質(zhì)量。按照公式（2）、（3）計算泡沫膨脹率和泡沫穩(wěn)定性（foam stability，F(xiàn)S）。

式中：ms為50 mL蛋白質(zhì)溶液的質(zhì)量/g；mf為50 mL泡沫的質(zhì)量/g；md30為放置30 min后泡沫的質(zhì)量/g。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗中每組數(shù)據(jù)均重復測定3次，采用SPSS V20.0軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，采用Origin 8.0軟件作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1木糖醇對大豆分離蛋白溶解性的影響

圖1　不同質(zhì)量分數(shù)木糖醇在pH 5.0（A）、7.0（B）時對大豆分離蛋白溶解性的影響Fig. 1 Effect of xylitol concentration on the solubility of SPI in aqueous medium at pH 5.0 （A） and 7.0 （B）

SPI的溶解性用相對值（C/C0）表示，由圖1可知，15%木糖醇分別使pH 5.0和pH 7.0條件下SPI的溶解度增加了約66%和12%。如果繼續(xù)增加木糖醇的質(zhì)量分數(shù)，在兩種pH值條件下SPI的溶解度則進一步增大，但是增加的趨勢并不顯著（P＞0.05）。在所研究的質(zhì)量分數(shù)范圍內(nèi)，木糖醇質(zhì)量分數(shù)為20%時，SPI的溶解度最大。以上結(jié)果表明，木糖醇對SPI溶解性的影響隨pH值向等電點接近程度的增大（蛋白質(zhì)分子帶電荷數(shù)量減少）而增大。這一結(jié)果與Antipova等［19］對蠶豆球蛋白的研究結(jié)果相似。SPI溶解性的增加可能是由于木糖醇與蛋白質(zhì)分子在溶液中能直接形成多個氫鍵，使蛋白質(zhì)分子周圍形成額外的親水層。新形成的親水層能夠增強蛋白質(zhì)分子的水化作用，從而使蛋白質(zhì)的溶解性增加［20］。

2.2木糖醇對大豆分離蛋白表面疏水性的影響

圖2　不同質(zhì)量分數(shù)木糖醇對大豆分離蛋白表面疏水性的影響Fig. 2 Effect of xylitol concentration on the surface hydrophobicity of SPI

不同質(zhì)量分數(shù)木糖醇對SPI表面疏水性的影響如圖2所示。在木糖醇的作用下，SPI的表面疏水性明顯減?。≒＜0.05）。20%的木糖醇使SPI的表面疏水性指數(shù)由259減少到180。木糖醇質(zhì)量分數(shù)為2.5%～5%時，SPI的表面疏水性變化不明顯（P＞0.05）。木糖醇質(zhì)量分數(shù)為5%～15%時，SPI的表面疏水性則隨木糖醇質(zhì)量分數(shù)的增大而逐漸降低（P＜0.05）。如果繼續(xù)增加木糖醇質(zhì)量分數(shù)至20%時，其SPI表面疏水性繼續(xù)降低，但差異并不顯著（P＞0.05）。SPI表面疏水性的減小，一方面可能是由于木糖醇與蛋白質(zhì)分子在溶液中能夠直接形成多個氫鍵，使蛋白質(zhì)分子表面形成了緊密的木糖醇分子層，這樣可導致蛋白質(zhì)分子的表面親水性增加，而其表面疏水性則減少［21］。另一方面，則可能是由于在木糖醇的作用下，蛋白質(zhì)分子表面結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，表面疏水區(qū)域轉(zhuǎn)移到分子內(nèi)部，使ANS探針的結(jié)合位點減少，從而呈現(xiàn)為表面疏水性降低［22-23］。這一結(jié)果則表明木糖醇可能會導致蛋白結(jié)構(gòu)變得更加緊密，同時也暗示了其三級結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定程度的變化。

2.3木糖醇對大豆分離蛋白內(nèi)源熒光光譜的影響

圖3為SPI在不同質(zhì)量分數(shù)木糖醇溶液中的內(nèi)源熒光發(fā)射光譜。當激發(fā)光波長為280 nm時，反映了酪氨酸（Tyr）和色氨酸（Trp）殘基的熒光發(fā)射光譜［17］。如圖3所示，SPI的最大熒光發(fā)射光波長（λmax）為334 nm。在不同質(zhì)量分數(shù)的木糖醇作用下，λmax從334 nm減小到333 nm，發(fā)生輕微的藍移。同時，熒光強度（FI）呈現(xiàn)出減少的趨勢。20%木糖醇使SPI的FI從2 097減少至1 685。此變化情況與SPI的表面疏水性變化結(jié)果（采用ANS熒光探針）基本一致。以上結(jié)果可以解釋為SPI在受到木糖醇的影響后，Tyr或/和Trp殘基可能被埋藏在蛋白鏈內(nèi)部區(qū)域更加疏水的環(huán)境中［14］。

圖3　添加不同質(zhì)量分數(shù)木糖醇時大豆分離蛋白的熒光發(fā)射光譜Fig. 3 Fluorescence emission spectra of SPI in the presence of xylitol at different concentrations

圖4　添加不同質(zhì)量分數(shù)木糖醇時大豆分離蛋白的紫外二階導數(shù)光譜Fig. 4 Second-derivative UV spectra of SPI in the presence of xylitol at different concentrations

Tyr和Trp在280 nm波長附近處均有特征吸收峰。紫外吸收光譜很難分辨出疊加峰的具體特征。因此，采用紫外二階導數(shù)光譜對蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)以及兩種芳香族氨基酸微環(huán)境的變化進行分析［24］。如圖4所示，SPI的紫外二階導數(shù)光譜在280～300 nm波長范圍內(nèi)有兩個最大值（289、296 nm）和兩個最小值（285、291 nm）。一般認為，296 nm波長處的紫外吸收峰為Trp殘基的特征吸收峰［13］。在木糖醇的作用下，SPI在296 nm波長處的特征吸收峰發(fā)生1～2 nm的紅移。這一結(jié)果則表明Trp殘基的微環(huán)境可能變得更加疏水［25］。此外，在紫外二階導數(shù)光譜中峰-谷間縱向距離a和b值發(fā)生了不同的變化。隨著木糖醇質(zhì)量分數(shù)的增加，a值減小而b值的幾乎沒有變化，導致“r=a/b”呈現(xiàn)出減小的趨勢。例如，20%木糖醇使“r”值從0.90減少到0.79，“r”值的減少則表明Tyr殘基的微環(huán)境可能變得更加疏水［25］。以上結(jié)果可能是由于在木糖醇的作用下，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)變得更加緊密，原來暴露的Tyr和Trp殘基被包裹到了分子內(nèi)部更加疏水的區(qū)域［13，25］。紫外二階導數(shù)光譜所提供的信息與表面疏水性和內(nèi)源熒光光譜的分析結(jié)果基本一致。

圖5　添加不同質(zhì)量分數(shù)木糖醇時大豆分離蛋白的遠紫外圓二色光譜Fig. 5 Circular dichroism spectra in the far-UV region of SPI in the presence of xylitol at different concentrations

2.5木糖醇對大豆分離蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響圖5為SPI在不同質(zhì)量分數(shù)木糖醇溶液中的遠紫外圓二色光譜。SPI在遠紫外光區(qū)194、209 nm波長附近有一個正峰和負峰，分別代表β-折疊和α-螺旋結(jié)構(gòu)［26］。這種光譜為典型α+β蛋白質(zhì)的圓二色光譜［27］。在木糖醇的作用下，SPI在194 nm和209 nm波長附近正峰和負峰的摩爾橢圓率均有所增加（圖5）。這表明蛋白質(zhì)分子中的β-折疊和α-螺旋結(jié)構(gòu)增多［28］。一般而言，蛋白質(zhì)分子中的α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)往往被包埋在多肽鏈的內(nèi)部位。由于有序結(jié)構(gòu)（α-螺旋+β-折疊）增加，木糖醇可能會導致蛋白質(zhì)分子呈現(xiàn)出更加致密的結(jié)構(gòu)［29］。這一結(jié)果可能是由于木糖醇與蛋白質(zhì)分子在溶液中形成多個氫鍵，這在某種程度上使得蛋白質(zhì)分子內(nèi)原有的相互作用發(fā)生改變，從而導致其分子結(jié)構(gòu)更加緊密［20］。

2.6木糖醇對大豆分離蛋白起泡特性的影響

圖6　不同質(zhì)量分數(shù)木糖醇對大豆分離蛋白泡沫膨脹率（FE）和泡沫穩(wěn)定性（FSS）的影響Fig. 6 Effect of xylitol concentration on the foam expansion （FE） and foam stability （FS） of SPI

SPI溶液的起泡特性采用泡沫膨脹率（FE）和泡沫穩(wěn)定性（FE）兩個指標進行表征。不同木糖醇質(zhì)量分數(shù)條件下SPI溶液的FE和FS如圖6所示。在木糖醇的作用下，SPI溶液的FE值呈現(xiàn)出明顯減少的趨勢（P＜0.05）。木糖醇質(zhì)量分數(shù)為20%時，F(xiàn)E值由1 099%降低至709%。這一結(jié)果表明木糖醇對SPI的起泡能力產(chǎn)生了不利的影響。SPI起泡能力的降低可能與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的變化有關(guān)。結(jié)構(gòu)松散和柔性較高的蛋白質(zhì)分子往往更容易在空氣-水界面擴散和吸附，從而有利于泡沫的形成。在木糖醇的作用下，SPI的結(jié)構(gòu)更加緊密、柔性減小，這樣可能會對泡沫的形成產(chǎn)生負面的影響［30-31］。此外，較低的表面疏水性不利于蛋白質(zhì)溶液表面張力的下降，使泡沫的形成受到抑制。因此，在木糖醇的作用下SPI表面疏水性的減少可能會成為導致蛋白質(zhì)溶液起泡能力降低的又一個重要因素［30-31］。

此外還可以發(fā)現(xiàn)，在木糖醇的作用下，SPI溶液的FS值呈現(xiàn)明顯增加趨勢（P＜0.05）。木糖醇質(zhì)量分數(shù)為20%時，F(xiàn)S值由43%增加到57%。這一結(jié)果表明木糖醇對SPI溶液的泡沫穩(wěn)定性產(chǎn)生了積極的影響。產(chǎn)生上述結(jié)果的原因可能是由于蛋白質(zhì)溶液表觀黏度的增加（數(shù)據(jù)未顯示），使泡沫體系的流動性降低，減緩了液體的排放速率，從而導致蛋白質(zhì)溶液的泡沫穩(wěn)定性增大［32］。

3　結(jié) 論

綜合上述分析結(jié)果，可以得出以下結(jié)論：在木糖醇的作用下，大豆分離蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變。其中，α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)增多，大豆蛋白的二級結(jié)構(gòu)變得更加有序、致密。鑒于不同木糖醇質(zhì)量分數(shù)條件下大豆分離蛋白構(gòu)象的改變以及表面疏水性的降低，其蛋白質(zhì)溶液的起泡能力受到一定程度的抑制。同時，木糖醇能夠增加大豆分離蛋白溶液的表觀黏度，其泡沫的穩(wěn)定性也相應增強。

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Effect of Xylitol on Structural and Foaming Properties of Soy Protein Isolate

PAN Mingzhe1，2， LI Bin1， MENG Xianjun1，*
（1. College of Food Science， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110161， China；2. College of Food Science， Northeast Agricultural University， Harbin 150030， China）

The effect of xylitol （0%-20%） on structural and functional properties of soy protein isolate （SPI） in phosphate buffer solution was studied by assessment of solubility， surface hydrophobicity， intrinsic fluorescence intensity， secondary conformational stability and foaming properties. The results showed that xylitol increased the solubility and decreased the surface hydrophobicity and intrinsic fluorescence intensity of SPI， resulting in encasement of the tyrosine and tryptophan residues initially exposed inside the protein molecule. In the presence of added xylitol， SPI exhibited a more compact and periodical secondary structure. These structural modifications， consequently， led to impaired foamability of SPI. In addition，an increase in the viscosity of SPI could be advantageous for enhancing its foam stability.

soy protein isolate； xylitol； protein structure； foaming properties

10.7506/spkx1002-6630-201615011

TS201.2

A

1002-6630（2016）15-0063-06

2016-01-19

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2014BAD22B01）

潘明喆（1979—），男，講師，碩士，主要從事糧食、油脂及植物蛋白研究。E-mail：pmz_1223.student@sina.com

孟憲軍（1960—），男，教授，博士，主要從事果蔬深加工與功能性食品研究。E-mail：mengxjsy@126.com

引文格式：