重組大腸桿菌產(chǎn)脂肪氧合酶發(fā)酵條件優(yōu)化

和玉軍，張 充，錢 輝，陸兆新，別小妹，趙海珍，呂鳳霞

（南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

重組大腸桿菌產(chǎn)脂肪氧合酶發(fā)酵條件優(yōu)化

和玉軍，張 充，錢 輝，陸兆新，別小妹，趙海珍，呂鳳霞*

（南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

為進一步提高重組大腸桿菌（pET-23a-pse-LOX）產(chǎn)脂肪氧合酶（lipoxygenase，LOX）的酶活力，利用響應(yīng)面法對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化。通過單因素試驗確定誘導(dǎo)時機、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度、接種量、培養(yǎng)基初始pH值和裝液量對其發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。在此基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman試驗設(shè)計從7 個因素中篩選出對LOX產(chǎn)量具有顯著效應(yīng)的因素為誘導(dǎo)時機、誘導(dǎo)時間和培養(yǎng)基初始pH值，并利用Box-Behnken試驗設(shè)計和響應(yīng)曲面法分析以確定其產(chǎn)酶的最優(yōu)發(fā)酵條件，即誘導(dǎo)時機為菌液OD600nm達到1.6、誘導(dǎo)時間34 h、培養(yǎng)基初始pH 7.0。在此條件下，LOX酶活力為（21 261.60±264.03） U/mL，比優(yōu)化前的（13 553.96±46.64） U/mL提高了56.87%。

脂肪氧合酶；發(fā)酵條件；響應(yīng)面法；Plackett-Burman試驗設(shè)計

和玉軍， 張充， 錢輝， 等. 重組大腸桿菌產(chǎn)脂肪氧合酶發(fā)酵條件優(yōu)化［J］. 食品科學， 2016， 37（15）: 149-155. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201615025. http://www.spkx.net.cn

HE Yujun， ZHANG Chong， QIAN Hui， et al. Optimization of fermentation conditions for lipoxygenase production by recombinant Escherichia coli［J］. Food Science， 2016， 37（15）: 149-155. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201615025. http://www.spkx.net.cn

脂肪氧合酶（lipoxygenase，LOX，EC 1.13.11.12），屬于氧化還原酶［1］，是一類含有非血紅素鐵，能夠?qū)Ｒ淮呋趸衏is， cis-1，4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多元不飽和脂肪酸，形成具有共軛雙鍵的脂肪酸氫過氧化物的雙加氧酶［2］。這種不穩(wěn)定的氫過氧化物能氧化面筋蛋白質(zhì)形成二硫鍵，使蛋白質(zhì)分子聚合，從而達到增強面筋的作用［3］，同時LOX還可以通過偶合反應(yīng)破壞類胡蘿卜素的雙鍵結(jié)構(gòu)，起到漂白面粉的作用［4］。由于LOX兼具面粉強筋和漂白的功效，具有替代化學面粉品質(zhì)改良劑的潛力，已引起國內(nèi)外學者廣泛關(guān)注。目前，市場上商品級LOX多以大豆粉作為酶源，但大豆粉含有多種同工酶，存在成分復(fù)雜、效果不佳等缺點［5］，限制其在食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用。

通過LOX基因的克隆與異源表達，獲得質(zhì)量穩(wěn)定、產(chǎn)量高、成本低的LOX是可以解決上述問題的。其中，來源于植物、動物等真核生物的LOX基因已經(jīng)在大腸桿菌［6］（Escherichia coli，E. coli）、釀酒酵母［7］（Saccharomyces cerevisiae）和畢赤酵母［8-9］（Pichia pastoris）中實現(xiàn)重組表達，但總體產(chǎn)酶水平不高。原核生物來源的LOX異源表達同樣面臨表達量低、難分泌至胞外等問題［10］。目前僅有藍細菌（Cyanobacterium）、念珠藻（Nostoc punctiforme）［11］、銅綠假單胞菌［12-13］（Pseudomonas aeruginosa）和魚腥藻［14-15］（Anabaena）來源的原核生物LOX基因 實現(xiàn)了在E. coli、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）中異源表達，但產(chǎn)酶水平仍然不高。陸信曜等［13，16］將P. aeruginosa的LOX在大腸桿菌中表達，獲得了分泌LOX的重組大腸桿菌，并對其發(fā)酵過程進行初步優(yōu)化，胞外酶活力為8.4 U/mL。張充等［14，17］克隆魚腥藻Anabaena sp. PCC 7120基因組中LOX基因，構(gòu)建了原核重組表達載體，胞內(nèi)LOX活力達6 750 U/mL，并轉(zhuǎn)化B. subtilis WB800，實現(xiàn)LOX在食品級表達系統(tǒng)的異源分泌表達。在此基礎(chǔ)上，章棟梁等［18］對重組枯草芽孢桿菌的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，胞外酶活力最高為167.32 U/mL。

雖然有關(guān)LOX基因的克隆與異源表達的研究已很多，包括胞內(nèi)和胞外表達，但LOX產(chǎn)量仍不是很高。為了提高LOX的產(chǎn)量，本研究以實驗室構(gòu)建的一株重組大腸桿菌為出發(fā)菌株，首先通過單因素試驗確定不同因子對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，并利用Plackett-Burman設(shè)計篩選出對LOX產(chǎn)量具有顯著效應(yīng)的關(guān)鍵因子，然后利用響應(yīng)曲面法對其進行優(yōu)化，旨在提高LOX產(chǎn)量，為工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1菌種、培養(yǎng)基與試劑

重組大腸桿菌pET-23a-pse-LOX，由南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院酶工程研究室構(gòu)建。

LB培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10、酵母提取物5、NaCl 10，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：大豆蛋白胨25、酵母浸膏15、甘油6、KH2PO45、MgSO4?7H2O 2、MnCl2?4H2O 0.05，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

胰蛋白胨、酵母提取物 青島生工生物科技有限公司；氨芐青霉素（ampicillin，Amp）、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）北京索萊寶科技有限公司；亞油酸 美國Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

Orion 3 STAR pH計 美國Thermo公司；SX-700高壓蒸汽滅菌器 日本TOMY公司；SW-CJ-IBU超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HYG-A全溫搖瓶柜 太倉市實驗設(shè)備廠；Centrifuge 5804R冷凍離心機 德國Eppendorf公司；JY91ⅡDN超聲波破碎儀寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-2600紫外-可見分光光度計 日本島津公司；GXZ-9240MBE鼓風干燥箱上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3方法

1.3.1菌種活化

將甘油管保藏的重組菌（-70 ℃）轉(zhuǎn)接到LB平板上，37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)，待平板上長出單菌落后，將單菌落轉(zhuǎn)接至盛有50 mL LB培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h左右至對數(shù)期備用。

1.3.2搖瓶培養(yǎng)

將培養(yǎng)好的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)至一定菌體密度后在設(shè)定的發(fā)酵條件下進行培養(yǎng)。

1.3.3菌體密度與菌體干重的測定

將一定體積的發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min后棄上清，菌體用蒸餾水洗滌1～2 次，再用蒸餾水復(fù)溶后以蒸餾水為空白測定菌體密度OD600nm，同時將菌液在相同條件下離心、洗滌后，將其放置在105 ℃的干燥箱中恒溫干燥至恒質(zhì)量（Δm≤0.3 mg），繪制菌體干重與菌體密度的標準曲線。

1.3.4重組脂肪氧合酶的制備

發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵液在8 000 r/min離心10 min，收集菌體，用磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、0.3 mol/L NaCl和體積分數(shù)0.5% Triton X-100混合制備）重懸菌體，超聲波破碎菌體（400 W，超聲1 s，停頓2 s，共超聲30 min），4℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液作為粗酶液［19］。

1.3.5酶活力的測定

亞油酸底物的制備［20］：取25 μL吐溫-20分散于8 mL脫氧蒸餾水中，混勻后加入27 μL亞油酸，充分混勻，避免產(chǎn)生氣泡，用1.1 mL 0.5 mol/L的NaOH溶液使其澄清，定容到50 mL容量瓶中，4 ℃條件下保存?zhèn)溆?。酶活力測定反應(yīng)體系為：pH 6.0的磷酸鹽緩沖液2.78 mL，酶液20 μL，亞油酸鈉200 μL，混勻后放入水浴中并開始計時，反應(yīng)3 min測定234 nm波長處的吸光度變化。LOX酶活力定義［21］：35 ℃條件下1 min內(nèi)3 mL反應(yīng)體系在234 nm波長處的吸光度增加0.001作為一個酶活力單位U。

1.3.6單因素試驗

1.3.6.1誘導(dǎo)表達條件的確定

根據(jù)菌體生長曲線，分別在不同的菌體生長期（OD600nm=0.4、1.5、2.6、3.4、4.2）添加誘導(dǎo)劑，確定最佳誘導(dǎo)時機；在菌體生長的對數(shù)期添加不同質(zhì)量濃度的誘導(dǎo)劑（10、50、100、200、400 μg/mL），確定誘導(dǎo)劑最適質(zhì)量濃度；在菌體生長的對數(shù)期添加一定濃度誘導(dǎo)劑，分別誘導(dǎo)不同時間（8、16、24、32、40 h），確定適宜的誘導(dǎo)時間；添加誘導(dǎo)劑后，分別在不同溫度條件下（16、25、30、37 ℃）誘導(dǎo)，確定最適誘導(dǎo)溫度。

1.3.6.2接種量對LOX產(chǎn)量及菌體生長的影響

將培養(yǎng)好的種子液按體積分數(shù)分別為1%、3%、5%、7%、9%的接種量接入100 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600nm為1.5左右，添加IPTG使其終質(zhì)量濃度為100 μg/mL，誘導(dǎo)17 h后取出離心、破碎獲得粗酶液，測定酶活力。

1.3.6.3培養(yǎng)基初始pH值對LOX產(chǎn)量及菌體生長的影響

將配制的培養(yǎng)基在滅菌前分別調(diào)節(jié)pH值為5.0、6.0、7.0、8.0，然后在16 ℃誘導(dǎo)17 h，經(jīng)離心、破碎處理后測定粗酶液的酶活力。

1.3.6.4裝液量對LOX產(chǎn)量及菌體生長的影響

在250 mL搖瓶中分別裝入40、60、80、100、120 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，在相同條件下16 ℃誘導(dǎo)17 h后離心收集菌體，破碎后測定上清液酶活力。

1.3.7發(fā)酵條件的Plackett-Burman試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman試驗設(shè)計對發(fā)酵條件的關(guān)鍵因子篩選，其中X1～X4為誘導(dǎo)條件，X5～X7為培養(yǎng)條件，響應(yīng)值為酶活力，每組試驗重復(fù)3 次，取平均值，試驗因素水平及代碼見表1。

表1　Plackett-Burman試驗設(shè)計因素水平及代碼Table 1 Levels and codes of variables used for Plackett-Burman experimental design sign

1.3.8響應(yīng)面優(yōu)化試驗

通過Plackett-Burman試驗確定發(fā)酵條件各因素的影響順序，選取前3 個主要影響因素：誘導(dǎo)時機、誘導(dǎo)時間和培養(yǎng)基初始pH值，采用響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計三因素三水平試驗對其進一步優(yōu)化，各因子、代碼及水平見表2。

表2　響應(yīng)面Box-Behnken試驗設(shè)計因素水平及代碼Table 2 Levels and codes of variables used for Box-Behnken response surface methodology

2　結(jié)果與分析

2.1誘導(dǎo)表達條件的確定

2.1.1重組菌最佳誘導(dǎo)時機的確定

通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中測定重組菌的生長曲線，確定其對數(shù)生長期的范圍，分別選取OD600nm為0.4、1.5、2.6、3.4、4.2時添加終質(zhì)量濃度為100 μg/mL的IPTG作為誘導(dǎo)劑，16 ℃誘導(dǎo)17 h后測定LOX酶活力和菌體干重，結(jié)果如圖1所示。

圖1　菌株最佳誘導(dǎo)時機的確定Fig. 1 Determination of the optimal starting time of induction

由圖1可知，在不同時期添加誘導(dǎo)劑都能誘導(dǎo)表達，但LOX的產(chǎn)量相差甚大。當OD600nm達到1.5左右時，添加IPTG進行誘導(dǎo)產(chǎn)酶，酶活力最高，為（18 710.40±278.32） U/mL。當OD600nm繼續(xù)增加，菌體干重下降緩慢，而酶活力明顯下降。

2.1.2誘導(dǎo)劑最適質(zhì)量濃度的確定

分別選擇IPTG的終質(zhì)量濃度為10、50、100、200、400 μg/mL，在菌體生長的對數(shù)期添加后于16 ℃誘導(dǎo)17 h，取出處理后測定LOX酶活力和菌體干重，結(jié)果如圖2所示。

圖2　IPTG最適質(zhì)量濃度的確定Fig. 2 Determination of the optimal concentration of IPTG

由圖2可知，誘導(dǎo)劑質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)時，目的蛋白的表達隨誘導(dǎo)劑質(zhì)量濃度的增加而增加，當超過100 μg/mL時，LOX酶活力反而出現(xiàn)一定的下降，表明過高的誘導(dǎo)劑質(zhì)量濃度對目的蛋白的表達有一定的抑制作用。這可能是由于IPTG的質(zhì)量濃 度過高一方面抑制了菌體生長，另一方面IPTG的劇烈誘導(dǎo)導(dǎo)致目的蛋白合成速率太快，從而在胞內(nèi)形成不溶性包涵體［22］。菌體干重的變化趨勢與酶活力大致相同。

2.1.3誘導(dǎo)時間的確定

在重組菌生長到OD600nm為1.5左右時，加入終質(zhì)量濃度為100 μg/mL的IPTG，在16 ℃條件下分別誘導(dǎo)8、16、24、32、40 h，取樣測定酶活力和菌體干重，結(jié)果如圖3所示。

圖3　IPTG誘導(dǎo)時間的確定Fig. 3 Determination of the induction duration of IPTG

圖4　誘導(dǎo)時間對LOX表達影響的SDS-PAGEE分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis of the effect of induction duratione on LOX expression

由圖3可知，加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)24 h后發(fā)酵液中的酶活力達到最高，為（20 383.12±189.39） U/mL。誘導(dǎo)8 h時，酶活力較低，隨著時間的延長，酶活力逐漸增高，24 h時達到最大，隨后開始緩慢下降。這可能是由于宿主細胞中蛋白酶將異源蛋白降解，使目標蛋白表達水平降低，酶活力下降。菌體干重在整個過程中表現(xiàn)為持續(xù)增長，待誘導(dǎo)24 h左右，生長速率有所下降，表明菌體開始進入穩(wěn)定期。由圖4可知，誘導(dǎo)24 h時對應(yīng)的條帶中目的蛋白的表達量最高，誘導(dǎo)時間過短或者過長都不利于目的蛋白的積累。

2.1.4誘導(dǎo)溫度的確定

溫度是保證微生物生長和產(chǎn)物合成所需各種酶活性的重要條件，同時是影響重組蛋白表達的一個重要因素，因此在發(fā)酵過程中必須控制合適的溫度。本研究分別在16、25、30、37 ℃誘導(dǎo)菌體17 h，LOX酶活力和菌體干重的結(jié)果如圖5所示。

圖5　誘導(dǎo)溫度的確定Fig. 5 Determination of the optimal induction temperature

由圖5可知，采用16 ℃低溫誘導(dǎo)表達，酶活力最高為（19 612.80±172.00） U/mL，而溫度較高時，LOX的表達受到明顯抑制，30 ℃和37 ℃條件下的酶活力基本為零。菌體干重變化不大，隨著溫度升高，25 ℃后基本無顯著差異。這表明低溫誘導(dǎo)更有利于重組菌表達目的蛋白，這可能是因為高溫下質(zhì)粒穩(wěn)定性降低以及重組酶的合成速率太快而在胞內(nèi)形成包涵體［23］。

通過單因素試驗確定重組菌誘導(dǎo)表達條件，即誘導(dǎo)時機OD600nm達到1.5，IPTG質(zhì)量濃度為100 μg/mL，誘導(dǎo)時間24 h，誘導(dǎo)溫度16 ℃。在此條件下，菌體產(chǎn)生的LOX酶活力更高。

2.2接種量對LOX產(chǎn)量及菌體生長的影響

接種量的大小影響發(fā)酵的產(chǎn)量和發(fā)酵周期。分別將種子液按體積分數(shù)1%、3%、5%、7%、9%的接種量接入100 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，結(jié)果如圖6所示。

圖6　接種量對LOX產(chǎn)量及菌體生長的影響Fig. 6 Effect of inoculum size on cell growth and LOX production

由圖6可知，無論是LOX酶活力還是菌體干重，在接種量為5%時兩者均最高，接種量太低或者太高都不利于重組菌的生長和外源基因的表達。

2.3培養(yǎng)基初始pH值對LOX產(chǎn)量及菌體生長的影響

培養(yǎng)基的初始pH值對LOX產(chǎn)量及菌體生長的影響很大，發(fā)酵過程中需要維持一定的pH值以保證微生物的正常代謝。在配制發(fā)酵培養(yǎng)基后，將初始pH值分別調(diào)至5.0、6.0、7.0和8.0進行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后測定其LOX酶活力和菌體干重，結(jié)果如圖7所示。

圖7　培養(yǎng)基初始pH值對LOX產(chǎn)量及菌體生長的影響Fig. 7 Effect of medium initial pH on cell growth and LOX production

由圖7可知，培養(yǎng)基的初始pH值對菌體生長及產(chǎn)酶影響顯著，兩者趨勢基本一致，都呈現(xiàn)出先迅速上升，在pH 7.0時LOX酶活力和菌體干重達最大，分別為（22 780.80±123.55） U/mL和（5.336±0.020） g/L，隨后兩者都開始降低。因此，培養(yǎng)基的初始pH值應(yīng)控制在7.0。

2.4裝液量對LOX產(chǎn)量及菌體生長的影響

大腸桿菌屬于兼性厭氧菌，氧氣的供應(yīng)常常是發(fā)酵實驗?zāi)芊癯晒Φ闹匾拗埔蛩刂?，而裝液量是影響溶解氧的一個重要因素。

圖8　裝液量對LOX產(chǎn)量及菌體生長的影響Fig. 8 Effect of medium volume on cell growth and LOX production

由圖8可知，LOX酶活力隨著裝液量增加先上升后逐漸降低，當裝液量為60 mL/250 mL時，最有利于重組菌產(chǎn)酶。菌體干重在裝液量為40 mL/250 mL時最高，隨著裝液量的增加，菌體干重持續(xù)降低。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是隨著裝液量增加，發(fā)酵液與空氣的接觸面積相對減小，搖瓶發(fā)酵系統(tǒng)的供氧能力下降；同時隨搖瓶裝液量增加，單位體積發(fā)酵液中的溶氧降低更為明顯，因此發(fā)酵液中溶氧過低阻 礙細胞生長和外源蛋白的表達；另外還會導(dǎo)致底物的不完全氧化產(chǎn)生多種有機酸，如乙酸等，這些因素都有可能影響LOX的表達及菌體生長［24］。2.5 發(fā)酵條件的Plackett-Burman試驗

采用Plackett-Burman試驗對影響發(fā)酵產(chǎn)酶的7 個因素進行篩選，試驗結(jié)果及預(yù)測值見表3，顯著性分析結(jié)果見表4。

表3　Plackett-Burman試驗設(shè)計結(jié)果及預(yù)測值Table 3 Plackett-Burman experimental design with actual and predicted values of LOX activity

表4　Plackett-Burman試驗設(shè)計方差分析及其顯著性檢驗Table 4 Analysis of variance and significance test of Plackett-Burman experimental design model

由表4可知，試驗?zāi)Ｐ蜆O顯著（P=0.000 9），對重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶具有顯著影響的因子包括誘導(dǎo)時機、誘導(dǎo)劑質(zhì)量濃度、誘導(dǎo)時間、接種量和培養(yǎng)基初始pH值，其中誘導(dǎo)時機、誘導(dǎo)時間和培養(yǎng)基初始pH值的影響極顯著（P＜0.01），而誘導(dǎo)溫度和裝液量的影響是不顯著的。在上述5 個具有顯著影響的因子中，誘導(dǎo)時機、誘導(dǎo)劑質(zhì)量濃度和誘導(dǎo)時間均為正效應(yīng)，所以在后續(xù)的響應(yīng)面試驗設(shè)計中應(yīng)將其中心點適當上移，而接種量和培養(yǎng)基初始pH值為負效應(yīng)，說明它們在水平下限時更有利于重組菌產(chǎn)酶，中心點應(yīng)適當下移。

2.6響應(yīng)面試驗

2.6.1預(yù)測模型建立及顯著性檢驗

根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果，選取誘導(dǎo)時機、誘導(dǎo)時間和培養(yǎng)基初始pH值為試驗因素，以LOX酶活力Y為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計響應(yīng)面試驗，試驗設(shè)計結(jié)果及預(yù)測值見表5。利用Design-Expert分析軟件對表5中的數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到回歸方程為：Y=21 900.78+ 1 894.86A+1 637.21B-499.21C+1 128.60AB-813.78AC+98.50BC-11 938.16A2-6 146.17B2-7 369.81C2。

表5　響應(yīng)面Box-Behnken試驗設(shè)計結(jié)果及預(yù)測值Table 5 Box-Behnken design with actual and predicted values of LOX activity

表6　回歸模型方差分析及其顯著性檢驗Table 6 Analysis of variance and significance test of Box-Behnken regression model

由表6可知，該模型達到極顯著水平（P＜0.000 1），失擬項（P=0.993 0＞0.05）極不顯著，表明試驗數(shù)據(jù)與模型擬合度較高。通過P檢驗，一次項A、B及二次項A2、B2和C2對酶活力大小有極顯著影響，AB、AC對酶活力大小的影響達到顯著水平。模型的校正決定系數(shù)=0.993 7，表明該模型能夠解釋99.37%的變異，決定系數(shù)R2=0.997 2，表明重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶量的實測值與預(yù)測值之間有很好的擬合度。因此，可以用該模型對重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶的條件進行分析和預(yù)測。

2.6.2響應(yīng)面分析

由回歸方程得到誘導(dǎo)時機、誘導(dǎo)時間和培養(yǎng)基初始pH值這3 個因素間交互作用對重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖，如圖9所示。

圖9　各因素交互作用對LOX酶活力的影響Fig. 9 Effects of interactions among experimental factors on LOX activity

由圖9a可知，響應(yīng)面圖的曲面形狀較圓，等高線接近圓形，說明誘導(dǎo)時機與誘導(dǎo)時間對LOX酶活力的交互影響不顯著，同樣，圖9b中誘導(dǎo)時機與培養(yǎng)基初始pH值對LOX酶活力的交互作用不顯著。當誘導(dǎo)時機處于最佳時間點時，誘導(dǎo)時間與培養(yǎng)基初始pH值對LOX酶活力的交互影響如圖9c所示。由于其等高線圖呈橢圓形，所以兩者的交互作用是顯著的。隨著誘導(dǎo)時間的延長和培養(yǎng)基初始pH值的升高，LOX酶活力出現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當誘導(dǎo)時間為34 h，培養(yǎng)基的初始pH值為7.0時，酶活力達到最高。從響應(yīng)面圖中可以看到，誘導(dǎo)時間曲面變化較培養(yǎng)基初始pH值曲面變化更陡，表明誘導(dǎo)時間對于重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響更顯著。

采用Design-Expert軟件分析回歸方程，得到曲面的極值點為誘導(dǎo)時機OD600nm達到1.6、誘導(dǎo)時間34 h、培養(yǎng)基初始pH 7.0，LOX酶活力預(yù)測值為22 108.30 U/mL。為驗證結(jié)果的可靠性，在最佳條件下進行了3 次重復(fù)實驗，LOX酶活力為（21 261.60±264.03） U/mL，與預(yù)測值的相對誤差為3.982%，表明回歸方程擬合度較好，可應(yīng)用于重組大腸桿菌（pET-23a-pse-LOX）產(chǎn)LOX發(fā)酵條件的優(yōu)化。

3　結(jié) 論

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman設(shè)計從7 個因素中篩選出對LOX產(chǎn)量具有顯著影響的3 個因子，即誘導(dǎo)時機、誘導(dǎo)時間和培養(yǎng)基的初始pH值。利用響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計，以LOX酶活為響應(yīng)值，建立三因素三水平的響應(yīng)面模型，通過對其顯著性及交互作用的分析，求解回歸方程，獲得最優(yōu)發(fā)酵條件為誘導(dǎo)時機為發(fā)酵液OD600nm達到1.6、誘導(dǎo)時間34 h、培養(yǎng)基初始pH 7.0，經(jīng)驗證實驗可知LOX酶活力為（21 261.60±264.03） U/mL，與預(yù)測值22 108.30 U/mL基本吻合，比優(yōu)化前的（13 553.96±46.64） U/mL提高了56.87%，脂肪氧合酶的發(fā)酵水平顯著提高，將為LOX工業(yè)化生產(chǎn)和替代化學面粉改良劑溴酸鉀及過氧化苯甲酰提供依據(jù)。

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Optimization of Fermentation Conditions for Lipoxygenase Production by Recombinant Escherichia coli

HE Yujun， ZHANG Chong， QIAN Hui， LU Zhaoxin， BIE Xiaomei， ZHAO Haizhen， L? Fengxia*
（College of Food Science and Technology， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

With the aim to further enhance lipoxygenase （LOX） activity produced by recombinant E. coli， response surface methodology was used to optimize the fermentation conditions. First of all， we explored the effects of starting time of induction， inducer concentration， induction duration， induction temperature， inoculum size， medium initial pH and medium volume on LOX production by single factor tests. Three factors with signifi cant impacts on LOX activity including starting time of induction， induction time and medium initial pH were selected out of these seven factors by using Plackett-Burman design. Simultaneously， the optimal conditions for LOX production were determined by Box-Behnken design and response surface methodology as induction starting at OD600nmof 1.6 and lasting for 34 h and medium initial pH of 7.0. The LOX activity was （21 261.60 ± 264.03） U/mL under these conditions， which was improved by 56.87% than that before optimization， （13 553.96 ± 46.64） U/mL.

lipoxygenase； fermentation conditions； response surface methodology； Plackett-Burman design

10.7506/spkx1002-6630-201615025

TS201.3

A

1002-6630（2016）15-0149-07

2016-03-23

國家自然科學基金面上項目（31470095）；江蘇省科技支撐計劃項目（BE2011390）

和玉軍（1990—），男，碩士研究生，主要從事食品微生物研究。E-mail：2013108059@njau.edu.cn

呂鳳霞（1963—），女，教授，博士，主要從事酶工程研究。E-mail：lufengxia@njau.edu.cn

引文格式：