程　萌　楊淑青　高　民　謝天宇　孫燕勇　胡紅蓮*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018；2.江蘇蒙彼利生物科技有限公司，常州213100;3.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料研究所，呼和浩特010031；4.內(nèi)蒙古圣牧高科牧業(yè)有限公司，呼和浩特010018)

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亞急性瘤胃酸中毒奶山羊瘤胃上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)和通透性的變化

程萌1楊淑青2高民3謝天宇4孫燕勇1胡紅蓮3*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018；2.江蘇蒙彼利生物科技有限公司，常州213100;3.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料研究所，呼和浩特010031；4.內(nèi)蒙古圣牧高科牧業(yè)有限公司，呼和浩特010018)

本試驗(yàn)旨在研究亞急性瘤胃酸中毒(SARA)對(duì)瘤胃上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)和通透性的影響。選用體況良好、體重相近的泌乳期薩能奶山羊9只，隨機(jī)分為3組(對(duì)照組、SARA組、恢復(fù)組，n=3)，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧[非纖維性碳水化合物與中性洗滌纖維比(NFC/NDF)=1.40]，SARA組和恢復(fù)組先后飼喂NFC/NDF為1.40、1.79、2.31、3.23的4種試驗(yàn)飼糧誘導(dǎo)SARA發(fā)生，每種飼喂15 d，恢復(fù)組奶山羊待SARA誘導(dǎo)成功后自由采食青干草30 d。對(duì)照組奶山羊分別在飼養(yǎng)30、60(與SARA組3只同時(shí))和90 d(與恢復(fù)組3只同時(shí))各屠宰1只。采集瘤胃腹囊部上皮組織用于石蠟切片、透射電子顯微鏡觀(guān)察及尤斯灌流系統(tǒng)(Ussing chamber)研究。結(jié)果表明：1)組織切片結(jié)果顯示，瘤胃上皮角質(zhì)層厚度SARA組顯著高于對(duì)照組和恢復(fù)組(P<0.05)，恢復(fù)組顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；顆粒層厚度對(duì)照組顯著高于SARA組和恢復(fù)組(P<0.05)，但SARA組和恢復(fù)組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)；棘突層厚度3組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)；上皮總厚度恢復(fù)組顯著低于對(duì)照組和SARA組(P<0.05)，但對(duì)照組與SARA組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。透射電子顯微鏡結(jié)果顯示，SARA組瘤胃上皮緊密連接被破壞，細(xì)胞間隙增大，棘狀層細(xì)胞線(xiàn)粒體出現(xiàn)降解并出現(xiàn)空泡。2)與對(duì)照組相比，SARA組和恢復(fù)組瘤胃上皮短路電流(Isc)、組織導(dǎo)電性(Gt)和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)流速顯著升高(P<0.05)，跨膜電位差(PD)顯著降低(P<0.05)。綜合得出，SARA破壞了奶山羊瘤胃上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性，使瘤胃上皮通透性增加，導(dǎo)致瘤胃上皮屏障功能長(zhǎng)期受損。

亞急性瘤胃酸中毒；瘤胃上皮；形態(tài)結(jié)構(gòu)；超微結(jié)構(gòu)；通透性

近年來(lái)，隨著集約化養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，為了實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)效率的最大化，高能量飼糧的飼喂模式已成為現(xiàn)代反芻動(dòng)物集約化生產(chǎn)的顯著特征。亞急性瘤胃酸中毒(subacute ruminal acidosis,SARA)正是這種高能量飼喂模式下產(chǎn)生的一種很常見(jiàn)的營(yíng)養(yǎng)代謝性疾病，具有群發(fā)性，對(duì)動(dòng)物健康和養(yǎng)殖效益影響嚴(yán)重。目前已有許多研究表明，當(dāng)反芻動(dòng)物發(fā)生SARA時(shí)，瘤胃內(nèi)環(huán)境發(fā)生紊亂，發(fā)酵異常，微生物菌群結(jié)構(gòu)改變、異常代謝產(chǎn)物如脂多糖(LPS)和組胺累積，加之瘤胃長(zhǎng)期處于低pH環(huán)境，會(huì)引起瘤胃黏膜損傷，瘤胃屏障功能降低，導(dǎo)致一些異常代謝產(chǎn)物和病原微生物通過(guò)破損的瘤胃黏膜移位進(jìn)入血液，進(jìn)一步加重酸中毒引起的瘤胃上皮損傷[1-3]。瘤胃對(duì)反芻動(dòng)物至關(guān)重要，其上皮結(jié)構(gòu)和功能的完整性是瘤胃執(zhí)行消化吸收、屏障等功能的基本保障，對(duì)維護(hù)動(dòng)物健康和高效生產(chǎn)意義重大。瘤胃黏膜上皮通透性通常是指黏膜上皮比較容易被一些物質(zhì)分子以簡(jiǎn)單擴(kuò)散的方式通過(guò)的特性，這一特性的改變可以反映瘤胃黏膜上皮的損傷程度，是檢測(cè)瘤胃黏膜上皮屏障功能受損程度的一項(xiàng)重要指標(biāo)，若黏膜上皮通透性增加則說(shuō)明黏膜完整性被破壞，其屏障功能受損[4]。近年來(lái)的研究表明，SARA可損害瘤胃黏膜結(jié)構(gòu)，使瘤胃壁黏膜出現(xiàn)不同程度的脫落，顯著降低了瘤胃上皮基底層、棘突層、顆粒層和瘤胃上皮的總厚度，使上皮細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)變得疏馳，削弱了瘤胃上皮的屏障功能，引起其通透性增加[5-8]。近期本課題組的研究也發(fā)現(xiàn)，SARA影響了瘤胃黏膜上皮的完整性，使瘤胃上皮角質(zhì)層出現(xiàn)明顯脫落和損傷，瘤胃上皮乳頭長(zhǎng)度、寬度及角質(zhì)層厚度皆顯著降低；同時(shí)SARA使瘤胃黏膜上皮細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達(dá)下調(diào)，顯著減弱了瘤胃上皮細(xì)胞的增殖活性，而瘤胃上皮細(xì)胞出現(xiàn)過(guò)度凋亡，破壞了上皮細(xì)胞增殖與凋亡間的動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致瘤胃上皮屏障功能受損[9]。另有研究表明，飼喂奶牛高精料飼糧可引起瘤胃上皮細(xì)胞之間的細(xì)胞間隙增大，破壞緊密連接，削弱瘤胃上皮的屏障功能[10]。目前在奶牛[5]、綿羊[6]及山羊[7,9]的諸多研究表明：SARA可破壞瘤胃黏膜上皮的完整性，其發(fā)病機(jī)制與瘤胃黏膜屏障功能受損，通透性增加密切相關(guān)，但SARA嚴(yán)重程度不同，對(duì)瘤胃上皮形態(tài)和功能的影響程度也可能有所不同。為此，本研究以奶山羊?yàn)閯?dòng)物模型，以逐漸遞增飼糧非纖維性碳水化合物與中性洗滌纖維比(NFC/NDF)的方式來(lái)誘導(dǎo)奶山羊發(fā)生SARA，通過(guò)觀(guān)察瘤胃上皮組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和通透性的變化，探討SARA對(duì)瘤胃上皮屏障功能的影響，為SARA的深入研究提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

選用9只體況良好，體重35～40 kg，年齡2～3歲，均處于泌乳初期且安裝有瘤胃瘺管的經(jīng)產(chǎn)薩能奶山羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物。試驗(yàn)動(dòng)物單籠飼養(yǎng)，每天08：00和18：00分2次等量飼喂，自由飲水。

1.2試驗(yàn)飼糧

參照NRC(1981)[11]奶山羊營(yíng)養(yǎng)需要及金公亮[12]推薦的《奶山羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行配制。以玉米、豆粕、麥麩、青干草、苜蓿為主要原料，設(shè)計(jì)NFC/NDF分別為1.40、1.79、2.31、3.23的4種試驗(yàn)飼糧，精粗比分別為51∶49、60∶40、68∶32、79∶21。試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1　試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目Items飼糧NFC/NDFDietaryNFC/NDF1．401．792．313．23酸性洗滌纖維ADF21．3317．4914．9510．92鈣Ca0．540．550．550．57磷P0．320．330．330．34鈣磷比Ca∶P1．681．681．681．68精粗比Concentrate∶roughage51∶4960∶4068∶3279∶21

1)每千克預(yù)混料含有One kilogram of premix contained the following：FeSO4·7H2O 6 240 mg，CuSO4·5H2O 300 mg，MnSO4·5H2O 1 560 mg，ZnSO4·7H2O 3 500 mg，CoCl2·6H2O 206 mg，KI 17 mg，NaSeO3130 mg，VA 1 620 000 IU，VD3324 000 IU，VE 540 IU，VK3150 mg，VB120.9 mg，VB5450 mg，泛酸鈣calcium pantothenate 750 mg，葉酸folic acid 15 mg。

2)粗蛋白質(zhì)、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、鈣、磷為實(shí)測(cè)值，其余為計(jì)算值。非纖維性碳水化合物=1-中性洗滌纖維-粗蛋白質(zhì)-粗脂肪-粗灰分。豆科植物的泌乳凈能=[1.044-(0.011 9×酸性洗滌纖維)]×9.29；禾本科植物的泌乳凈能=[1.085-(0.012 4×酸性洗滌纖維)]×9.29。CP, NDF, ADF, Ca and P were measured values, while the others were calculated values. NFC=1-NDF-CP-EE-ash. Leguminous NEL=[1.044-(0.011 9×ADF)]×9.29； grasses NEL=[1.085-(0.012 4×ADF)]×9.29.

1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將試驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為3組，即對(duì)照組(n=3)、SARA組(n=3)、恢復(fù)組(n=3)。對(duì)照組從試驗(yàn)開(kāi)始至屠宰一直飼喂基礎(chǔ)飼糧(NFC/NDF=1.40)，SARA組和恢復(fù)組通過(guò)逐漸遞增精料(NFC/NDF依次為1.40、1.79、2.31、3.23)的方式誘導(dǎo)奶山羊發(fā)生SARA，每個(gè)NFC/NDF飼糧持續(xù)飼喂15 d，共誘導(dǎo)60 d，SARA組和恢復(fù)組奶山羊SARA誘導(dǎo)成功后，SARA組奶山羊進(jìn)行屠宰，恢復(fù)組奶山羊繼續(xù)自由采食青干草30 d，使其逐漸恢復(fù)。對(duì)照組奶山羊分別在飼養(yǎng)30、60(與SARA組3只同時(shí))和90 d(與恢復(fù)組3只同時(shí))各屠宰1只。采用動(dòng)態(tài)pH連續(xù)監(jiān)測(cè)記錄系統(tǒng)對(duì)瘤胃液pH進(jìn)行24 h連續(xù)監(jiān)測(cè)，以瘤胃液pH作為判定SARA發(fā)生的主要參數(shù)，根據(jù)Ramanzin等[13]、Penner等[6]和Penner等[14]研究結(jié)果，當(dāng)瘤胃液pH連續(xù)24 h內(nèi)在5.5～5.2持續(xù)時(shí)間達(dá)3 h以上即視為SARA模型成功建立。

1.4檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1瘤胃上皮組織的采集與處理

對(duì)照組、SARA組和恢復(fù)組奶山羊宰殺前禁食12 h，宰殺后立即取瘤胃腹部盲囊處組織，經(jīng)無(wú)菌生理鹽水沖洗干凈后，用吸水紙吸干組織塊表面水分。取上述組織塊2 cm×2 cm置于4%多聚甲醛中固定，用于光學(xué)顯微鏡的觀(guān)察；取瘤胃腹囊處乳頭將其切成1 mm×1 mm×1 mm組織塊若干置于2.5%戊二醛中固定，用于透射電子顯微鏡的觀(guān)察；同時(shí)取4塊1 cm×1 cm瘤胃腹囊上皮組織用緩沖溶液沖洗干凈，迅速放入已充混合氣體(95%O2、5%CO2)的保溫瓶中用于尤斯灌流系統(tǒng)(Ussing chamber)分析。

1.4.2瘤胃上皮組織形態(tài)結(jié)構(gòu)檢測(cè)

取瘤胃腹部盲囊處組織塊2 cm×2 cm置于4%多聚甲醛中至少固定48 h，按照常規(guī)方法制作石蠟切片，在光學(xué)顯微鏡觀(guān)察下瘤胃上皮形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)。取1 mm×1 mm×1 mm組織塊置于2.5%戊二醛中固定24 h，按照透射電子顯微鏡的步驟制樣，在透射電子顯微鏡下觀(guān)察瘤胃上皮超微結(jié)構(gòu)。

1.4.3瘤胃上皮通透性測(cè)定

將采集的新鮮瘤胃腹囊上皮組織，于冰浴板上迅速剝離肌層，放于固定環(huán)上，插入到Ussing灌流室兩半室中央，分別接通電壓電極和電流電極。在Ussing chamber中，包括4組單個(gè)獨(dú)立Ussing灌流室，在每個(gè)半室中加入5 mL的緩沖溶液(已預(yù)熱)，通入混合氣體，連接電腦后平衡大約20 min，待曲線(xiàn)平緩穩(wěn)定后，供測(cè)定短路電流(short-circuit,Isc)、組織導(dǎo)電性(tissue conductance,Gt)和跨膜電位差(potential difference，PD)。曲線(xiàn)平緩穩(wěn)定后向黏膜側(cè)半室內(nèi)加入辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)，使其在半室內(nèi)濃度為2 μmol/L，每隔20 min在漿膜層半室內(nèi)取200 μL緩沖液裝入已經(jīng)準(zhǔn)備好的離心管中，于-20 ℃保存用于測(cè)定HRP濃度。Ussing chamber緩沖溶液的配制參照文獻(xiàn)[15]。

HRP濃度測(cè)定相關(guān)溶液配制：1)KH2PO4-Na2HPO4緩沖液，稱(chēng)量KH2PO427.2 g和Na2HPO428.39 g，用1 000 mL雙蒸水溶解，終濃度為0.2 mol/L。2)四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液，稱(chēng)量TMB 0.096 2 g，用50 mL無(wú)水乙醇溶解，用水定容至100 mL，終濃度為4 mmol/L。3)H2O2，10 μL 30%H2O2與7 990 μL水充分混合，終濃度為0.01 mol/L。

HRP濃度的測(cè)定：根據(jù)Klevenhusen等[7]和王彤等[16]的2種方法相結(jié)合，在15 mL離心管中加入已配制好的KH2PO4-Na2HPO4緩沖液2 mL、0.25 mL的TMB溶液和0.2 mL的H2O2，100 μL含HRP的樣品，再加水定容至5 mL，使其充分混勻，在30 ℃恒溫水浴中反應(yīng)1 h，再加蒸餾水定容至10 mL，使反應(yīng)終止。取200 μL配制好的溶液加入96孔板中，以尤斯灌流緩沖液代替含HRP樣品作為空白參比，酶標(biāo)儀在380 nm處測(cè)定吸光度值(A),根據(jù)以下回歸曲線(xiàn)方程計(jì)算出HRP濃度(CHRP)：

A=0.009 7CHRP(μg/L)-0.001 5(R=0.997 2)。

根據(jù)HRP濃度及尤斯灌流系統(tǒng)試驗(yàn)時(shí)間計(jì)算HRP從瘤胃上皮漿膜側(cè)向黏膜測(cè)的流速。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)經(jīng)Excel整理后，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANONA)，并進(jìn)行Duncan氏法多重比較檢驗(yàn)差異顯著性，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。

2　結(jié)果與分析

2.1瘤胃液pH變化

由表2可知，在誘導(dǎo)奶山羊發(fā)生SARA的過(guò)程中隨著飼糧NFC/NDF的增加，瘤胃液pH平均值由6.20降低至5.76，最小值由5.87降低至5.50，最大值由6.59降低至5.98(P<0.05)，整體呈下降趨勢(shì)，瘤胃液pH低于5.5和5.8的時(shí)間由0和0.5 h/d延長(zhǎng)至3.83和11.33 h/d(P<0.05)，瘤胃液pH低于5.5和5.8的曲線(xiàn)面積由0和0.09增加至1.73和3.33。由以上數(shù)據(jù)可知SARA模型建立成功。

表2　奶山羊在誘導(dǎo)SARA的過(guò)程中瘤胃液pH的變化

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同或無(wú)小寫(xiě)字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same row， values with the same or no small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2SARA對(duì)瘤胃上皮組織形態(tài)的影響

2.2.1SARA對(duì)瘤胃上皮形態(tài)學(xué)的影響

由表3和圖1可知，瘤胃上皮總厚度對(duì)照組高于SARA組(P>0.05)，對(duì)照組和SARA組顯著高于恢復(fù)組(P<0.05)。瘤胃上皮棘突層厚度3組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)，對(duì)照組最高，恢復(fù)組最低。瘤胃上皮顆粒層厚度對(duì)照組顯著高于SARA組和恢復(fù)組(P<0.05)，恢復(fù)組高于SARA組，但差異不顯著(P>0.05)。瘤胃上皮角質(zhì)層厚度SARA組顯著高于對(duì)照組和恢復(fù)組(P<0.05)，對(duì)照組顯著高于恢復(fù)組(P<0.05)。

表3　SARA對(duì)奶山羊瘤胃上皮各層厚度的影響

圖1　SARA對(duì)奶山羊瘤胃上皮乳頭形態(tài)學(xué)的影響

2.2.2SARA對(duì)瘤胃上皮超微結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)照組的瘤胃上皮細(xì)胞的細(xì)胞器正常(圖2-A、圖2-B)，完整的緊密連接結(jié)構(gòu)數(shù)量較多(圖2-C)。SARA組的瘤胃上皮細(xì)胞的界限模糊，棘突層細(xì)胞線(xiàn)粒體出現(xiàn)降解(圖2-D)，并出現(xiàn)空泡(圖2-E)，緊密連接結(jié)構(gòu)被破壞，結(jié)構(gòu)松散并出現(xiàn)降解(圖2-F)?；謴?fù)組的瘤胃上皮部分區(qū)域緊密連接結(jié)構(gòu)數(shù)量較SARA組和對(duì)照組多(圖2-G、圖2-H)，但是仍有損傷較嚴(yán)重的部位沒(méi)有恢復(fù)(圖2-I)，且細(xì)胞間有空洞出現(xiàn)。

2.3SARA對(duì)瘤胃上皮通透性的影響

由表4可知，瘤胃上皮Isc和Gt SARA組顯著高于對(duì)照組(P<0.05),略高于恢復(fù)組，但差異不顯著(P>0.05)；PD SARA組顯著低于對(duì)照組(P<0.05),也低于恢復(fù)組，但差異不顯著(P>0.05)。與對(duì)照組相比，SARA組和恢復(fù)組的瘤胃上皮Isc分別提高了157%和128%，Gt分別提高了24%和20%，PD分別降低了53%和38%；與恢復(fù)組相比，SARA組的瘤胃上皮Isc和Gt分別提高了13%和3%，PD則降低了25%。結(jié)果提示，SARA對(duì)瘤胃上皮電生理參數(shù)產(chǎn)生了顯著影響，使瘤胃上皮通透性增大，且恢復(fù)組仍保持較高的通透性。

由圖3可知，瘤胃上皮HRP流速對(duì)照組顯著低于SARA組和恢復(fù)組(P<0.05)，恢復(fù)組低于SARA組，但差異不顯著(P>0.05)。與對(duì)照組相比，HRP流速SARA組和恢復(fù)組分別提高了73%和68%。

圖2　SARA對(duì)奶山羊瘤胃上皮超微結(jié)構(gòu)的影響

項(xiàng)目Items對(duì)照組ControlgroupSARA組SARAgroup恢復(fù)組Recoverygroup短路電流Isc0．47±0．03b1．21±0．48a1．07±0．20a組織導(dǎo)電性Gt2．84±0．24b3．51±1．18a3．40±0．81a跨膜電位差PD1．37±0．48a0．64±0．15b0．85±0．04b

數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

Data columns with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

圖3SARA對(duì)奶山羊瘤胃上皮HRP流速的影響

Fig.3Effects of SARA on HRP flux rate of rumen epithelium in dairy goats

3　討　論

3.1SARA對(duì)瘤胃上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

瘤胃上皮由黏膜層到漿膜層分為角質(zhì)層、顆粒層、棘狀層及基底層4層細(xì)胞層。因此，與腸單層上皮相比，瘤胃內(nèi)毒素和細(xì)菌不容易通過(guò)瘤胃上皮進(jìn)入漿膜層及外周血液，而且完整的瘤胃上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)是保持正常瘤胃上皮屏障功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，瘤胃上皮角質(zhì)層和顆粒層細(xì)胞等形成的屏障能夠?qū)⒘鑫竷?nèi)的有害物質(zhì)隔離出來(lái)避免對(duì)機(jī)體的傷害。瘤胃上皮的完整性受到多種因素影響，飼糧精粗比是主要因素之一，精粗比太高會(huì)導(dǎo)致乳頭角質(zhì)化不全，形態(tài)異常[17-18]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SARA引起瘤胃上皮形態(tài)的顯著性變化，表現(xiàn)為SARA降低了瘤胃上皮總厚度和棘突層厚度，顯著降低了顆粒層厚度，但使角質(zhì)層厚度顯著增加。這與Steele等[5]高谷物飼糧顯著降低了瘤胃上皮總厚度、顆粒層厚度和棘突層厚度的試驗(yàn)結(jié)果相一致。但鄔宇航等[9]研究表明，瘤胃上皮角質(zhì)層厚度恢復(fù)組顯著高于SARA組，卻顯著低于對(duì)照組，與本試驗(yàn)結(jié)果不相符，產(chǎn)生差異的原因可能在于取樣部位不同以及SARA嚴(yán)重程度不同，鄔宇航等[9]研究中瘤胃液pH在5.5～5.2每日持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)7.58 h以上，而本試驗(yàn)瘤胃液pH在5.5～5.2波動(dòng)時(shí)間僅3.83 h，pH在5.5～5.2持續(xù)時(shí)間不同，SARA嚴(yán)重程度也不同。但鄔宇航等[9]和本試驗(yàn)結(jié)果均發(fā)現(xiàn)，瘤胃上皮角質(zhì)層厚度恢復(fù)組顯著低于對(duì)照組，這表明SARA對(duì)瘤胃上皮的形態(tài)產(chǎn)生了長(zhǎng)期影響作用。同時(shí)本試驗(yàn)超微結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，SARA組瘤胃上皮緊密連接結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞間隙增大，線(xiàn)粒體出現(xiàn)降解，棘突層出現(xiàn)氣泡，上皮細(xì)胞界限模糊，而且恢復(fù)組損傷較為嚴(yán)重的部位并未完全恢復(fù)。以上結(jié)果提示，SARA破壞了瘤胃上皮的形態(tài)結(jié)構(gòu)，削弱了瘤胃上皮的屏障功能，且對(duì)瘤胃上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響具有長(zhǎng)期性。

3.2SARA對(duì)瘤胃上皮通透性的影響

瘤胃上皮通透性增高是反映早期瘤胃上皮屏障損傷的重要標(biāo)志。研究Ussing chamber系統(tǒng)中的電生理指標(biāo)可反映瘤胃上皮組織的通透性，Isc主要反映離子通過(guò)上皮的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，Gt反映上皮細(xì)胞對(duì)離子的通透性，PD主要說(shuō)明瘤胃上皮組織的活性，這些電生理指標(biāo)體現(xiàn)了上皮組織的屏障通透性[19]。在Ussing chamber技術(shù)中利用同位素標(biāo)記或大分子標(biāo)記物通過(guò)胃腸道上皮的比例來(lái)檢測(cè)其上皮通透性已成為比較常用且非常重要的手段[20]，常用的標(biāo)記物如HRP、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)、3H-甘露醇[6-7]。隨著Ussing chamber技術(shù)的不斷應(yīng)用和改良，這一技術(shù)已成為目前胃腸道屏障功能研究的金標(biāo)準(zhǔn)。

胃腸道上皮通透性通常是指黏膜上皮比較容易被一些物質(zhì)分子以簡(jiǎn)單擴(kuò)散的方式通過(guò)的特性，這一特性的改變能夠反映上皮的損傷程度，是檢測(cè)胃腸道屏障受損的重要指標(biāo)。若黏膜通透性增加則說(shuō)明黏膜完整性被破壞，其屏障功能受損。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SARA組和恢復(fù)組瘤胃上皮Isc與對(duì)照組相比顯著增加了，分別提高了157%和128%；SARA組和恢復(fù)組瘤胃上皮Gt與對(duì)照組相比顯著增加了，分別提高了24%和20%；PD顯著降低了，分別降低了53%和38%；瘤胃上皮HRP流速對(duì)照組顯著低于SARA組和恢復(fù)組，恢復(fù)組低于SARA組，但差異不顯著；與對(duì)照組相比，HRP流速SARA組和恢復(fù)組分別提高了73%和68%。Penner等[6]利用Ussing chamber系統(tǒng)研究了輕微的SARA在短期內(nèi)對(duì)瘤胃上皮屏障功能的影響，結(jié)果表明Gt升高。Klevenhusen等[7]利用Ussing chamber系統(tǒng)研究了高谷物飼糧對(duì)山羊瘤胃上皮通透性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高谷物飼糧組瘤胃上皮Isc、Gt和HRP濃度與對(duì)照組相比均顯著提高；Aschenbach等[21]利用Ussing chamber系統(tǒng)在體外條件下研究發(fā)現(xiàn)，pH為5.1時(shí)瘤胃上皮Gt增加，Isc降低；Penner等[6]利用直接灌注葡萄糖的方式誘導(dǎo)綿羊發(fā)生SARA，結(jié)果顯示瘤胃上皮Gt和3H-甘露醇標(biāo)記的同位素從瘤胃上皮漿膜側(cè)向黏膜測(cè)的流速增加，Isc降低，瘤胃上皮通透性隨著酸度的增加而增加。本試驗(yàn)結(jié)果與上述結(jié)果部分一致，說(shuō)明了SARA能破壞瘤胃上皮的完整性，使瘤胃上皮通透性增加，瘤胃上皮的屏障功能受損。

4　結(jié)　論

SARA破壞了奶山羊瘤胃上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性，使瘤胃上皮通透性增加，導(dǎo)致瘤胃上皮屏障功能長(zhǎng)期受損。

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(責(zé)任編輯王智航)

Effects of Subacute Ruminal Acidosis on Ruminal Epithelial Morphology and Permeability in Dairy Goats

CHENG Meng1YANG Shuqing2GAO Min3XIE Tianyu4SUN Yanyong1HU Honglian3*

(1. College of Animal Sciences, Inner Mongolia Agricultural University, Huhhot 010018, China; 2. Jiangsu Mengbili Biological Technology Co., Ltd.， Changzhou 213100，China； 3. Institute of Animal Nutrition and Feed， Inner Mongolia Academy of Agricultural & Animal Husbandry Sciences， Hohhot 010031,China； 4. Inner Mongolia Holy Priest High-Tech Animal Husbandry Co., Ltd.,Hohhot 010018, China)

The objective of this experiment was to study the effects of subacute ruminal acidosis (SARA) on ruminal epithelial morphology and permeability in dairy goats. Nine healthy lactating Saanen dairy goats with similar body weight were randomly divided into three groups (control group, SARA group and recovery group,n=3). Dairy goats in control group were fed a basal diet [non-fibre carbohydrates/neutral detergent fibre (none fiber carbon NFC/NDF)=1.40], those in SARA group and recovery group were fed experimental diets with different NFC/NDFs (1.40, 1.79, 2.31 and 3.23 in order, each for 15 days), which gradually induced SARA， and those in recovery group wereadlibitumfed green hay for 30 days after SARA. One of 3 goats in control group were slaughtered on days 30, 60 (together with 3 goats in SARA group) and 90 d of feeding (together with 3 goats in recovery group), respectively. Samples of the ruminal epithelium from ventral sac were collected to make paraffin section, observe under transmission electron microscope and do Ussing chamber analysis. The results showed as follows: 1) the results of histological slice revealed that the thickness of ruminal epithelial stratum corneum in SARA group was significantly higher than that in control and recovery groups (P<0.05), and recovery group was significantly lower than control group (P<0.05); the thickness of granulosum stratum in control group was significantly higher than that in SARA and recovery groups (P<0.05)， but there was no significant difference between SARA group and recovery group (P>0.05); the thickness of spinosum stratum in three groups had no significant difference (P>0.05); the total thickness of the rumen epithelium in recovery group was significantly lower than that in control and SARA group (P<0.05)， but there was no significant difference between control and SARA groups (P>0.05). The results of transmission electron microscope showed rumen epithelial tight junction structure in SARA group was destroyed and intercellular space was increased，and spinosum stratum cell mitochondria was degraded and showed vacuoles. 2) Compared with control group, the short-circuit， tissue conductance and the flux rate of horseradish peroxidase of rumen epithelium in SARA and recovery groups were significantly increased (P<0.05), and potential difference was significantly decreased (P<0.05). In conclusion, SARA impairs the integrity of ruminal epithelial morphological structure in dairy goats， and causes an increase in ruminal epithelial permeability, which results in rumen epithelial barrier function long-term damage.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(10)：3311-3319]

subacute ruminal acidosis; rumen epithelium; morphology; ultramicrostructure； permeability

, professor, E-mail： honglianhu2010@163.com

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.10.035

2016-04-12

國(guó)家自然科學(xué)基金(31472124)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(奶牛)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金(CARS-37)

程萌(1990—),女,吉林德惠人，碩士研究生，研究方向?yàn)榉雌c動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控技術(shù)及其應(yīng)用。E-mail： 2979949429@qq.com

胡紅蓮，研究員，E-mail： honglianhu2010@163.com

S826

A

1006-267X(2016)10-3311-09